高敏化学发光法测定丙肝病毒抗体的临床性能评价

目的:对新检测系统HISCL-5000高敏化学发光免疫法测定丙肝病毒抗体(HCVAb)进行性能评价。方法:对HCVAb的精密度、血清转化盘、一致率、临床特异性与临床灵敏度、干扰试验测定结果进行分析评价;经抗HCV重组免疫印迹试验(RIBA)对不一致结果进行确认。结果:新检测系统HISCL-5000测定HCVAb的批内CV分别为5.31%、8.21%,批间CV分别为4.33%、7.16%;HISCL使用血清转化盘检测比雅培ARCHITECT提前1周测定出由阴转阳的血清转化,检测窗口期提前1周;与雅培定量试剂的总一致率为99%,与科华ELISA检测弱阳性及弱阴性标本的总一致率为95.3%;临床特异性99.7%、临床灵敏度100.0%均高于雅培i2000及科华ELISA。结论:新检测系统Sysmex HISCL-5000高敏发光全自动免疫分析测定HCVAb灵敏度高、特异性强、简便且窗口期短,适于临床HCV感染的检测。     

NASBA荧光分子信标技术定量检测丙型肝炎病毒

建立NASBA荧光分子信标探针检测技术,并对国家HCV标准品、人工构建HCVRNA野生株及HCV抗体阳性不同人群进行检测。实验结果:该方法检测HCV的灵敏度为103拷贝ml血清,阴性参比品的符合率为100%;检测的线性范围为103拷贝～109拷贝ml血清;精密性(CV值)小于6%,在HCV抗体阳性人群中HCVRNA的检出率在45%～65%之间。结论:该方法在HCVRNA临床定量检测中具有良好的灵敏度、特异性、重复性与实用性。     

低水平乙型肝炎表面抗原的检测及其临床价值评估

我们采用具有世界卫生组织( WHO) 溯源性的标准血清建立浓度标准曲线, 评估微粒子酶免疫分析法(MEIA) 和酶联免疫吸附试验( ELISA) 的检测灵敏度, 并对97 例经确认为低水平乙型肝炎表面抗原( HBsAg)的阳性结果进行检测和比对分析; 同时综合评估低水平HBsAg 患者的临床各项指标, 探究低水平HBsAg 检测的临床意义。根据MEIA、ELISA 的S/CO 值分析, 2 种方法的检测灵敏度分别为0. 095 IU/ml 和0. 378 IU/ml;ELISA 对97 例低水平HBsAg 的检出率仅为45. 4% ( 44 /97) ; 在97 例低水平HBsAg 患者中, HBV DNA≥1 ×103 拷贝/ml 占17. 5% ( 17/97) , 肝功能异常率占38. 1% ( 37 /97) , 其中明确诊断为乙型肝炎相关疾病的19 例患者中, 肝硬化占57. 9% ( 11 /19) 。因此灵敏度高、特异性好的方法有助于低水平HBsAg 的检出, 有利于对这些人群的诊断和治疗。部分低水平HBsAg 患者往往伴随病毒复制及肝功能的慢性损伤, 预后不良, 应引起临床的高度重视和关注。     

抗ANXA1自身抗体ELISA检测方法的建立及应用

[目的]建立检测抗膜联蛋白A1(Annexin A1,ANXA1)自身抗体的ELISA方法,初步探索其临床应用。[方法]设计ANXA1特异性抗原肽并人工合成,用抗原肽制备可检测ANXA1抗体的ELISA板,通过回归方程的建立、精密度的测定和抗干扰能力的验证,建立检测ANXA1抗体的ELISA方法。用该法检测临床乳腺癌及健康对照患者血清中的抗ANXA1自身抗体。[结果]该方法在抗体浓度0.025～0.400μg/mL范围内线性良好,R²=0.994,连续5次批内和批间变异系数%均小于10%,对乳糜标本和溶血标本的检测相对误差均小于10%,用于乳腺癌患者抗ANXA1自身抗体的诊断上,实验组抗ANXA1自身抗体表达显著高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。[结论]建立了抗ANXA1自身抗体检测的ELISA方法,线性范围0.025～0.400μg/mL,变异系数小于10%,对乳糜标本和溶血标本检测的相对误差小于10%,应用于临床初步显示乳腺癌患者血清中抗ANXA1自身抗体高表达。     

