摩氏摩根菌产酯酶条件优化及在普瑞巴林手性中间体合成中的应用

为建立廉价、高效的普瑞巴林关键手性中间体生产工艺,经单因素优化和正交试验,确定了摩氏摩根菌CCTCC M 2011175最佳产酯酶培养基,组成(g/L)为葡萄糖15.0,牛肉膏7.0,Na2HPO41.0,Fe2(SO4)30.1,吐温-8010.0。优化后酯酶比酶活达到1 071.0 U/L,为出发培养基的2.5倍。以培养基优化后获得的摩氏摩根菌菌体为催化剂,立体选择性拆分外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯水解,转化率达到45%,对映体过量值(e.e.)大于94%,为酶法生产普瑞巴林关键手性中间体奠定了良好基础。     

嗜热毛壳菌热稳定脂肪酶基因(lm)的克隆及其在毕赤酵母中的表达(英文)

研究从嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum中克隆了一个新的脂肪酶基因(lm)。其中DNA序列包含一个由870个碱基构成的开放阅读框,编码289个氨基酸,含有4个内含子,没有信号肽序列。序列提交Gen Bank,登录号为GU338248。将该基因在毕赤酵母中表达。在甲醇的诱导下,重组蛋白得到了高效表达,第6天的表达量最高,蛋白达到0.428mg/m L,菌物学报酶活力为19.77U/mg。SDS-PAGE检测该蛋白的分子量为35k Da。该脂肪酶的最适反应温度为60℃,具有热稳定性,在40–80℃热稳定,80℃处理60min仍有65%的相对酶活。该酶最适反应p H值为10.0,在p H 9.0–12.0酶活相对稳定。该酶具有较好的热稳定性和耐碱性,具有良好的工业应用价值。     

嗜热毛壳菌热稳定脂肪酶基因(Im)的克隆及其在毕赤酵母中的表达

研究从嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum中克隆了一个新的脂肪酶基因(lm).其中DNA序列包含一个由870个碱基构成的开放阅读框,编码289个氨基酸,含有4个内含子,没有信号肽序列.序列提交GenBank,登录号为GU338248.将该基因在毕赤酵母中表达.在甲醇的诱导下,重组蛋白得到了高效表达,第6天的表达量最高,蛋白达到0.428mg/mL,酶活力为19.77U/mg.SDS-PAGE检测该蛋白的分子量为35kDa.该脂肪酶的最适反应温度为60℃,具有热稳定性,在40-80℃热稳定,80℃处理60min仍有65％的相对酶活.该酶最适反应pH值为10.0,在pH 9.0--12.0酶活相对稳定.该酶具有较好的热稳定性和耐碱性,具有良好的工业应用价值.     

毕赤酵母中表达透明颤菌血红蛋白提高重组脂肪酶的表达

解脂耶氏酵母胞外脂肪酶Lip2(YlLip2)是一种具有广泛应用前景的工业酶.为了改善高密度发酵生产Y1Lip2过程中的溶氧限制,提高Y1Lip2的表达量,将YlLip2基因lip2和透明颤菌血红蛋白(VHb)基因vgb分别置于AOXl启动子和PsADH2启动子的调控之下,进行YlLip2和VHb在毕赤酵母中的共表达.PsADH2启动子来源于树干毕赤酵母Pichia stipitis,在低氧条件下能被激活.SDS-PAGE和CO-差式光谱分析表明,Y1Lip2和VHb在重组菌中成功实现了共表达.在氧限制性条件下,VHb表达的细胞(VHb+,GS 115/9Klip2-pZPVT)与对照细胞(VHb-,GS 115/9Klip2)相比,摇瓶和10 L发酵罐中YlLip2表达量分别提高了25％和83％.此外,在低氧条件下,VHb+细胞在10 L发酵罐中的生物量也比VHb-细胞高.文中也获得了一株表达了VHb的并携带有多个lip2基因拷贝的克隆子GS 115/9Klip2-pZP VTlip2 49#,在低氧条件下,该克隆子在10L发酵罐中的最高脂肪酶水解活力达33 900 U/mL.因此,在毕赤酵母中用PsADH2启动子表达VHb,同时增加lip2基因的拷贝数是提高YlLip2表达量的一种有效策略.     

