盐穗木金属硫蛋白HcMT的体外自由基清除活性及抗氧化能力*

目的: 原核表达盐穗木(Halostachys caspica C. A. Mey.)金属硫蛋白HcMT并探究其抗氧化活性。方法: 构建原核表达载体pET-32a-HcMT,转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21,加入Zn²⁺胁迫培养(终浓度为200 μmol/L),分离纯化得到Zn-HcMT,测定Zn-HcMT自由基清除活性和总抗氧化能力,制备复合物Zn-HcMT/TiO₂并做FTIR表征。结果: 通过原核表达获得融合蛋白Zn-HcMT,对·OH、O₂·^-、DPPH自由基具有较强的清除活性,对·OH、O₂·^-的IC₅₀分别为0.386 mg/mL、0.038 mg/mL。融合蛋白浓度为0.01 mg/mL时,对DPPH清除率达(37.43 ± 0.006 8)%,浓度为0.3mg/mL时TEAC(trolox-equivalent antioxidant capacity)值为(1.023 ± 0.01)mmol/L,融合蛋白还原力A₇₀₀为0.142 ± 0.055,FTIR图谱同时表现了Zn-HcMT和TiO₂吸收特性。结论: Zn-HcMT具有良好的清除ROS活性及较强的抗氧化能力,在化妆品领域有潜在应用前景。     

重组金属硫蛋白HcMT的原核表达及其与金属离子竞争反应

[目的]在不同p H范围内和不同时间下检测重组HcMT结合的锌、铜离子的含量,对金属离子竞争结合金属硫蛋白的特征进行分析。[方法]构建重组表达载体,将重组质粒pET-32a-Hc MT进行原核表达,诱导时加入Zn~(2+),获得菌体后超声破碎,上清中添加Cu~(2+),分离纯化融合蛋白Trx A-Hc MT,检测金属硫蛋白溶液紫外吸收情况。样品硝化后用ICP-OES检测金属硫蛋白结合的金属离子含量。[结果]在pH 3～9的范围内,重组Hc MT上结合的Zn~(2+)含量随着p H值升高而升高。加入Cu~(2+)后,重组Hc MT上结合的Cu~(2+)浓度上升,Zn~(2+)浓度下降。在p H 3时,重组Hc MT结合金属离子的比值Cu~(2+)/Zn~(2+)为最小值0. 68,在pH 8时Cu~(2+)/Zn~(2+)为最大值1. 48,有利于Cu~(2+)竞争。当pH 8时,不同时间下Zn-Hc MT与Cu~(2+)的竞争结果表明1 h时锌铜有竞争高峰。[结论]证明了铜离子可以取代结合在重组HcMT上的锌离子,在p H 7～9范围中结合1 h竞争效率最高,该研究为重组Hc MT在重金属解毒方面的应用奠定基础。     

桑蚕金属硫蛋白基因在大肠杆菌中的克隆和表达

用\%Bam\%HⅠ和\%Sac\%Ⅰ双酶切质粒pCM1\|1,获得酵母的MTI基因片段,用非放射性地高辛标记作为探针。提取桑蚕肥苏蚕卵的总DNA,分别用\%Eco\%RⅠ、\%Bam\%HⅠ和\%Hin\%dⅢ酶切,与MTI探针进行Southern杂交,出现较强的杂交信号。然后用\%Eco\%RⅠ完全酶切桑吞的总DNA,电洗脱法回收1～6kb的染色体片断,与\%Eco\%RⅠ酶切的M13-载体以3∶1比例连接,转化受体菌DH5α。筛选到4 000多个白色转化子,与探针MTI进行Southern杂交筛选阳性转化子,选择到有强杂交信号的三个转化子［编号为T1(pZHC\|1)\,T5(pZHC\|5)\,T7(pZHC\|7)\]。用12种限制性内切酶对pZHC\|5重组质粒进行酶切分析表明插入片段约12kb,在基因内有一个\%Hin\%dⅢ位点。抗性测定表明受体菌DH5α在含有50mmol/L CuSO\-4的培养基上生长,在含有52mmol/L CuSO\-4的培养基上不生长,而转化子确能在含有52mmol/L CuSO\-4以上的培养基上生长。上述研究结果表明12kb左右的插入片段含有桑吞的金属硫蛋白基因。     