多肽抗体检测原发性肝癌血清标志物ELISA方法的建立及应用

血清多肽是癌症诊断信息的重要来源,建立、优化了检测多肽标志物的直接ELISA法,并应用于肝癌血清中的多肽标志物的检测。制备及纯化针对多肽标志物Pep5的单克隆抗体并进行辣根过氧化物酶标记,用其建立检测相应抗原的直接ELISA法。方法线性范围为1.5-20 ng/mL,检测限为1.24 ng/mL;标准品批内及批间CV分别小于3.66%及4.89%,血清样本批内及批间CV分别小于11.69%及18.18%;线性范围内(9、12和15 ng/mL)的回收率分别为98.98%,99.61%和101.58%。应用该方法共检测160例正常血清、104例肝硬化及156例肝癌患者血清,正常组与肝硬化组及肝癌组间差异显著(P<0.001),Pep5诊断肝癌的敏感性和特异性分别为80.8%和96.2%。同时检测94例HCC血清中的AFP和Pep5,AFP检出率为63.8%,Pep5检出率为90.4%,AFP联合Pep5检测时,能将HCC的检出率提高至94.7%。     

抗乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体的研究Ⅱ．抗HBsAg单克隆抗体的实际应用

本文用抗HBs／a McAb腹水用亲和层析法有效地提纯了HBsAg,回收率较高,并进行了CIEP检测临床血清标本,沉淀线清晰,检测灵敏度高于抗HBsAg血清。将抗HBs／a和抗HBs／d二种McAb提纯后制备诊断血球,进行RPHA检测临床血清标本千余例,并经美国Abbott实验室RIA试剂盒验证,表明其阳性检出率与中和试验符合率较国内目前以PcAb制备的诊断血球为优,显示了良好的特异性、灵敏度和准确性。抗HBsAgMcAb可作为新一代的HBsAg检测试剂。     

自制抗人磷脂酶A2受体抗体ELISA试剂盒的临床应用评价

旨在自制能够辅助诊断原发性膜性肾病的抗磷脂酶A2受体(PLA2R)抗体酶联免疫吸附试验(ELISA)定量检测试剂盒;通过包埋HEK293细胞表达的重组抗原、患者血清与抗原反应、酶的催化放大效应测定样本中抗PLA2R IgG滴度,通过临床数据分析、与市售试剂盒的比对,评价该试剂盒的临床应用价值及性能。研究发现自制试剂盒与国外试剂盒检测阳性一致率97.2%,阴性一致率100%;检测限不高于2 RU/mL;准确度的测量相对偏差在±15%区间内;试剂盒线性范围在2–500 RU/mL,线性相关系数r值不低于0.990 0;重复性检测的变异系数(CV)小于15%;于37℃恒温箱放置1周后,2–8℃放置1年后,检测性能无明显改变。结果表明自制试剂盒对血清抗PLA2R抗体检测的敏感性、特异性均与德国欧蒙公司(E150522BD)试剂盒相近,诊断效能高,可用于原发性膜性肾病辅助诊断。     