静置的固定化荧光假单胞菌脂肪酶(PFL)生物反应器中催化合成乙酸香茅酯

为提高脂肪酶催化合成乙酸香茅酯的效率,优化催化条件,通过物理吸附,将脂肪酶Pseudomonas fluorescens lipase(PFL)固定在脱脂棉上,与柱形瓶或滴定管形成简易的生物反应器,并用于催化香茅醇与乙酸乙烯酯反应,合成乙酸香茅酯。结果发现,即使在静置条件下,在脱脂棉固定化PFL瓶型生物反应器中,在37℃催化反应24 h,香茅醇转化成乙酸香茅酯的转化率达96%以上。同样在静置条件下,在脱脂棉固定化PFL管式生物反应器中,在室温下催化反应4 h,香茅醇转化成乙酸香茅酯的转化率达68.5%。显然,制备的固定化酶反应器具有高效的催化作用。     

重组嗜热栖热菌海藻糖合酶制备海藻糖的工艺条件优化

海藻糖具有独特的生物活性,在多种行业应用广泛。海藻糖合酶能够专一性催化麦芽糖一步生成海藻糖。本文通过PCR扩增获得了来源于Thermus thermophilus ATCC33923的海藻糖合酶基因Tre S,构建了基因工程菌E.coli BL21(DE3)/p ET-24a(+)-Tre S。工程菌在摇瓶中发酵28 h时,胞内海藻糖合酶酶活达到最高值为6.4 U/m L。进一步研究了该重组酶制备海藻糖的影响因素,发现当以10%麦芽糖为底物,初始反应p H 7.5,加酶量为15 U/g麦芽糖,40℃,150 r/min反应24 h,转化率达到最高值,为49.0%。当底物浓度提高至20%~40%时,转化率为45.4%~46.2%。     

嗜热古菌S.solfataricus小热激蛋白基因的克隆及表达

目的:从嗜热古菌Sulfolobus solfataricus中克隆一种新的小热激蛋白SsHsp14.1的基因,并研究其表达和生物活性。方法:用PCR技术以S.solfataricus基因组为模板扩增得到目的基因序列片段,并将其克隆到pET-28a(+)中,转化到E coli BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,纯化后对产物进行生物活性测定。结果:从菌株S.solfataricus中克隆出目的基因,该基因的编码框由375个碱基组成,编码的蛋白质由124个氨基酸组成。含该质粒的大肠杆菌经诱导表达了一个与预期理论值相符的约14kDa的蛋白,利用亲和层析和凝胶柱分离纯化了重组蛋白。试验证明纯化后的重组SsHsp14.1具有分子伴侣活性,重组蛋白在体内表达时能提高E.coli细胞的耐热性。结论:成功克隆SsHsp14.1基因并表达出蛋白,并明确了其分子伴侣活性,为该热激蛋白的研究和应用奠定基础。     

重组毕赤酵母表达华根霉脂肪酶发酵液的絮凝除菌条件研究

在重组毕赤酵母表达华根霉脂肪酶的研究中,目的蛋白的提取收率是关键.由于产物脂肪酶是分泌在发酵液中,常用的方法是加入絮凝剂使茵体沉淀,再通过离心获取上清液中的目的蛋白.本研究改良了传统的絮凝剂配方,确定了絮凝剂的新配方:发酵液中加入2%的氯化钙以及磷酸氢二钠按摩尔比1:1混合液,500 mg/L聚丙烯酰胺,同时调节发酵液...     

