牛绝对端粒长度测定及DNA提取造成的影响

目的：端粒是真核生物染色体末端的一种高度保守的负责维持染色体稳定的特殊结构,其DNA序列长度即端粒长度,会随着年龄增长或疾病发生发展而逐渐缩短,检测端粒长度可以为评估机体衰老和健康状况提供参考,但目前缺乏测定微量牛DNA样本绝对端粒长度的方法;通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)实现微量牛DNA样本绝对端粒长度的测定并评估DNA提取方法对牛绝对端粒长度测定结果的影响,为进行端粒长度研究时选择合适的DNA提取方法和端粒长度分析方法提供参考。方法：利用标准曲线对检测样本的端粒和内参Ct值进行转换,通过qPCR测定牛端粒长度绝对值;采用膜吸附法、苯酚-氯仿法和磁珠法3种方法分别提取相同样本的DNA,分别用端粒末端限制性片段(terminal restriction fragment, TRF)分析法和qPCR法分析端粒长度,比较不同DNA提取方法对牛绝对端粒长度测定的影响。结果：(1)qPCR可以测定纳克级别DNA样本的绝对端粒长度,检测结果重复性良好,并且和“金标准”TRF测定结果的相关性良好。(2)不同方法提取的DNA用TRF分析法和...     

精子端粒长度与特发性男性不育相关

端粒是真核生物染色体末端的多功能特异性DNA-蛋白结构,覆盖在染色体末端,保护基因组的稳定性。端粒在减数分裂过程中起到了十分重要的作用,协助染色体配对、联会、同源重组和分离。精子中的端粒可能在精子的受精能力和胚胎发育中起到重要作用。近年来,端粒与生殖的相关性研究成为一个新的热点,但精子端粒与男性不育间的相关性并不明确。本文采用实时荧光定量PCR方法检测中国特发性男性不育人群(126例)和正常可育男性人群(138例)的精子相对端粒长度,结果发现,特发性男性不育病例的精子平均相对端粒长度(2.894±0.115)低于正常对照组(4.016±0.603),差异具有统计学意义(P=5.097×10^-5);并且精子相对端粒长度与精子密度、精子总数和精子活力都有显著的相关性：精子数量较多和/或精子活力较高,精子相对端粒长度较长。研究结果提示,在中国人群中,精子端粒长度与特发性男性不育具有相关性,精子的端粒长度可能影响精子发生和精子的功能,精子端粒的缩短导致精子数目及活力的降低从而导致男性不育。     

利用流式荧光原位杂交法测定细胞端粒长度

目的建立利用流式荧光原位杂交法检测细胞端粒长度的技术方法。方法以端粒酶敲除的G3小鼠和同龄野生型小鼠为检测对象,分离其外周血中的单个核细胞后与肽核酸荧光探针杂交,用流式细胞仪采集和分析其端粒长度,分别用荧光原位杂交方法和SYBR Green荧光定量PCR方法验证其准确性。结果流式荧光原位杂交法测定G3小鼠细胞端粒相对长度与C57BJ/6野生型小鼠相比为0.5345,荧光定量PCR测定端粒相对长度为0.5717,结果基本一致。结论流式细胞术与原位杂交方法结合起来检测细胞端粒的平均长度可靠易行,对单个核细胞端粒平均长度的检测有较高的实用性。     

有限延伸法检测端粒酶活性

人端粒酶是一种核蛋白体,通过其内含的RNA模板与端粒末端配对把重复端粒片段添加在端粒3＇末端|因此,端粒酶活性与细胞凋亡、衰老、永生化有密切关系,是癌症临床预测诊断的一个生物标签．现有的端粒酶活性检测方法,存在灵敏度低和不易定量等问题．本研究采用错配有限延伸法检测端粒酶活性：在人端粒酶延伸人工合成的游离端粒酶底物时,只加入dATP和dGTP,端粒酶只能把底物延伸4个脱氧核糖核苷酸AGGG．然后加入dNTP,让端粒酶延伸的产物和一条长的引物配对从而延伸出PCR模板|再加入引物进行热启动PCR．PCR后进行非变性PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis),得到希望的唯一1条目标带．同时,用不同的端粒酶浓度梯度进行优化,发现有限延伸法检测端粒酶活性的下限达到250个HeLa细胞．     