盐穗木钾转运蛋白基因HcKUP12的克隆及在盐胁迫下的表达分析

利用RACE技术从盐生植物盐穗木(Halostachys caspica)中克隆获得了一个钾离子转运体基因,经BLAST同源比对发现该基因与拟南芥钾离子转运蛋白At KUP12基因最为相似,命名为Hc KUP12。Hc KUP12基因c DNA全长为2953 bp,含有2544 bp的阅读框、262 bp的5'-UTR和147 bp的3'-UTR,编码847个氨基酸,分子质量为93.31 k D,理论等电点为7.19。利用实时荧光定量RT-PCR分析了Hc KUP12基因在600 mmol/L Na Cl处理下胁迫24 h的表达模式,结果显示该基因在盐胁迫下表达量显著增加,至处理24 h时达到最高(为对照的225倍),初步推测其可能是与盐穗木耐盐相关的一个候选基因。     

人视黄醇结合蛋白在大肠杆菌中的高效表达及其活性测定

视黄醇结合蛋白 (retinol- binding protein,RBP)是体内结合、转运维生素 A的重要载体蛋白 ,对生长、繁殖、视觉及维持上皮细胞分化状态至关重要 ,不但是临床营养支持蛋白质营养评价的最灵敏指标 ,而且可作为慢性肾病、严重肝病、甲亢等相关疾病的辅助诊断指标 .同时 ,RBP可作为疏水小分子结合蛋白家族构效关系研究的模型 ,具有重要的理论与应用研究价值 .我们已克隆出了它的 c D-NA[1 ] ,本文报道了人 RBP在大肠杆菌中的高效表达及其产物的初步纯化和活性测定 .1　材料与方法1 .1　材料含目的片段的克隆质粒 p GEM- RBP为本室构建 …     

新疆盐穗木GRAS转录因子基因克隆及表达分析

利用抑制消减杂交法从藜科盐穗木属盐生植物盐穗木中分离得到了一个盐胁迫响应的表达序列标签(EST)片段,结合SMARTTMRACE技术获得了盐穗木GRAS转录因子基因的cDNA。序列分析表明,该基因全长2 090bp,含有1 635bp的阅读框,294bp的5′-UTR和161bp的3′-UTR,编码544个氨基酸,分子质量为61.503kD,理论等电点为6.1。系统进化树和Blast同源序列比对分析结果显示,该基因编码的蛋白具有GRAS家族特有的C端保守结构域,并与葡萄GRAS家族蛋白VvSCL13聚集在一起,故将该基因命名为HcSCL13(GenBank登录号KC68640)。实时荧光定量qRT-PCR分析表明,HcSCL13基因在盐胁迫后表达呈明显上调,初步推测Hc-SCL13基因可能与盐穗木的耐盐性相关。     

cre基因在大肠杆菌中的表达及表达蛋白活性的检测

Cre重组酶来自噬菌体P1,可以识别特异的loxP位点的DNA序列,并进行专一性的剪切和拼接,利用PCR技术将cre基因克隆至原核表达载体pET-29a,在大肠杆菌BL21（DE3）得到了高效表达,采用DEAE－52柱层析的方法对表达蛋白进行了纯化,体外生物学活性检测表明,表达蛋白对含有同向loxP位点的质粒有切割活性。     