嗜热栖热菌α-葡萄糖苷酶基因的表达及酶学性质研究

用PCR方法从嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)HB27中扩增出编码α-葡萄糖苷酶基因hbg,将其克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET28a( )上,电击转化E.coliBL21(DE3),获得高效表达hbg基因的大肠杆菌重组菌。重组菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达蛋白相对分子质量约为59kD,与预期分子量相符。经镍柱和阴离子交换柱纯化的重组表达的α-葡萄糖苷酶HBG最适温度为95℃,最适pH值为5.0。     

嗜热真菌纤维素酶的CBD与海栖热袍菌的纤维素酶融合表达

将嗜热真菌毛壳菌纤维素酶Cel7A的纤维素结合结构域编码区与极端嗜热厌氧菌海栖热袍菌的纤维素酶CelB基因进行融合, 构建重组质粒pHsh-CBD-CelB, 并在大肠杆菌中表达。对融合蛋白进行纯化, 通过热处理和离子交换层析, 纯化到的融合蛋白SDS-PAGE 电泳图谱显示为单一条带。对融合蛋白的特性研究, 结果表明融合蛋白降解CMC的最适反应温度为90°C, 结晶纤维素吸附实验表明该融合蛋白具有结合结晶纤维素的能力, 并且融合蛋白降解CMC与结晶纤维素的能力得到提高。     

合成己酸乙酯脂肪酶产生菌的筛选及产酶条件

从２７株脂肪酶产生菌中筛选到能由乙醇和己酸合成己酸乙酯的菌株８株。其中Ｒｈｉｚｏｐｕｓｓｐ．Ｈ－３菌株脂肪酶活力为５０－６０ｕ／ｍｌ,全细胞在有机溶剂中的酯化率可达己酸的９１％。Ｈ３产酶的最适碳源为淀粉或葡萄糖。６％黄豆饼粉加４％蛋白陈复合氮源有利于酶活力的增加。     

嗜热古菌Archaeoglobus fulgidus RecJ核酸酶的表达纯化及酶学特征

[目的]克隆表达嗜热古菌Archaeoglobus fulgidus(A.fulgidus)来源的RecJ核酸酶基因(ORF编号AF_0699,NCBI数据库基因登陆号为AF_RS03550),对该重组蛋白的核酸酶活性及酶学特征进行鉴定和分析.[方法]将A.fulgidus RecJ(AfuRecJ)核酸酶在大肠杆菌中...     

合成己酸乙酯脂肪酶产生菌的筛选及发酵条件的研究

以有机相中合成酶活为指标,通过对薰衣草根际土壤产脂肪酶菌株的筛选,获得了一株在有机相中合成己酸乙酯转化率相对较高的细菌Arthrobacter Y-605,其己酸乙酯转化率为67.53%.考察了影响该菌株产脂肪酶的各项因素,确定其最佳培养基组分:2%玉米粉,1%黄豆粉,0.1%尿素,0.05%MgSO4,0.1%K2HPO4,0.15%KCl;最适培养条件:初始pH8.0,温度为和35℃,装液量60 ml,转速为160 r/min;同时,表面活性剂Tween80的添加对脂肪酶的产生具有促进作用.通过对Arthrobacter Y-605培养条件的优化,脂肪酶活力由3.8 U/ml提高到13.33 U/ml,为该菌株的菌种改良及其在有机相合成领域的应用奠定了基础.     

嗜热古菌Sulfolobus acidocaldarius核酸内切酶V的重组表达与酶学特征

[目的] 表达纯化嗜酸嗜热硫化叶菌（Sulfolobus acidocaldarius）的核酸内切酶V （Saci_0544）,对其核酸内切酶活性及酶学特征进行探究。[方法] 将Sulfolobus acidocaldarius核酸内切酶V （SacEndoV）在大肠杆菌中进行重组表达,经亲和层析纯化得到目标蛋白;利用带有不同类型损伤的寡核苷酸作为底物,结合变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,鉴定SacEndoV对相应损伤寡核苷酸底物的剪切活性。[结果] SacEndoV特异性剪切含脱氧肌苷（Deoxyinosine）的损伤DNA底物,明显偏好单链DNA底物。SacEndoV在70-95℃温度范围内酶活性高,酶活性依赖于二价金属离子,Mg²⁺为最佳辅助离子,其最佳反应pH为7.5-8.0,高于200 mmol/L的NaCl会明显抑制其剪切活性。损伤DNA中脱氧肌苷3''端相邻的脱氧核糖核苷酸的结构完整性对于SacEndoV识别并剪切相应底物具有重要影响,脱氧肌苷3''端无碱基位点的存在使得SacEndoV不能够切断损伤DNA。此外,经测定SacEndoV对于含肌苷的损伤RNA底物具有剪切活性。[结论] 本研究证实SacEndoV是一种典型的核酸内切酶V,对含脱氧肌苷的损伤DNA具有特异性的内切酶活性,推测其在Sulfolobus acidocaldarius体内参与脱氧肌苷的切除修复。     

