重组腈水解酶催化合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸

(S)-3-氰基-5-甲基己酸是合成普瑞巴林的关键手性中间体。笔者以表达来源于Brassica rapa subsp.的重组腈水解酶工程菌Br Nit为催化剂,不对称水解外消旋异丁基丁二腈(IBSN)制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸。考察反应温度、p H以及不同底物浓度和金属离子对全细胞催化IBSN水解的影响。结果表明:全细胞催化的最适温度为30℃,最适p H为8. 0,最适底物浓度为180 mmol/L。在此条件下,利用10 g/L湿菌体催化水解IBSN,反应6 h转化率可达45. 1%,产物对映体过量值(e.e.值)达到97. 9%。     

摩氏摩根菌ZJB-09203酯酶的分离纯化及性质

立体选择性水解2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯(CNDE)是化学-酶法合成重大疾病治疗药物普瑞巴林的关键步骤。分离纯化了能够高效水解S-型CNDE的摩氏摩根菌ZJB-09203胞内酯水解酶,并进行酶学性质研究。采用硫酸铵分级沉淀、Phenyl Sepharose 6 FF疏水柱层析、DEAE Sephadex A-50阴离子交换和羟基磷灰石Bio-Scale CHT层析,纯化得到电泳纯的酯水解酶。SDS-PAGE和凝胶过滤HPLC分析确定该酶为单亚基蛋白,分子量为68 kDa。不同碳链长度p-硝基苯酚酯特异性酶解结果表明,该酶为酯酶,酶促合成普瑞巴林手性中间体(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的最适pH为9.0,最适温度为45℃,且在pH 7.0-9.0和40℃条件下具有良好的稳定性。Ca2+、Cu2+、Mn2+对酶活有一定的促进作用,Co2+、Fe3+、Ni2+及EDTA对酶活有较强的抑制作用。此外,考察了该酯酶水解p-硝基苯酚酯的动力学参数,及CNDE浓度对转化率的影响。首次报道了能够立体选择性水解CNDE的酯酶,相关酶学性质研究将为该酶催化合成普瑞巴林手性中间体的工业化应用提供重要依据。     

摩氏摩根菌产酯酶条件优化及在普瑞巴林手性中间体合成中的应用

为建立廉价、高效的普瑞巴林关键手性中间体生产工艺,经单因素优化和正交试验,确定了摩氏摩根菌CCTCC M 2011175最佳产酯酶培养基,组成(g/L)为葡萄糖15.0,牛肉膏7.0,Na2HPO41.0,Fe2(SO4)30.1,吐温-8010.0。优化后酯酶比酶活达到1 071.0 U/L,为出发培养基的2.5倍。以培养基优化后获得的摩氏摩根菌菌体为催化剂,立体选择性拆分外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯水解,转化率达到45%,对映体过量值(e.e.)大于94%,为酶法生产普瑞巴林关键手性中间体奠定了良好基础。     

Serratia marcescens H30脂肪酶的重组可溶表达、固定化及其酶学性质

为了提高Serratia marcescens H30脂肪酶的可溶表达水平,分别将目的基因与p GEX-4T-1、p ET28a和p ET32a构建重组表达载体,转入大肠杆菌BL21(DE3),通过优化诱导过程,发现可溶性酶的最高活性可达25 000 U/L。再经Ni2+亲和柱纯化、LH-EP固定化后,固定化酶的比酶活为214 U/g(以1 g湿质量计),酶活回收率为51%。固定化后重组脂肪酶的最适温度由30℃提高到35℃,最适p H从7.0偏移至8.0左右,并且稳定性也有所增加。该固定化重组脂肪酶同样能够拆分消旋体反式-4-甲氧苯基缩水甘油酸甲酯,光学选择性没有改变。反应14 h,转化率为48.5%,底物的e.e.值为99.2%,表明该固定化脂肪酶能有效拆分消旋体反式-4-甲氧苯基缩水甘油酸甲酯,为工业生物催化制备地尔硫卓提供了可能。     

(3R)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯水解酶产生菌的筛选与产酶条件优化

以2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为唯一碳源,采用手性气相法检测,筛选到一株能产对映选择性水解酶的假单胞菌Pseudomonas CGMCC No.4184.该菌产的水解酶能优先水解R型底物产生(3R)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸,产物对映体过量值达到90%以上.对菌株Pseudomonas CGMCC ...     

