跨膜蛋白AgrC_(TM6-7C)分离纯化方法的优化北大核心CSCD

旨在通过优化AgrC_(TM6-7C)蛋白的纯化过程,获得高纯度的目的蛋白,为后续研究提供材料。详细探讨了金属离子螯合层析缓冲液中咪唑浓度、离子交换层析缓冲液的pH值对AgrC_(TM6-7C)蛋白纯化效果的影响,并研究了β-巯基乙醇对AgrC_(TM6-7C)蛋白聚集及其激酶活性的影响。经过优化后,在不影响AgrC_(TM6-7C)蛋白激酶活性的前提下,AgrC_(TM6-7C)蛋白在浓度和纯度上均有明显提高,纯度可达98%以上,产量可达15 mg/L。     

重组人脑利钠肽的纯化与活性测定

目的:建立重组人脑利钠肽(BNP)的纯化方法,筛选疏水作用层析纯化介质并优化纯化条件。方法:根据带有6×His标签的Dsb A-BNP融合蛋白的特性,采用金属螯合亲和层析(IMAC)、凝血酶酶切去除His-Dsb A、阳离子交换层析等步骤进行粗纯;利用BNP的疏水性,分别选用不同疏水性质的介质Hi Trap Butyl FF、Hi Trap Phenyl(HS)及Source 15进行精纯;用SDS-PAGE和HPLC检测纯化获得的BNP的含量及纯度;用细胞法对BNP进行活性检测。结果:经IMAC、酶切去除标签蛋白及阳离子交换层析纯化后,获得纯度为60%的BNP;Hi Trap Butyl FF、Hi Trap Phenyl(HS)等疏水介质与BNP的吸附效果不佳,而经Source 15反相层析后,BNP的纯度可达98.98%,活性检测与对照品一致。结论:利用Source 15反相层析可获得高纯度、活性优的BNP原液,可满足后期制剂处方实验的要求,为后续研究奠定了基础。     

人胱抑素C参考物质制备方法的建立

[目的]建立重组人胱抑素C(cystatin C)表达体系,获得可溶、稳定、高纯度的胱抑素C。[方法]密码子优化并人工合成人胱抑素C编码序列,与麦芽糖结合蛋白(MBP)分别克隆至PRSF-Duet载体以构建重组人p MBP-CYSC PRSF表达质粒。使用大肠杆菌E. coli BL21(DE3) p Lys S对其进行诱导表达,SDS-PAGE鉴定蛋白纯度和分子量,全自动生化仪测定纯化蛋白浓度及稳定性。[结果]成功构建重组人p MBP-CYSC PRSF表达质粒并诱导表达,胱抑素C蛋白浓度可达500 mg/L,纯度可达90%,在4℃和-20℃储存条件下监测64 w,胱抑素C蛋浓度稳定,均在允许相对偏差5%以内。[结论]通过密码子优化,成功获得浓度为500 mg/L、纯度为90%、存储稳定性至少达到64 w的胱抑素C蛋白,可充分满足该产品诊断试剂制备的需求。     

桦褶孔菌多糖的分离纯化及清除自由基活性

利用水提醇沉法对桦褶孔菌Lenzites betulina粗多糖HZKJc进行提取,随后经Sevage法和酶法联合脱蛋白,再经DEAE‐Sephadex A‐25,G‐100柱层析纯化后得到多糖纯品HZKJv。通过高效液相色谱(HPLC)测定上述纯化多糖的纯度和相对分子量分布;经纸层析(PC)、气相色谱(GC)、红外光谱(IR)进行单糖组成分析;并研究其清除自由基活性。分离纯化后得到的HZKJv为纯多糖,相对分子质量约为11 687。当HZKJv溶液浓度为3.0mg/m L时,其DPPH自由基清除率可达82%;浓度为2.0mg/m L时,对?OH自由基的清除率可达85%。表明HZKJv对?OH与DPPH自由基存在很好的清除作用。     