骨肿瘤端粒长度变化与相关蛋白表达的关系

目的:研究骨肿瘤端粒长度变化与端粒结合蛋白即端粒重复结合因子1(TRF1)和端粒保护因子(POT1),端粒酶催化亚单位(hTERT),肿瘤相关基因P53、c-myc表达的关系,以了解骨肿瘤的分子特征。方法:采用免疫组织化学、端粒定量荧光原位杂交(Telo-FISH)和原位杂交检测了20例骨肉瘤、25例软骨肉瘤、14例骨的纤维结构不良中端粒长度、TRF1、POT1、hTERT、P53、c-myc的表达情况,并进行统计分析。结果:20例骨肉瘤平均长度为0.31,25例软骨肉瘤为0.41,14例骨的纤维结构不良为0.52。统计显示三者间端粒长度有显著差异(P<0.05)。骨肉瘤和软骨肉瘤TRF1、POT1阳性率均显著低于骨纤维结构不良(P<0.05)。而骨肉瘤和软骨肉瘤hTERT基因表达显著高于骨纤维结构不良(P<0.05)。骨肉瘤、软骨肉瘤P53、c-myc阳性率高于骨纤维结构不良(P<0.05)。统计分析骨肿瘤端粒长度变化与端粒结合蛋白TRF1、POT1的表达呈负相关性,与端粒酶hTERT基因表达、与P53蛋白核聚积,以及c-myc癌基因表达呈正相关性。结论:骨肿瘤端粒长度与恶性表型有关、端粒短缩与肿瘤基因突变相关。     

地高辛标记法检测人源细胞系端粒长度

目的:建立一种灵敏的、非同位素标记的端粒长度检测方法,并用于人源细胞系的肿瘤研究。方法:以地高辛标记寡核苷酸(TTAGGG)3为探针,对基因组DNA进行Southern印迹检测,经CDP-Star显色后与DNA标准分子量比较,利用图像分析系统计算端粒长度。结果:通过严格控制探针的工作浓度(1∶3000稀释)、DNA上样量(1.5～2.5μg)、杂交温度(42±1℃)等主要影响因素,获得了比较好的杂交条带。结论:建立了一种稳定、可靠、低背景的地高辛标记检测端粒长度的方法;对正常细胞、永生化细胞和肿瘤细胞进行了端粒长度的检测和对比分析。     

定量荧光原位杂交测定端粒长度

目的:应用定量荧光原位杂交(Q-FISH)方法测定端粒长度。方法:选取4种端粒长度均一的标准细胞株采用Q-FISH的方法做出荧光亮度与端粒长度的标准曲线,从而得出实验细胞株的端粒长度,与DNA印迹法测定末端限制性片段(TRF)长度进行二者之间的相关性分析。结果:检测荧光强度的最佳线性曝光时间为400ms,相对于DNA印迹法,定量荧光原位杂交(Q-FISH)法所需标本量少,实验周期短,端粒长度结果与Southern杂交法具有很好的相关性。结论:采用定量荧光原位杂交方法测端粒长度具有重复性好、精确可靠的特点,适用于对珍贵标本的端粒改变进行分析。     

外周血单核细胞端粒长度和端粒酶hTERT 活性在心力衰竭中的变化研究

目的:探讨心力衰竭患者外周血单核细胞端粒长度和端粒酶h TERT活性在心衰发生进程中的变化情况和意义。方法:按照筛选要求选择患者,根据入选标准分为心衰组(49例)和非心衰组(44例)。记录患者的年龄、性别、生活习惯及疾病情况,超声检测患者心脏功能,测量左心室舒张末内径(LVEDD)、左心室射血分数(LVEF)。在不同时间点,抽取外周血分离单核细胞,用PCR方法检测端粒长度和端粒酶h TERT活性。结果:对照组比较,心衰组患者心脏左室舒张末内径明显增加,射血分数明显降低(P0.05);在第1、7天,心衰组患者外周血单核细胞端粒长度较对照组明显缩短、端粒酶h TERT活性明显增强。第7天较同组第1天端粒长度有所增加,端粒酶h TERT活性有所减低,但与对照组相比,端粒长度显著缩短,端粒酶h TERT显著增高(P0.05)。结论:心力衰竭后患者端粒长度和端粒酶h TERT活性明显变化,并随心衰发病具有一定波动,提示端粒和端粒酶可能参与了心衰发展进程。     