HILIC-MS/MS技术同时检测蛹虫草中虫草素、虫草酸、腺苷和肌苷含量的方法学

蛹虫草是我国具有极高药用价值的滋补中药材。对蛹虫草成分的含量进行准确的定性定量分析,可为相关产品质量控制、筛选高活性蛹虫草及进一步研究蛹虫草的功效提供技术手段。建立一种灵敏稳定的亲水作用色谱法-串联质谱(HILIC-MS/MS)方法,同时对蛹虫草中虫草素、虫草酸(D-甘露糖醇)、腺苷和肌苷的含量进行测定。研究发现其线性范围分别为0.02～5μg/mL(R~2=0.995 3)、0.2～50μg/mL(R~2=0.999 4)、0.002～0.5μg/mL(R~2=0.997 0)和0.002～0.5μg/mL(R~2=0.995 0)。采用HILIC-MS/MS技术,测定结果精密度小于10.0%,准确度在8.0%左右,具有较好的特异性、灵敏度和重现性。     

纳米磁性颗粒标记的免疫层析法定量检测人乙型肝炎表面抗原

目的:应用纳米磁性颗粒标记的免疫层析法,研制可应用于乙肝表面抗原(HBsAg)快速定量检测的层析试纸条。方法:用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)交联的方法标记纳米磁珠,喷膜仪喷点硝酸纤维膜;根据双抗体夹心法原理建立免疫层析试纸条,对HBsAg特异性抗体捕获的磁信号进行检测,并对磁信号检测结果进行统计学分析和评价。结果:建立了HBsAg纳米磁性免疫层析试纸条,最低限度检测为0.1 ng/mL的HBsAg抗原,检测灵敏度达到了同类产品ELISA分析法的标准,且检测时间控制在5 min内;经检测临床血清标本证实,该方法可根据磁信号定量检测乙肝患者血清中HBsAg的浓度。结论:HBsAg纳米磁性免疫层析方法具有简单快速、灵敏度高的特点,可应用于临床血清样本中HBsAg的检测;该方法为体内极微量抗原抗体的快速检测建立了新模式。     

2种方法在血清β2-微球蛋白检测中的效果对比

目的:探讨散射免疫法和荧光免疫层析法在血清β2-微球蛋白中的检测效果对比观察及精确度。方法:选取2016年10月-2017年8月我院收治的肝肾功能损伤患者88例,对患者分别应用散射免疫法以及荧光免疫层析法进行检测。对比两组方法血清β2-微球蛋白的检测结果、灵敏度、特异性以及精确度。结果:检测结果方面,荧光免疫分析法患者的检测率明显高于散射免疫法,漏检率明显低于散射免疫法(P0.05);荧光免疫层析法的灵敏度、特异性以及诊断符合率明显高于散射免疫法(P0.05);各项指标水平方面,患者血清β2-微球蛋白、肌酐、尿酸以及尿素等指标的水平明显高于正常水平(P0.05);精确度方面,荧光免疫层析法批间、批内的精确度明显高于散射免疫法(P0.05)。结论:对患者应用荧光免疫层析法检测血清β2-微球蛋白,有较高的检测符合率、灵敏度以及准确度,能够满足临床检测过程中的要求,进而有利于患者的诊断和治疗,临床上应当进一步推广应用。     

大鼠疑似泰勒氏病毒荧光定量检测方法的建立

目的建立一种能在临床上快速、准确地检测大鼠疑似泰勒氏病毒(Theiler’s-like virus of rats,TLV)的方法,采用TaqMan探针荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)技术,特异性针对TLV病毒核酸进行检测。方法通过基因合成序列作为质粒标准品的模板,同时选择特异性的序列在3622~3729 nt处,设计一对引物和TaqMan性探针,优化反应体系及条件,进行qPCR扩增,从而建立TLV TaqMan探针qPCR方法,并对其灵敏度、稳定性和特异性进行评价。结果建立的TLV qPCR检测方法,标准曲线线性关系良好,R~2值可达到0.99,灵敏性最低能够检测到10个拷贝数/μL,对比普通PCR方法,高出其100倍;对其他常见大鼠病毒均无非特异反应;重复性良好,批内和批间变异系数均小于1%。结论利用TaqMan探针建立快速检测TLV的荧光定量PCR方法,该方法具有操作简便、灵敏度高、特异性好等特点。     