盐胁迫下盐穗木HcThi1基因的表达分析

环境胁迫能够导致植物的DNA损伤,而DNA损伤修复基因与盐胁迫可能具有密切的相关性。根据盐穗木盐胁迫下响应的转录组测序结果,克隆获得了盐穗木具有DNA损伤修复功能的硫胺素噻唑合成酶(thiazole biosynthetic enzyme)基因,其开放阅读框1 077 bp,编码358个氨基酸,命名为HcThi1。保守结构域分析显示,保守结构域分析发现其具有SDR超家族保守结构域,合成硫胺素噻唑。系统进化树分析显示HcThi1为独立的分支,亚细胞定位于细胞质,为无信号肽的不稳定蛋白。实时荧光定量PCR分析表明,在100 mmol/L NaCl胁迫72 h后,同化枝中HcThi1的表达迅速上调并达到最大值,约为对照组的18.66倍,随着盐浓度的提高,HcThi1的表达逐渐降低。说明HcThi1基因表达受盐胁迫的诱导。研究结果有助于阐明HcThi1基因表达与植物抗盐的相关性。     

金属硫蛋白突变体的植物高效表达载体的构建及其在烟草中的表达

金属硫蛋白有α、β两个结构域（ｄｏｍ ａｉｎ）,其中α结构域优先结合Ｃｄ２＋ 和Ｈｇ２＋ ．小鼠αα突变体在大肠杆菌中已经构建并得到表达,其转基因植株已得到,可在Ｃｄ３００（３００ μｍ ｏｌ／Ｌ）中生长．为了进一步提高外源基因在烟草中的表达量,首先用ＰＣＲ 的方法设计引物,在基因翻译起始密码子ＡＴＧ 附近加入植物偏爱的碱基组合ＡＡＣＡＡＴＧ．另外,将该突变体基因插入具有双３５ Ｓ（ＣａＭＶ３５Ｓ）强启动子的植物双元表达载体ｐＧＰＴＶｄ３５Ｓ－ＢＡＲ中,获得了带有αα突变体的植物双元表达载体．通过农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草ＮＣ８９,获得了抗除草剂的转基因植株．经ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 和蛋白Ｄｏｔ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ 检测,证明了αα突变体在烟草中的嵌合与表达．抗重金属实验证明转基因烟草可以在Ｃｄ４００（４００ μｍ ｏｌ／Ｌ）中生长．     

盐穗木HcPEAMT基因的克隆及表达分析

依据盐穗木编码PEAMT的EST序列设计引物,通过快速扩增cDNA末端技术,获得盐穗木磷酸乙醇胺甲基转移酶(phosphoethanolamine N-methyltransferase,PEAMT)全长cDNA,命名为HcPEAMT。序列分析表明HcPEAMT基因开放阅读框为1 482bp,编码494个氨基酸,推测分子量为56.3kD,理论等电点为5.51。保守结构域分析表明,HcPEAMT含有2个独立的S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶的保守结构域,每个结构域含有4个基序。系统进化树分析确认HcPEAMT与盐生植物盐角草的亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析表明,盐胁迫3h时,盐穗木同化枝和根中HcPEAMT基因的表达迅速上调并达到最大值,分别为对照的4.3倍和6.7倍。脱落酸(ABA)胁迫3h时,同化枝中HcPEAMT的表达量达到最高,而根中HcPEAMT的表达在12h才达到最高,表达量分别为对照的2.6和2.5倍。研究结果表明,HcPEAMT基因表达受盐胁迫的强烈诱导,也受ABA胁迫的诱导。该研究结果有助于阐明HcPEAMT基因表达与植物抗逆性的相关性。     

家蝇金属硫蛋白基因的克隆、原核表达及活性检测

金属硫蛋白是一类普遍存在于生物体内、富含半胱氨酸的小分子蛋白,能螯合多种金属离子。本研究根据EST序列信息,利用RACE技术克隆到1条家蝇Musca domestica金属硫蛋白基因MdMtn（GenBank登录号为GU289398）。序列分析表明,MdMtn cDNA全长408 bp,包含1个123 bp的开放阅读框,编码40个氨基酸残基,其中半胱氨酸残基10个,呈-C-X-C-方式排列。此蛋白理论分子量为3.8 kD,等电点为878。为了解家蝇金属硫蛋白对重金属的结合活性,构建了pET-DsbA-MT表达载体,并转化Escherichia coli BL21（DE3）宿主菌进行融合表达。研究发现MT重组菌对重金属镉的耐受性得到了明显加强,提示MdMtn基因可能在家蝇适应重金属环境中起到积极作用。     