端粒植入胃癌7901细胞对细胞生长、端粒和端粒酶的影响

研究外源端粒片段植入胃癌7901细胞后对细胞生长、端粒长度和端粒酶活性的影响.采用lipofectTM2000介导的转染方式,将含有端粒片段质粒pSXneo-1.6-T2AG3转染胃癌细胞SGC7901,PCR在基因水平上鉴定外源性端粒片段的植入后,采用TRAP法检测转染细胞端粒酶活性变化,TRF法检测转染细胞端粒长度变化,MTT法检测细胞生长曲线,RT-PCR测定转染细胞hTERT表达变化.染色体核型分析细胞染色体变化.结果显示端粒片段成功导入SGC7901细胞后获得稳定的细胞株,端粒片段植入后细胞生长变慢,端粒长度延长不明显,端粒酶活性明显降低,hTERT mRNA表达水平下降,核型分析显示转染前后细胞染色体数目无明显变化.实验成功将携带了1600 bp端粒TTAGGG重复序列的真核表达载体pSX-T2AG3-neo稳定转染至人胃癌7901细胞中,端粒植入降低细胞端粒酶的活性和下调端粒酶活性亚单位hTERT的表达,但对端粒长度无明显影响.     

He-Ne激光抗衰老效应的初步探讨

目的:探讨氦氖激光对人胚肺二倍体成纤维细胞(Human fetal lung diploid fibroblasts,2BS)对细胞衰老的影响。方法:采用低功率氦氖激光(λ=632.8nm,p=5mW)对年轻2BS细胞进行照射处理,用实时荧光定量PCR( Fluorescence Real time Quantitative PCR,q-PCR)方法检测细胞端粒DNA相对长度的变化来反映细胞的衰老情况。结果:经激光照射后生长到老年的细胞端粒长度较未经激光照射而生长到老年的细胞端粒长度长。结论:经适当的激光照射后,细胞端粒D N A因衰老而变短的趋势得到减缓。从而为从基因水平上探讨低功率激光延缓细胞衰老的激光生物学效应提供实验依据。     

大黄素对宫颈癌Hela细胞端粒损伤作用的研究

该文探究了抗肿瘤药物、化疗增敏剂大黄素对人宫颈癌Hela细胞端粒和端粒酶活性的影响。利用磷酸化组蛋白H2AX(γ-H2AX)免疫荧光–端粒荧光原位杂交技术检测端粒区特异性DNA损伤水平。利用中期染色体–端粒荧光原位杂交技术检测端粒异常信号,包括多端粒信号(multitelomeric signals,MTSs)和端粒信号缺失(signal free ends,SFEs)。利用荧光定量PCR方法和端粒重复扩增程序分别检测端粒相对长度和端粒酶活性。结果显示,与0μmol/L对照组相比,20μmol/L大黄素处理Hela细胞48 h能够诱导端粒长度缩短至80%,同时还发现端粒功能障碍损伤灶(telomere dysfunction induced foci,TIFs)和端粒异常信号增多,包括MTSs由1.65%增加至3.98%(P0.01)、SFEs由2.74%增加至8.49%(P0.01)。同时,结果还发现,大黄素处理后,Hela细胞端粒酶活性显著升高,10μmol/L和20μmol/L大黄素处理48 h后,端粒酶活性分别升高为对照组的1.42倍(P0.05)和1.92倍(P0.01)。综上,实验结果表明,大黄素的急性暴露能够引起端粒功能障碍以及端粒酶活性升高,后者可能与端粒损伤后修复有关。     