疏绵状嗜热丝孢菌外切β-葡聚糖酶的基因克隆与酶学特征

【目的】疏绵状嗜热丝孢菌是一种嗜热丝状真菌,具有合成与分泌多种耐热酶的能力,从中找寻酶活高、耐热性能优良的β-葡聚糖酶。【方法】对疏绵状嗜热丝孢菌其中一个外切β-葡聚糖酶的编码基因gln B进行克隆,并在毕赤酵母GS115中表达。【结果】在摇瓶水平上重组菌的产酶活为11.5 U/m L,重组酶在SDS-PAGE中的大小约为48 k D。重组Gln B最适作用温度为65°C,最适作用p H为5.0;在低于50°C或p H 3.0-10.0之间具有良好稳定性。重组酶水解海带三糖,首先生成单糖和二糖,延长酶作用时间,可以进一步将其中的二糖部分水解为单糖。【结论】疏绵状嗜热丝孢菌来源的重组酶Gln B为外切β-葡聚糖酶,具有较好的耐热性能和p H稳定性。     

利用产脂肪酶B的毕赤酵母工程菌生物拆分制备西司他丁关键手性中间体的体系优化

S-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸(S-(+)-DMCPA)是合成西司他丁的关键手性中间体。构建的毕赤酵母工程菌生产的脂肪酶可高选择性催化外消旋2,2-二甲基环丙烷甲酸乙酯(DMCPE)不对称水解制备S-(+)-DMCPA。对该工程菌产胞外脂肪酶的产酶条件及生物拆分反应条件进行优化,以提高其催化效率。优化获得重组毕赤酵母最佳产酶条件:采用BMMY培养基,培养基初始p H 8.0,500 m L摇瓶装50 m L培养基,每隔4 h向培养基中补加终体积分数为1%的甲醇。培养192 h后,发酵液中脂肪酶比酶活为4.41 U/L,较优化前提高了90.9%。利用含脂肪酶的发酵上清液进行DMCPE的生物拆分反应,底物浓度为15 mmol/L,30℃反应36 h,S-(+)-DMCPA的产率可达43.8%,e.e.值为99.8%。     

高产耐热脂肪酶嗜热脂肪地芽孢杆菌的选育

采用氮离子注入技术对耐热脂肪酶产生菌嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）L4进行诱变,筛选获得酶活力有较大提高且传代稳定的正突变菌株L4-3;再对L4-3进行紫外线诱变,得到脂肪酶活力提高的正突变菌株L4-3-2,其脂肪酶活力达25．71U／mL,较原始菌株M提高511．9％。高产突变株L4-3-2所产脂肪酶的最适作用温度为50℃,70℃保温60min的剩余酶活为82％,最适作用pH为7．0～8．0,为一种耐热碱性脂肪酶。     

脂肪酶YCJ01拆分对位取代α-苯乙醇

利用脂肪酶YCJ01催化拆分对位取代α-苯乙醇衍生物。以异丙醚为反应介质,采用乙酸乙烯酯作为酰基供体,对180 mmol/L的1-(4-甲基苯基)乙醇进行选择性酯化,脂肪酶粗酶粉添加量为5 g/L,50℃反应21 h后,底物转化率可达49.96%,对映体过量值e.e.s、e.e.p值分别为97.1%和97.2%,对映体选择性E200;同样,对1-(4-甲氧基苯基)乙醇进行选择性酯化,酰基供体为丁酸乙烯酯,底物浓度150 mmol/L,脂肪酶粗酶粉添加量为2.5g/L,30℃反应12 h后,底物转化率为49.8%,e.e.s、e.e.p值分别为97.7%和98.4%,对映体选择性E200,显示了很好的手性拆分效果。     

伯克霍尔德氏菌ZYB002脂肪酶lipC24基因的克隆、表达及其酶学性质

【目的】克隆伯克霍尔德菌ZYB002菌株中的新型脂肪酶lip C24基因,测定其基本酶学性质,为后续深入研究该基因在菌株中的生理功能奠定基础。【方法】根据洋葱伯克霍尔德菌JK321菌株的全基因组DNA信息,直接设计引物从伯克霍尔德菌ZYB002菌株基因组中扩增出lip C24基因,并对之进行原核表达、重组蛋白的纯化及酶学性质分析。【结果】lip C24基因全长1317 bp,编码438个氨基酸残基;多肽链中具有保守五肽-G-X1-S-X2-G-序列;重组蛋白Lip C24的分子量为45 k Da;能有效水解各种对硝基苯酯,对中链脂肪酸的对硝基苯酯表现出偏爱性;其催化水解反应的最适温度为40℃,最适p H7.5;40℃下的半衰期为15.72 min,在p H 7.0-8.0的条件下,具有较好的稳定性。【结论】lip C24的编码产物为一个45 k Da蛋白,具有明显的脂肪酶活性,为中温中性脂肪酶。     