抗体夹心酶联免疫吸附法测定重组溶葡萄球菌酶研究

用重组溶葡萄球菌酶免疫家兔获得抗血清,经亲和层析纯化后用HRP标记,以双向免疫扩散法确定抗血清效价,以Westernblot鉴定抗体的特异性,建立双抗夹心法标准曲线,鉴定其最小检出限、精确度、回收率。实验显示多克隆抗体能与溶葡萄球菌酶特异性结合,双抗夹心ELISA法检测抗原的最小检出限为0·98ng/mL,标准曲线在0·98~500ng/mL范围内线性良好。3份同批样本分别重复6次测定,平均批内变异系数为6·4%;3份不同批样本分别重复6次测定,平均批间变异系数为6·5%。血清中加入已知量的标准抗原,测得平均回收率为98·6%。此法检测重组溶葡萄球菌酶的可测范围广,灵敏度和精密度高,变异系数较小。结果证实建立的检测血清中重组溶葡萄球菌酶含量的双抗夹心酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)灵敏、准确、可靠。     

基于裸磁珠体系检测血清淀粉样蛋白A浓度方法的建立与效果评估

传统链霉亲和素磁珠体系及酶促发光体系中通常存在生物素干扰强、发光率低、特异性差的缺陷。基于此，以裸磁珠为载体偶联血清淀粉样蛋白A（serum amyloid A, SAA）抗体，以吖啶酯作为发光标记物，依据双抗夹心原理，建立了一种快速测定SAA的方法，并对该方法的检测性能（包括：空白限、检测限、线性范围、精密度验证、干扰试验、HOOK效应、方法学比较等）进行了评估。结果表明，SAA抗体与裸磁珠成功偶联；该方法空白限为0.6 mg·mL^-1，检出限为1.0 mg·mL^-1；线性范围为1~100 mg·mL^-1 （R²＞0.990）；在精密度方面，以CV表示的重复性、室内精密度均<10%；血红蛋白、胆红素、甘油三酯对临床样本的干扰检测结果相对偏差均<10%。Bland-Altman偏倚分析表明，该方法检测值与西门子试剂的测量值差异基本在95％CI的一致性界限内波动，回归分析结果显示有较好的相关性（R²=0.987）。上述结果表明，研究所建立的裸磁珠-吖啶酯发光检测体系性能参数可满足临床检测要求，适用于血清中SAA的快速检测。     

ELISA检测外用人纤维蛋白原中纤溶酶原残留量的验证及应用

目的 ELISA检测外用人纤维蛋白原中纤溶酶原残留量,并对其进行方法学验证及应用。方法按照方法学验证的要求,对专属性、线性与定量范围、样品稀释线性、准确性、精密度、耐用性、样品稳定性进行验证分析。应用该方法检测外用人纤维蛋白原主要工艺步骤样品及成品中纤溶酶原残留量,并进行分析和控制。结果专属性验证结果表明,制剂缓冲液对检测结果无干扰,准确性均在(100±10)%以内;线性和定量范围验证结果表明,在0.137～100 ng/mL定量范围内,线性相关系数(R~2)>0.99,对照品回收率均在(100±20)%内,变异系数(coefficient of variation,CV)<5%;样品稀释线性验证结果表明,将样品稀释至0.332～83.050 ng/mL范围内,准确性均在(100±20)%内,CV均<15%;准确性验证结果表明,回收率均在(100±20)%以内;精密度验证结果表明,重复性和中间精密度CV均<10%;耐用性验证结果表明,样品孵育时间缩短至2.0 h,回收率为(89.5±1.4)%,CV为1.5%;样品稳定性验证结果表明,样品室温放置6 h以内,冻融3次以内,准确性均在(100±20)%以内。用此方法检测外用人纤维蛋白原主要工艺步骤样品及成品中的纤溶酶原残留量,结果表明层析步骤去除了95.1%纤溶酶原,是控制纤溶酶原的关键步骤;3批样品纤溶酶原残留量检测结果批间CV<20%,生产工艺稳定。结论该方法线性与定量范围、样品稀释线性均达到可接受标准,专属性、准确性、精密度、耐用性、样品稳定性均良好。应用此方法检测外用人纤维蛋白原中的纤溶酶原残留量,为去除痕量纤溶酶原时提供检测分析手段,有利于人纤维蛋白粘合剂产品质量的控制。     