哺乳动物早期胚胎端粒和端粒酶重编程

端粒位于真核染色体末端,是稳定染色体末端的重要元件。端粒酶(TER)是一种特殊的细胞核糖核蛋白(RNP)反转录酶(RT),其核心酶包括蛋白亚基和RNA元件。在DNA复制过程中的端粒丢失可以被有活性的端粒酶修复回来。哺乳动物端粒酶在发育中受调控,端粒的重编程可能是由于早期胚胎不同时期的端粒酶活性而造成的。因此,研究端粒和端粒酶重编程在早期胚胎发育中是非常重要的。该文综述了端粒和端粒酶的结构和功能,及其与哺乳动物早期胚胎发育的关系,并在此基础上展望了端粒和端粒酶在克隆动物胚胎发育的基础研究。     

端粒长度及端粒酶活性与儿童先天性心脏病发病机制的相关性研究

目的:探讨不同年龄儿童外周血白细胞端粒长度及端粒酶活性与儿童先心病发病机制的相关性.方法:采用实时荧光定量PCR检测先天性心脏病2个年龄组及健康受试者外周血白细胞的端粒长度及hTERT mRNA(端粒酶催化亚基).比较相同年龄的先天性心脏病与健康受试者外周血白细胞的端粒长度及hTERT mRNA差异,并比较不同年龄组间外周血白细胞的端粒长度及hTERT mRNA差异.结果:先天性心脏组3-6岁组的受检者及健康受试者3-6岁组平均外周血白细胞端粒(1.63± 0.61)长于先天性心脏组7-10岁组的受检者及健康受试者7-10岁组(1.36± 0.46)(t=1 1.37,P＜0.05);各组均无端粒酶表达.结论:外周血白细胞的端粒长度随着年龄的增长而缩短.端粒酶活性与先天性心脏病发病并无直接相关性.     

长链非编码RNA TERRA的研究进展

端粒是染色体末端的特殊结构,对染色体具有保护作用,并且和衰老及很多疾病相关。长链非编码RNA是长度大于200bp且一般不具有编码功能的RNA。TERRA(telomeric repeat-containing RNA)是由端粒重复序列转录的一类长链非编码RNA,研究表明TERRA具有参与调控端粒长度,促进异染色体形成和保护染色体末端等功能,并且TERRA的表达与疾病和衰老相关。由于TERRA对于端粒具有重要作用,因此对于TERRA的研究已经成为端粒相关研究中的热点。目前对于TERRA的转录调控及生物学功能已有较为深入的了解。现对TERRA的生物学特性,功能和与疾病及衰老的关系进行综述,以期为TERRA后续的研究如作为疾病治疗靶点,延缓衰老等提供参考。     

端粒酶RNA和端粒酶活性在人生殖道癌细胞株中的表达

本文采用反转录套式PCR(nested RT-PCR)和PCR端粒重复扩增(TRAP)方法分别检测了5种人生殖道癌细胞株端粒酶RNA(hTR)基因及端粒酶活性的表达。结果表明,宫颈癌HeLa和SiHa细胞株,绒毛膜癌JAR和BeWo细胞株及卵巢癌OCCI细胞株hTR及端粒酶活性均呈强阳性。但正常卵巢、宫颈和胎盘组织hTR和端粒酶呈阴性或弱阳性。提示反转录套式PCR和端粒重复扩增法可以简便而有效地检测端粒酶RNA及端粒酶活性。端粒酶的激活与肿瘤细胞增殖密切相关,并可能成为一项具有临床价值的肿瘤标志物。     