发菜藻蓝蛋白分离纯化的研究

以发菜为材料,比较了提取液类型和饱和硫酸铵浓度对藻蓝蛋白提取的影响,并对藻蓝蛋白的提取程序和部分特性进行了研究。结果表明:50 mmol/L KP缓冲液(pH值7.2)是合适的提取液,体积分数为40%~50%饱和硫酸铵盐析效果优于其它浓度。经过DEAE-Toyopeal 650 S离子交换层析和SuperdexTM200凝胶过滤层析后,藻蓝蛋白纯度达6.2,最大吸收峰位于615 nm,荧光发射峰位于649 nm,由α和β2个亚基组成,其分子质量分别为18 051.17和19 142.27 Da。因此,发菜藻蓝蛋白分离纯化较为理想的程序为:藻粉→50 mmol/L KP缓冲液(pH值7.2)浸泡→French pressure(1 500 kg/cm2)破碎细胞→40%~50%饱和硫酸铵盐析→DEAE-Toyopeal 650 S离子交换层析→SuperdexTM200凝胶过滤层析→较纯的藻蓝蛋白。     

离子交换层析结合反向色谱纯化聚二氨基丙酸

ε-聚赖氨酸生产菌株Streptomyces albulus PD-1可合成一种新型非蛋白质氨基酸均聚物聚二氨基丙酸,采用离子交换层析和反向色谱,对聚二氨基丙酸的分离纯化进行研究。离子交换层析柱选用DEAE-Sepharose Fast Flow填料,50 mmol/L磷酸盐缓冲液(p H 7.5)平衡上样,含0.5 mol/L Na Cl的磷酸盐缓冲液(p H 7.5)洗脱,收集洗脱液用分子筛Sephadex G-25除去磷酸盐缓冲液。然后用C18反相色谱进一步纯化,流动相为V(甲醇)/V(0.1%磷酸)=5/95。经过离子交换层析和反向色谱,纯化得到聚二氨基丙酸纯品,回收率为39.8%,样品纯度达98.4%,为后续的聚二氨基丙酸的深入研究奠定基础。     

疏水层析分离正确折叠与错误折叠的复合干扰素

采用疏水层析纯化重组复合干扰素,成功去除了复性过程中产生的错误折叠体、聚集体及杂蛋白,并考察了配基类型、盐浓度、pH值和流速对疏水层析纯化效果的影响,结果表明采用ButylSepharose 4FastFlow、硫酸铵初始浓度0.8mol/L、缓冲液pH值8.3、线流速为90cm h时疏水层析纯化效果最佳,最终目标蛋白反相高效液相色谱检测纯度达到99.6% ,还原及非还原型SDS PAGE电泳均呈单一条带,其比活为2.3×10⁹IU/mg,回收率为36.7%。     

辛酸沉淀结合阴离子交换层析纯化马IgG的研究

目的以辛酸沉淀结合离子交换层析纯化破伤风抗毒素马免疫血浆,获得高质量的马IgG,为抗毒素F(ab')2的制备奠定基础。方法通过对辛酸沉淀马血浆过程中的pH、辛酸浓度以及血浆稀释倍数的实验设计(DoE),研究不同条件对IgG纯度、效价、比活性、浊度以及过滤速度的影响,确定各工艺参数的可操作区间,并结合Capto DEAE阴离子交换层析以流穿模式进一步纯化IgG。结果马血浆经一步辛酸沉淀获得的IgG纯度(SDSPAGE)大于92%、分子排阻色谱(SEC)纯度大于95%,比活性较血浆提高2.14±0.29倍;辛酸沉淀后的IgG样品经阴离子交换层析,可有效去除聚合体以及小分子杂质,将纯度提高至95%(SDS-PAGE)和98%(SEC)。结论马血浆经辛酸沉淀和阴离子交换层析可获得高纯度、高比活的IgG。     

牦牛肝蛋白分离纯化及其抗氧化活性研究(英文)

新鲜牦牛肝匀浆、磷酸缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀,并采用响应面法对提取条件进行优化。在最佳提取条件下提取的粗蛋白经DEAE-52离子交换层析和Sephadex G-200凝胶柱洗脱得到7种不同的蛋白。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对各蛋白的分析结果,各蛋白均成单一条带表明纯化效果较好,其分子量分布在97.2 KD-116 KD之间。采用化学发光法对其在体外抗氧化活性研究,主要包括超氧阴离子自由基、羟自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基的清除实验,结果表明几种蛋白均具有抗氧化作用,尤其蛋白5和蛋白1作用较为突出,在250 mg/L浓度时,对超氧阴离子的清除率为82.91%和72.92%。上述结果为牦牛肝作为抗氧化保健食品或功能食品的研究和开发提供了依据。     