软骨寡聚基质蛋白荧光免疫层析定量检测方法建立

本研究旨在建立一种可用于类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)辅助诊断的人软骨寡聚基质蛋白(cartilage oligomeric matrix protein, COMP)荧光层析检测方法。采用双抗体夹心法原理制备免疫层析试纸条,并进行性能评价及方法学对比。通过对临床样本的检测得到受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线,计算试纸条灵敏度、特异性、阳性和阴性预测值。线性范围为0.39–50.00ng/mL;批内批间变异系数均小于15%;试纸条37℃加速破坏20d,荧光信号强度变化范围在15%以内;与类风湿因子(rheumatoid factor,RF)、抗环瓜氨酸肽(anti-cyclic citrullinated peptide,anti-CCP)抗体无交叉反应;与ELISA试剂盒平行检测48份临床血清样本,相关性良好。采用本研究制备的试纸条检测样本,COMP区分RA患者和健康人的cut-off值为22.55 ng/mL (灵敏度为0.821,特异度为0.842,阳性预测值为0.741,阴性预...     

符克~(TM)酶联免疫捕获系统检测常见吸入物过敏原特异性IgE抗体

符克~(TM)(Fooke ~(TM))系统是国产自动化全定量过敏原s Ig E检测系统,是一种酶联免疫捕获法检测系统,已经用于检测常见吸入物过敏原特异性Ig E抗体(s Ig E)。本研究采用符克~(TM)系统检测户尘螨、粉尘螨、猫毛屑和狗毛屑过敏原slg E,试图评价符克~(TM)(Fooke ~(TM))系统在检测常见吸入物过敏原特异性Ig E抗体的精密度和灵敏度,并与Immunon CAP系统进行定量和定性比较。研究表明:符克~(TM)系统检测户尘螨、粉尘螨、猫毛屑和狗毛屑过敏原slg E的批内变异系数(CV)分别为3.33%、4.09%、5.83%和4.57%,均高于试剂盒标示精密度;定量测定下限(LOQ)分别为0.261 KU/L、0.255 KU/L、0.164 KU/L和0.269 KU/L,均低于厂商标示灵敏度。符克~(TM)系统和Immuno CAP系统定量检测数据进行线性回归分析表明,户尘螨、粉尘螨、猫毛屑和狗毛屑过敏原的直线回归决定系数分别为0.361、0.472、0.844和0.473,p0.05,具有良好的线性相关性;符克~(TM)系统和Immuno CAP~系统阳性符合率中,粉尘螨阳性符合率最低(75.00%);户尘螨、粉尘螨、猫毛屑和狗毛屑过敏原阴性符合率均较高(均85.00%);户尘螨、粉尘螨、猫毛屑和狗毛屑过敏原两系统Kappa值分别为0.907、0.813、0.757和0.855,具有较好的一致性。总体上,研究表明,符克~(TM)系统,作为国产自动化全定量过敏原s Ig E检测系统,用于检测常见吸入物过敏原slgE,具有较高的精密度和灵敏度,与Immuno CAP誖系统比较具有良好的相关性是一种具有较高的精密度和灵敏度,成本低的Elisa捕获检测系统,具有临床应用实用价值。     