盐穗木的组织培养及植株再生

1植物名称盐穗木[Halostachyscaspica(Bieb.)C.A.Mey.]。2材料类别采自新疆五家渠地区盐穗木种子,经实验室萌发形成无菌幼嫩茎段。3培养条件(1)丛生芽诱导培养基:MS+6-BA1.0mg·L-1(单位下同);(2)生根培养基:1/2MS+IBA0.5。上述培养基中均加入2.2%蔗糖和0.7%琼脂,pH5.8～6.0。培养温度为23～26℃,光照时间为16h·d-1,光照强度约34μmol·m-2·s-1。4生长与分化情况4.1无菌材料的获得将盐穗木的种子在超净工作台中先用10%次氯酸钠消毒20min,无菌水冲洗4遍。随即用无菌水将处理好的盐穗木种子喷涂在底部约有1cm厚的MS琼脂培养基的三角…     

盐穗木病程相关蛋白HcPR10抗血清的制备及鉴定

病程相关蛋白(PRs)在植物抗病抗逆过程中发挥重要作用。盐穗木病程相关蛋白基因HcPR10(GenBank:KF673356)来自盐穗木(Halostachys capsica)在600 mmol·L-1NaCl胁迫下的盐抑制差减文库。为探究盐穗木病程相关蛋白HcPR10发挥生物学功能的机制,该研究通过体外表达和纯化HcPR10重组蛋白制备特异性的HcPR10多克隆抗体。并采用双酶切构建原核重组表达载体pET28a-HcPR10,转化至大肠杆菌(Escherichia coli) BL21诱导表达,通过正交分析优化重组蛋白可溶性诱导表达的条件,利用Ni-NTA亲和层析柱纯化融合蛋白,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,基于纯化获得的His-HcPR10重组蛋白和转HcPR10拟南芥总蛋白,分别利用ELISA和Western Blotting检测抗血清效价和特异性。结果表明:成功构建重组表达载体pET28a-HcPR10;正交结果显示诱导温度27℃,诱导转速200 r·min-1,IPTG浓度0.7 mmol·L-1,诱导时间6 h条件下可诱导表达大量可溶性目的蛋白; ELISA检测抗H...     

甜蛋白Monellin基因在大肠杆菌中的高效表达

据已报道的单链monellin甜蛋白的氨基酸序列,采用细菌偏爱密码子,人工合成了全长 294bp的 monellin基因。插入到大肠杆菌表达载体Pet_22b中,构建重组分泌型表达载体Petmo。经IPTG诱导Petmo所含有的甜蛋白基因可在大肠杆菌BL21（DE3）中高效表达,表达量占菌体可溶性蛋白的44.8％。且经纯化后测定其甜度是蔗糖的3000倍。得到的甜蛋白热稳性及耐酸性均比天然产物有所提高。     

应用硫氧还蛋白促进外源蛋白在大肠杆菌的可溶性表达

为了观察硫氧还蛋白（ＴｒｘＡ）促进外源蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的作用,我们从质粒ｐＥＴ－３２ａ（＋）上克隆了ｔｒｘＡ基因,构建了ＴｒｘＡ表达质粒ｐＴ－ＴｒｘＡ。将该质粒与其它蛋白基因的表达质粒共同转化Ｅ．ｃｏｌｉ并同时获得表达。结果表明,共表达ＴｒｘＡ可以明显促进外源蛋白,如甲状旁腺激素相关蛋白（ＰＴＨｒＰ）、ＰＴＨｒＰ受体（ＰＴＨｒＰ－Ｒ）的血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）的可溶性表达。说明共表达     