曲古抑菌素A对克隆猪端粒长度的影响

端粒是染色体末端结构, 在细胞分裂时随着DNA复制而缩短, 体细胞核移植能不同程度地延长端粒长度, 但有些克隆动物端粒的长度在体细胞核移植过程中不能有效恢复, 因而这些克隆动物就会表现出早衰现象。文章发现克隆东北民猪以及eGFP、Mx和PGC1α转基因克隆猪的端粒长度与核供体成体成纤维细胞相比显著缩短(P<0.05), 表明体细胞核移植的重编程过程没能延长细胞的“寿命”。曲古抑菌素A(Trichostatin A, TSA)是一种去乙酰化酶抑制剂, 有研究表明其能提高某些物种的体细胞核重编程效率。为了使端粒长度有效恢复, 文章利用40 nmol/L TSA处理1细胞期猪克隆胚胎24 h, 结果发现, 与对照组相比, TSA处理能显著地提高克隆胚胎体外发育的囊胚率(16.35% vs. 2 7.09%, 21.60% vs. 34.90%, P<0.05), 而且囊胚期端粒长度也得到显著延长(P<0.05)。克隆胚胎移植受体后得到了TSA处理组与非处理组的克隆猪, 虽然TSA处理并没有提高克隆效率(1.3% vs. 1.7%, TSA vs. control), 但端粒长度与对照组和供体细胞相比均显著延长(P<0.05)。猪体细胞核移植不能有效恢复端粒长度, 但是TSA处理能有效延长克隆猪端粒长度。     

RNAi干扰WDR79基因对肺腺癌A549细胞增殖的抑制效应

通过RNA干扰技术沉默端粒酶关键组分WDR79的表达,采用PCR法、Western blot、免疫荧光共聚焦、Southern blot、MTT、流式细胞术(FCM)分别检测WDR79 siRNA瞬时转染A549细胞后WDR79基因和蛋白的表达水平、端粒酶和端粒的结合情况和端粒长度变化、细胞生长增殖变化、细胞周期的变化及细胞凋亡率,探讨该基因的沉默表达对A549细胞的抑制作用。结果表明,WDR79 siRNA瞬时转染A549细胞显著降低WDR79 mRNA及蛋白水平(P0.05),端粒和端粒酶的结合水平明显减少(P0.05),细胞增殖的活力被抑制(P0.05),干扰后停留在S期的细胞减少(P0.05),停留在G1期的细胞增多(P0.05)。提示WDR79 siRNA的瞬时转染可显著降低WDR79基因及蛋白的表达,并有抑制肺腺癌A549细胞的生物学效应,进一步探索了WDR79基因在肿瘤发生发展中的重要作用,并在为肺癌的治疗中寻找更有效的靶点提供了实验证据。     

荧光定量PCR测定端粒长度

目的应用实时荧光定量聚合酶链式反应（Q—PCR）方法测定端粒长度。方法选取9种人类细胞株,提取基因组DNA,采用Q—PCR方法测定相对T／S比率,DNA印迹法测定末端限制性片段（TRF）长度,进行二者之间的相关性分析。结果定量PCR测定端粒长度相对T／S比率为0．68±0．57,DNA印迹法测量平均TRF值为8．57±2．34,两种方法测定结果的相关性分析R2=0．7807（P〈0．01）。结论采用荧光定量PCR方法测量端粒长度具有重复性好、省时、简便、可靠的特点,可高通量处理大量样品。     

人细胞端粒DNA复制与长度维持

端粒位于染色体末端,由短的串联重复DNA片段及其结合蛋白组成。端粒在维持基因组稳定性及染色体结构完整性方面发挥着重要作用。端粒DNA由富含G/C的序列构成,包括双链区及G含量高的3'悬垂单链区(G-overhang,G-tail)。端粒DNA能够形成G四联体(G-quadruplex)和T环(T-loop)等高级结构。许多与DNA损伤修复相关的蛋白质参与端粒DNA的复制与端粒结构的维持,并相对于基因组的其他区域,端粒的DNA复制较为特别,从广义上讲,端粒DNA的复制可以包括双链复制(telomere replication),端粒酶复制延伸(telomerase extension)和C链补齐(C-rich fill-in)。端粒双链复制引起的端粒长度缩短是导致人体细胞衰老的重要原因,而端粒酶复制延伸及C链补齐是干细胞及肿瘤细胞维持其端粒长度及持续分裂能力的主要途径。端粒复制及其结构功能研究是生物医学领域的一个重要热点,阐释端粒复制的机理将为疾病预防及治疗等提供新的思路。