基因重组Echistatin发酵工艺的优化

目的:利用基因工程方法对一种蛇毒锯鳞蝰素蛋白的发酵纯化工艺进行优化,以提高目的蛋白的产量和纯度。方法:对工程菌进行发酵培养并诱导表达,研究不同的培养基、不同补料方式、溶解氧浓度、培养和诱导时间对工程菌产量和目的蛋白表达量的影响,利用几丁质亲和层析纯化Ecs融合蛋白,通过合适温度和pH裂解融合蛋白得到Ecs纯品,并鉴定和检测Ecs活性。结果:经过高密度发酵优化后,菌体湿重可达110g/L,目的蛋白表达量约占总蛋白的40%;亲和层析纯化后,得到Ecs单体,得率为68mg/L发酵液。生物学活性分析显示,重组Ecs能有效抑制血小板的聚集,其活性与天然Ecs相似。结论:通过发酵和纯化工艺优化,大大提高了目的蛋白产量,为进一步规模化研究和生产奠定了基础。     

坛紫菜藻红蛋白的规模化制备

为了优化坛紫菜粗提工艺以减轻纯化的压力,研究了我国主要经济红藻之一坛紫菜藻红蛋白大规模制备方法。实验采用“溶胀+组织捣碎”法破碎坛紫菜叶状体细胞,对比了多次硫酸铵梯度盐析对破碎液中藻红蛋白的影响,并进一步用羟基磷灰石层析制备藻红蛋白,最后对所得蛋白做了光谱和电泳鉴定。结果表明,经过4次盐析,藻红蛋白吸收光谱纯度达到0.9 (A564/A280),每次的最佳盐析浓度分别为15％、50％、10％和40％;7 kg阴干紫菜经过4次盐析和1次羟基磷灰石层析后可获得507.82 mg藻红蛋白 (A564/A280＞     

条斑紫菜蛋白酶解产物中α-葡萄糖苷酶抑制剂纯化及特性

以α-葡萄糖苷酶抑制活性为指标,优选出1398中性蛋白酶、碱性蛋白酶和氨肽酶在一定条件下复配酶解条斑紫菜蛋白制备α-葡萄糖苷酶抑制剂。酶解液加入乙醇至终浓度为60%以沉淀去除多糖,上清液为α-葡萄糖苷酶抑制剂粗品。该粗品利用SP Sepharose High Performance阳离子交换层析、Sephadex G-10凝胶层析和Mono Q阴离子交换层析进行分离纯化,获得一种肽类α-葡萄糖苷酶抑制剂(LGI)。LGI经反向高效液相层析测定纯度为62.4%,基本特性分析显示其具较好的温度和pH稳定性,对α-葡萄糖苷酶半抑制浓度IC50值为97.36μg/mL,属于一种非竞争性抑制剂。     

金黄色葡萄球菌arl双组分信号转导系统受体蛋白ArlS_(CA)的表达、纯化及活性研究

金黄色葡萄球菌是一类重要的病原菌,其毒力因子的表达及分泌过程由多种双组分信号转导系统(two component signal transduction system,TCSTS)共同调控,其中ArlRS双组分信号转导系统与细菌的生长和分裂密切相关。ArlRS双组份系统的信号传递通过组氨酸激酶ArlS磷酸化实现,ArlS的胞内域被认为是调控毒力因子表达的重要功能域,以ArlS蛋白的胞内域部分即ArlS_(CA)为目标蛋白进行相关的活性研究。首先,构建pProEX-HTa-arls和pProEX-HTa-arlr重组质粒,对目的蛋白进行诱导表达。其次,利用金属离子螯合层析、离子交换层析以及凝胶过滤层析方法对目的蛋白进行分离纯化,纯化后的ArlR蛋白纯度可达98%,产量约为25mg/L;纯化后的ArlS蛋白纯度可达90%,产量约为15mg/L。圆二色谱检测结果显示纯化后的目的蛋白有完整的二级结构,体外磷酸化结果显示,ArlS蛋白具有激酶活性,自磷酸化后可以将磷酸基团转移给反应调控蛋白ArlR。最后,利用定点突变的方法,构建了418位和420位氨基酸残基突变的表达载体pProEX-HTa-ArlS_(CAG418A)和pProEX-HTa-ArlS_(CAG420A)。ArlS_(CAG418A)和ArlS_(CAG420A)蛋白不具有激酶活性,说明418位和420位氨基酸残基在ArlS蛋白的自磷酸过程中起着关键作用。     