利用融合蛋白EDDIE在大肠杆菌中高效表达抗菌肽Cecropin AD

本研究采用猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)定点突变外壳蛋白(EDDIE)为融合蛋白,对抗菌肽Cecropin AD(CAD)基因进行了高效融合表达,获得了有抗菌活性的抗菌肽CAD。首先采用重叠PCR基因合成技术将编码抗菌肽的CAD基因与猪瘟病毒定点突变外壳蛋白EDDIE编码基因合成为e-cad融合基因,接着将融合基因e-cad采用定点同源重组的方法连接到载体pET30a上,构建成pETED表达载体,然后转化大肠杆菌BL21(DE3)表达,表达的融合蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的40%以上。蛋白质在体外复性,融合蛋白中EDDIE自我剪切,产生抗菌肽CAD。抑菌试验表明抗菌肽CAD能有效地抑制大肠杆菌和藤黄八叠球菌的生长,并且对酵母菌的生长也有微弱地抑制作用。以EDDIE为融合蛋白是在大肠杆菌中高效表达抗菌肽的一种好方法。     

盐穗木HcDmc1基因的克隆和表达分析

根据盐穗木盐胁迫下响应的转录组测序结果,克隆获得盐穗木DNA损伤修复基因的cDNA序列,其开放阅读框1 035bp,编码344个氨基酸,命名为HcDmc1。保守结构域分析显示,该基因编码的蛋白具有RecA蛋白家族典型的保守结构域;统进化树分析显示HcDmc1为独立的分支;亚细胞定位于细胞质,为无信号肽、不跨膜的稳定亲水性蛋白。实时荧光定量PCR分析表明,盐穗木在100mmol/L NaCl胁迫7d后,同化枝中HcDmc1基因表达迅速上调并达到最大值,约为对照组的6.58倍;在700mmol/L NaCl胁迫14d后根中HcDmc1基因表达最高,约为对照的1.79倍。研究表明,HcDmc1基因表达受盐胁迫诱导。     

鲎血细胞中脂多糖结合蛋白TALF在大肠杆菌中的表达研究

TALF(Tachyleus antilipoposaccharide factor)对细菌内毒素（LPS）的核心部分有抑制作用。研究TALF cDNA基因在大肠杆菌中的表达,首先将TALF cDNA基因分别插入大肠杆菌表达载体pGEX-4T-2、pET22b、pET28a中,构建重组表达质粒,转化于大肠杆菌BL21(DE3)。结果表明克隆于pET22b、pET28a中的TALF cDNA基因没有表达,而融合了GST的TALF基因（GST-TALF）能够在大肠杆菌中表达,并形成包涵体。从1L培养基中可获得4mg纯度为91%的GST-TALF融合蛋白。经复性和纯化后的融合蛋白GST-TALF几乎检测不到抑菌活性及LPS中和活性,但该融合蛋白经凝血酶消化后表现出明显的体外抑菌活性及LPS中和活性。     

盐胁迫下盐穗木差异表达基因的转录组信息分析

盐穗木是一种理想的耐盐模式植物,本文利用生物信息学方法分析盐穗木在盐胁迫下差异表达基因的转录组,为盐穗木耐盐机理及耐盐关键基因的储备提供理论依据。基于盐穗木在盐胁迫（600 mM NaCl）下差异表达的转录组数据,以代谢通路中基因表达数量最多的7条通路和与胁迫刺激响应相关的共8条通路为主要研究内容,筛选出上调和下调表达差异显著的unigene,将其与NCBI数据库中所有物种相关基因进行Blastx比对,筛选出通路中上调和下调差异表达最显著的unigene,同时对差异表达活跃的unigene进行分类汇总。共得到23组差异表达活跃的基因类群,分别是乙烯响应因子、WRKY转录因子、Myb转录因子、bZIP转录因子、葡聚糖酶、6-磷酸脱氢酶、醛脱氢酶、柠檬酸合成酶、蛋白激酶等,推测这些类群的基因在盐穗木耐盐机制中发挥重要作用。