噬热栖热菌质粒分离蛋白同系物ParBTth的表达与重组酶活性

在低拷贝质粒中,质粒分离基因位点parABS对质粒DNA的子细胞精确分离有重要意义。噬热栖热菌(Thermus thermophilus)为多倍体,其染色体上表达有一个parABS同系物,命名为parABSTth,包含parATth和parBTth两个基因,以及一个候选parSTth的DNA序列(5’-TGTTTCCCGTGAAACA-3’)。parABSTth基因位点的功能与机制尚未清楚。本研究首先在大肠杆菌Escherichia coli中克隆并表达了T. thermophilus parABSTth位点中的parBTth基因。利用Ni-IDA亲和层析方法纯化得到了重组蛋白ParBTth;经SDS-PAGE测定,该重组蛋白纯度达到了近99%,通过凝胶迁移实验(EMSA)验证了重组ParBTth蛋白的功能。结果显示,重组ParBTth能与候选parSTthDNA序列特异性相结合。因此,异源表达的重组ParBTth蛋白是具有生物学活性的。该结果也验证了候选parSTthDNA序列确实为T. thermophilus的parABSTth基因位点中特异性的parS序列。本研究为揭示多倍体细菌染色体的子细胞分离过程原理提供了一定的基础理论依据。     

疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达

疏棉状嗜热丝孢菌Thermomyces lanuginosus可产生具有重要工业生产价值的脂肪酶。根据已报道的相应序列设计特异引物,综合运用PCR、RT-PCR技术克隆到脂肪酶基因的全长DNA和cDNA序列。其中DNA序列长1071bp,包含876bp的开放阅读框以及3段内含子;cDNA序列长885bp。结构基因编码蛋白包含292个氨基酸,前17个氨基酸构成信号肽。序列提交GenBank,登录号分别为EU022703和EU370914。将脂肪酶基因cDNA序列的开放阅读框克隆到酵母分泌型表达载体pPIC9K中,转化毕赤酵母GS115得到重组子且实现了分泌表达。将重组子诱导产酶,在培养温度30℃、甲醇添加量1%的情况下,小规模发酵量达0.93mg/mL,其分泌表达的最高酶活为7.2U/mL。重组酶最适反应温度和pH分别是60℃和8.0。表达蛋白在60℃保温1h后仍有完全酶活,具有较高的热稳定性。     

优化的绿色荧光蛋白在超嗜热嗜酸古菌冰岛硫化叶菌中的表达与应用

【目的】开发可用于在极端嗜热嗜酸模式泉古菌冰岛硫化叶菌(Sulfolobus islandicus)中进行高效表达的eCGP123(enhanced consensus green protein variant 123)荧光蛋白,并用作S.islandicus的细胞内蛋白定位工具。【方法】绿色荧光蛋白突变体eCGP123具有极高的热稳定性、耐酸性和可逆的荧光特性等。本研究主要对eCGP123的基因根据S.islandicus密码子偏好性进行优化与合成,在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达并研究其蛋白性质;通过在eCGP123的C末端分别融合具有不同细胞内定位的蛋白(包括E.coli来源的Fts Z和S.islandicus来源的Ups E、PCNA1和SiRe_1200等),构建eCGP123及其融合蛋白的表达菌株,用激光共聚焦显微镜分析eCGP123及其融合蛋白在E.coli和S.islandicus活细胞中的亚细胞定位。【结果】我们确认了在E.coli中表达并纯化密码子优化后的e CGP123具有与野生型绿色荧光蛋白相同的吸光值和较高的热稳定性。细胞学分析显示细胞分裂相关蛋白FtsZ和Si Re_1200分别主要定位于E.coli和S.islandicus分裂细胞的中间;鞭毛组分蛋白Ups E呈点状均匀分布,可能定位于细胞膜上;DNA复制滑动夹亚基PCNA1呈区域性点状分布,暗示了DNA复制区域的位置。蛋白的亚细胞定位与预期结果基本吻合。【结论】绿色荧光蛋白e CGP123可以作为报告蛋白,应用于S.islandicus细胞的蛋白定位分析中,可作为该模式菌株中功能基因研究的重要工具,但需要进一步优化条件。     