新型抗菌肽Perinerin在大肠杆菌中的融合表达

为了获得新型抗菌肽 perinerin在大肠杆菌中的高效和可溶表达,实验首先采用SOE 法(重叠 PCR 法)获得的 perinerin 基因序列,对目的基因密码子优化,然后将其连接到 pET32a 载体中获得重组表达载体 pET32a-PEN,通过改变诱导时间和温度、诱导剂 IPTG 浓度以及诱变工程菌株等条件和方法,观察重组蛋白的表达效果,并运用金属螯合层析对融合蛋白进行纯化.SDS-PAGE 显示重组菌诱导后表达的融合蛋白分子量约为 26kD,采用变异重组菌株 MUT 3诱导表达,在 2×YT 培养基培养条件下,30 ℃诱导4 h 可获得高效表达的 perinerin 融合蛋白,其表达量约占菌体总蛋白的 50 % 左右,重组蛋白主要以可溶性表达形式存在,可溶性产物最高可达重组蛋白总表达量的 60 %.融合蛋白运用金属螯合层析一步纯化,纯度可达 90 % 以上.     

眼镜蛇毒细胞毒素-4N的分离纯化及其对HSC-T6细胞的作用

为了得到高纯度眼镜蛇毒细胞毒素-4N,探索眼镜蛇毒中细胞毒素-4N(cytototxin-4N,CTX-4N)对大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC-T6)的增殖抑制作用。本研究采用DEAE-Sepharose CL-6B阴离子交换柱、Spehadex G-50凝胶层析柱、Macro-prep High S阳离子交换柱结合的方法对眼镜蛇毒蛋白进行分离纯化。在每一步分离纯化过程中,采用CCK-8法检测各蛋白峰组分对HSC-T6细胞的增殖抑制作用活性,收集增殖抑制作用最强的CTX-4N峰。经SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度,Nano-LC-ESI-MS/MS质谱方法鉴定其组分,Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂检测CTX-4N对肝星状细胞(HSC-T6)的增殖抑制作用,从而确定其药理作用。经DEAE-Sepharose CL-6B阴离子交换柱、Spehadex G-50凝胶层析柱、Macro-prep High S阳离子交换柱分离纯化后得到一个电泳纯度的蛋白,蛋白质谱鉴定为CTX-4N,分子量约为9.605 k D。不同浓度的CTX-4N作用HSC-T6细胞24 h后,随着其浓度的增大对HSC-T6细胞增殖抑制作用越强,呈剂量-效应关系,IC_(50)为(12.836±0.045)μg/m L。因此,本研究建立一种眼镜蛇毒细胞毒素-4N的分离纯化方法,并确定了其对HSC-T6细胞的增殖抑制的药理作用随浓度的增加而增强,为进一步研究其药理作用提供一定的理论依据。     

氧化还原对NDPK-A及突变体磷酸转移酶活性的影响

对核苷二磷酸激酶A(NDPK-A)及其4种半胱氨酸突变体进行诱导表达及纯化,测定它们在氧化还原条件及正常条件下的磷酸转移酶活性,研究氧化还原及二硫键异构对NDPK-A及突变体活性的影响。将实验室之前构建成功的野生型NDPK-A(PBV-NDPK-A)及4种突变型NDPK-A基因(PBV-NDPK-A C4S,PBV-NDPK-A C109S,PBV-NDPK-A C145S,PBV-NDPK-A C4/109/145S)在大肠杆菌中高效表达;以DEAE-sepharose Fast Flow离子交换层析与Cibacron Blue 3GA Sepharose CL-4B亲和层析技术纯化目的蛋白;HPLC法测定比较野生型NDPK-A及突变体在氧化还原和正常环境下磷酸转移酶活性。结果显示,NDPK-A及突变体在大肠杆菌中高效表达;经纯化分别获得了均一的NDPK-A蛋白及突变体蛋白,纯度均达到98%;在还原环境下NDPK-A及突变体的磷酸转移酶活性均高于正常环境下的活性,但是在氧化环境下的磷酸转移酶活性明显低于正常环境下。氧化还原环境对NDPK-A结构异构及磷酸转移酶活性有一定的影响,提示氧化还原环境可能调控NDPK-A二硫键的形成,影响蛋白的聚集状态,从而影响蛋白的磷酸转移酶活性,并且NDPK-A结构中可能有更为复杂的氧化还原调控酶活性机制。     