比色法与核磁共振法测定A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖氧乙酰基含量的比较

目的比较Hestrin比色法(简称比色法)和核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)法在检测A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖氧乙酰基(O-Acetyl,OAc)含量的相关性和精密度。方法用比色法和NMR法测定A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖及其多糖衍生物,Y、W135群荚膜多糖水解物的OAc含量,比较分析两种方法的相关性及精密度。结果两种方法检测A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖OAc含量的决定系数分别为R~2≥0.954、R~2≥0.960、R~2≥0.969、R~2≥0.972;比色法检测3批C群脑膜炎球菌荚膜多糖(PSC)OAc含量的精密度,SD值分别为0.21、0.21、0.18,对应CV值分别为9.03%、9.01%、8.70%(95%置信区间);NMR法检测3批A群脑膜炎球菌荚膜多糖(PSA)OAc含量的精密度,SD值分别为0.66、0.78、0.83,对应CV值分别为0.72%、0.85%、0.93%(95%置信区间);结论比色法和NMR法在检测A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖OAc含量方面相关性良好,精密度良好,核磁法较比色法精密度更高。     

高效液相色谱法测定体液中硝酸盐及亚硝酸盐

目的和方法 :应用高效液相色谱技术建立一种灵敏的检测不同体液中硝酸盐和亚硝酸盐的方法。结果 :唾液、血清及尿液经过不同方法处理后应用高效液相色谱ODS反相柱分离 ,紫外检测器于 2 10nm检测其中的硝酸盐和亚硝酸盐的含量。整个分离过程少于 7min ,硝酸盐和亚硝酸盐的测定线性范围分别为 0 .7～ 10 0ng、5～ 10 0ng ,最低检测极限分别为 0 .3ng和 2ng。硝酸盐回收率为 99%～ 10 2 % ,亚硝酸盐回收率为 99%～ 10 4 %。测定硝酸盐及亚硝酸盐的精密度分别为 0 .8%和 1.7%。结论 :本法测定硝酸盐和亚硝酸盐简便、灵敏度高、特异性好     

复合探针实时荧光PCR检测细菌耐药基因blaNDM-1方法的建立

目的:建立一种检测编码新德里金属β内酰胺酶1(NDM-1)的细菌耐药基因blaNDM-1的复合探针实时荧光PCR方法。方法:基于复合探针技术原理,以blaNDM-1基因作为待检靶基因建立检测方法,对PCR扩增体系中镁离子浓度、PCR退火温度等进行优化,并对检测的灵敏性、特异性、重复性等进行评价。结果:优化了最佳反应体系和扩增条件;以灵敏度质控品进行灵敏度实验,最低检测限可达2拷贝/体系;非耐药性菌株的检测结果均为阴性;批间批内变异系数均小于5%;只有产NDM-1的鲍曼不动杆菌检测为阳性,其他377株临床分离菌和阴性对照均无响应。结论:建立了检测含blaNDM-1基因的菌株的方法,具有很好的灵敏性、特异性和重复性。     

一种联合检测乙型肝炎病毒前S1抗原与核心抗原方法的建立及其与病毒核酸检测结果的一致性

本研究以与血清中HBV DNA含量高度相关的两种HBV抗原(前S1抗原与核心抗原)为靶标,建立了联合检测这两种HBV核酸相关抗原(NRAg)的双抗体夹心法ELISA试剂.对系列稀释血清的检测表明,该试剂的平均分析灵敏度为103.2基因组拷贝/mL(95%可信限102.2-4.2基因组拷贝/mL),显著高于前S1抗原或核心抗原的单独检测.对994份HBsAg阴性血清的检测结果表明NRAg ELISA的特异性为99.7%(95%可信限:99.1%～99.9%).对271份临床慢性肝炎血清进行检测,结果NRAg ELISA与HBV DNA结果的总符合率达96.3%(95%可信限:93.3%～98.2%),NRAg ELISA的读值/临界值比(S/CO)与HBV基因组拷贝数呈正相关.利用NRAg试剂,发现了1例HBsAg"a"抗原表位突变的变异株.这些结果显示HBV NRAg ELISA与HBV DNA具有高度相关性,并能够检测出HBsAg抗原变异株,有望成为HBsAg变异株筛选的有力工具,并为广大基层医疗单位提供一种便捷的替代HBV DNA定性检测的手段.