嗜热糖化酶基因在重组黑曲霉工程菌中的表达及酶学性质初步研究

为了提高糖化酶的耐热性能,降低淀粉糖化发酵工艺的生产成本,构建了同源整合载体pEasy-glaAdir以及pEasyssg,将黑曲霉(Aspergillus niger)的糖化酶基因(glaA)灭活,并将硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)的嗜热糖化酶基因(ssg)插入到黑曲霉基因组中,筛选得到表达嗜热糖化酶的重组黑曲霉工程菌(A.nigerWW1)。重组菌的发酵结果显示,嗜热糖化酶在黑曲霉中得到了分泌表达,发酵液酶活达到3 030 U/mL。重组嗜热糖化酶的最适反应温度为90℃,最适pH为6.0,该酶具有较高的热稳定性,在80℃时的半衰期在60 min以上,具有良好的工业应用前景。     

非水溶剂中Rhizopus arrhizus脂肪酶催化合成三种酯的最佳条件(英文)

以少根根霉 (Rhizopusarrhizus)脂肪酶为催化剂 ,有机溶剂为反应介质 ,合成了 3种短链脂肪酸酯 .研究了反应温度、溶剂、底物浓度、底物摩尔比、吸水剂用量等因素对酯化反应的影响 .确定了3种酯的最佳合成条件 :(1)己酸乙酯 :反应温度为 4 0℃ ,环己烷为溶剂 ,0 2 5mol L底物浓度 ,酸醇摩尔比为 1∶1 2 ;(2 )乙酸异丙酯 :5 0℃ ,环己烷为溶剂 ,0 15mol L底物浓度 ,摩尔比为 1∶1;(3)乙酸异戊酯 :5 0℃ ,异辛烷为溶剂 ,0 2 0mol L底物浓度 ,摩尔比为 1∶1.三种酯合成时均需 0 12 5g ml的0 5nm分子筛为吸水剂 ,在 8h后 ,合成酯转化率达到 97%～ 99% .     

高分子量腈水合酶在大肠杆菌中的表达策略及重组菌的细胞催化

【目的】实现红球菌Rhodococcus rhodochrous J1来源的高分子量腈水合酶H-NHase在Escherichia coli BL21(DE3)中过量表达,以提高菌体总酶活,缩短菌体发酵周期,提高生产效率。【方法】将H-NHase中编码α亚基的基因nhh A和调控基因nhh G上游的核糖体结合位点(Shine-Dalgarno sequence,SD)替换成翻译起始强度更高的异源SD,同时优化各亚基之间间隔序列的长度,并根据大肠杆菌密码子偏好性对目的基因进行优化。通过E.coli重组表达系统过表达优化后的腈水合酶基因。采用离子交换层析对H-NHase进行纯化,并通过凝胶过滤层析确定重组酶的相对分子量。优化了全细胞催化条件,并建立底物恒速流加的细胞催化工艺,模拟了烟酰胺的生产工艺。【结果】H-NHase在E.coli中实现了过量表达。重组蛋白粗酶液的活性为85.5±4.3 U/mg,纯酶比活为234.0±11.7 U/mg,H-NHase相对分子质量为504.5±9.8 k D。细胞催化最适p H为7.5,最适温度为25°C,底物浓度为400 mmol/L。在此条件下,重组菌细胞酶活为256.0±10.4 U/m L,流加工艺最终的产物转化率可达99.9%。【结论】重组H-NHase大肠杆菌细胞生长迅速,发酵周期短,应用此重组菌进行细胞催化可以提高酰胺类物质的生产效率,具有潜在的工业价值。