芽孢杆菌β-折叠桶植酸酶的原核可溶性表达优化及包涵体复性研究

目的:来源于芽孢杆菌的β-折叠桶植酸酶基因PhyH,截去N端120个碱基编码的40个氨基酸后,成功构建了原核表达体系,通过两种方法分别得到有活性的目的蛋白PhyHT,并通过进一步纯化提高目的蛋白的纯度.方法:通过分子伴侣共表达系统提高目的蛋白的可溶性表达,并通过包涵体复性研究,从包涵体中制备出有活性的目的蛋白.结果:(1)目的蛋白PhyHT主要以包涵体形式存在于沉淀中;(2)通过优化表达条件,降低温度和诱导剂浓度均不能明显改善包涵体问题,通过构建分子伴侣共表达系统(即pG-KJE8、pGro7、pKJE7和pTfl6 4种分子伴侣质粒分别与重组表达质粒pET28b-PhyHT共表达),筛选能提高目的蛋白可溶性表达的分子伴侣质粒;(3)包涵体经过复性和进一步的纯化,得到了高纯度的有生物活性的目的蛋白.     

榆黄蘑中一种抗病毒蛋白的纯化及其抗TMV和HBV的活性

采用阴离子交换层析和凝胶层析方法从新鲜食用菌榆黄蘑 (Plearotuscitrinopileatus)中进行了抗病毒蛋白的纯化 ,结果获得了一个纯化蛋白YP4 6 4 6 ,经SDS PAGE可确定其分子量为 2 7.4kD。以半叶法在枯斑寄主心叶烟上检测该蛋白对烟草花叶病毒 (TMV)的抑制率 ,发现有较好的抗TMV活性 ,其抑制TMV的中浓度为 0 .2 4 μg/mL。同时以HepG2 .2 .2 .15细胞株为模型 ,对所获得的蛋白进行体外抗乙型肝炎病毒效果的评价。结果表明该蛋白对HBsAg的 5 0 %抑制时的浓度为 0 .0 8μg/mL ,但对HBeAg效果不大     

蓖麻β-半乳糖苷酶的纯化及其基本性质

蓖麻籽黄化苗中存在高活性β-半乳糖苷酶。经硫酸铵分级分离、DEAE-纤维素离子交換层析、Sephadex G-100、CM-Sephadex和DEAE-Sephadex层析纯化。活性收率为6.4％,纯化倍数达107倍。纯化了的酶经聚丙烯酰胺凝胶电泳显示单一蛋白带,SDS-PAGE显示两条蛋白带,其相应分子量分别为3.25×10~4和2.94×10~4。用Sephadex G-200分子筛层析法测得分子量为6.7×10~4。综合上述结果推测该酶是由两个不同的亚基构成。以邻硝基苯酚-β-半乳糖苷为底物测得该酶的表观Km为5.9×10~(-3)mol/L。最适pH和最适温度分别为4.5和50℃。酸碱稳定区域在pH4.6—7.5之间。不同浓度缓冲液以及不同种类缓冲液、不同金属离子对酶活性影响均进行了讨论。     

两步柱色谱法纯化 CHO 表达的重组人β神经生长因子（β-rhNGF）

基因重组技术生产蛋白药物较传统提取生产方式具有诸多优点。本文运用一步离子交换色谱层析（Sepharose Fast Flow）和反相(C4)色谱层析串联纯化了CHO 工程细胞株分泌表达的重组人β 神经生长因子（β-rhNGF）,纯化产物经SDS-PAGE及反相HPLC 分析纯度均达到 95% 以上,生物学活性经 PC12 细胞和鸡胚背根神经节测定均与 Sigma 标准品无差异。产物经两步纯化后的收率达70% 以上,为建立该产品切实可行的工业化纯化工艺提供了依据。