嗜热毛壳菌热稳定脂肪酶基因(lm)的克隆及其在毕赤酵母中的表达(英文)

研究从嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum中克隆了一个新的脂肪酶基因(lm)。其中DNA序列包含一个由870个碱基构成的开放阅读框,编码289个氨基酸,含有4个内含子,没有信号肽序列。序列提交Gen Bank,登录号为GU338248。将该基因在毕赤酵母中表达。在甲醇的诱导下,重组蛋白得到了高效表达,第6天的表达量最高,蛋白达到0.428mg/m L,菌物学报酶活力为19.77U/mg。SDS-PAGE检测该蛋白的分子量为35k Da。该脂肪酶的最适反应温度为60℃,具有热稳定性,在40–80℃热稳定,80℃处理60min仍有65%的相对酶活。该酶最适反应p H值为10.0,在p H 9.0–12.0酶活相对稳定。该酶具有较好的热稳定性和耐碱性,具有良好的工业应用价值。     

酸性α-淀粉酶菌株的筛选及其发酵条件研究

自淀粉厂周边土壤分离筛选到一株高效耐酸α-淀粉酶菌株SH3,初步鉴定为酵母菌,发酵粗酶p H范围3.8-8.0,最适作用p H5.0,该酶在80℃下仍有酶活,最适作用温度50℃。经单因素发酵条件的研究与优化,最适温度37℃,培养基初始p H5.0,可溶性淀粉作碳源,蛋白胨为氮源,200 m L装液量。正交试验确定最佳产酶条件为可溶性淀粉15 g/L、蛋白胨30 g/L、37℃、p H4.5,该条件下酶活力为96.8 U/mg。     

腾冲嗜热杆菌热稳定海藻糖磷酸化酶的基因表达与酶的分子生物学性质研究

分离克隆了腾冲嗜热杆菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)海藻糖磷酸化酶(TreP)的编码基因(treP), 该酶可催化以葡萄糖和α-1-磷酸葡萄糖为底物的海藻糖合成反应及其逆向的分解反应. 反向mRNA点杂交实验表明, 腾冲嗜热杆菌中treP基因在高盐胁迫条件下表达量增加, 而在海藻糖诱导条件下表达量降低. 将该基因导入不含TreP的大肠杆菌中进行诱导表达, SDS-PAGE表明, 异源表达的TreP分子量约为90 kD, 与预期值相同. 通过葡萄糖氧化酶法测定分解产物葡萄糖的产率表明: TreP催化海藻糖分解反应的最适温度是70℃, 最适pH值为7.0; 通过HPLC检测合成产物海藻糖的产率表明: TreP催化合成反应的最适温度为70℃, 最适pH值为6.0. 在最适反应条件下, 50 μg的TreP粗酶可催化25 mmol/L α-1-磷酸葡萄糖与葡萄糖在30 min合成11.6 mmol/L海藻糖; 而同量的酶在同样时间内仅能将250 mmol/L海藻糖分解生成1.5 mmol/L葡萄糖. 以上体内胁迫和诱导表达分析及体外酶学性质分析均证明该酶的主要功能是催化海藻糖的合成反应. 热稳定性实验表明, 该酶性质比较稳定, 在50℃下温育7 h还能保持77%以上的活性, 是一个有潜在工业用途的新的热稳定海藻糖合成酶.     

有机介质中酶促合成壬酸香草醇酯的研究

壬酸香草醇酯是与天然辣椒素酯结构最接近的一个化合物,本文研究了有机相中脂肪酶催化合成这个化合物的方法,为天然辣椒素酯的酶促合成探索方法。考察了酶、溶剂、酶的用量、底物浓度、溶剂水含量以及温度等因素对反应的影响,结果表明脂肪酶Novozym e 435的活性最好,最适条件为:在1 mL脱水丙酮中,香草醇与壬酸甲酯的浓度分别为50、75 mmol/L,酶量为20 mg,30℃下反应24 h,产率可达到60%以上,产物经硅胶柱层析纯化,并以1H NMR及MS进行了表征。     

定点突变Ca~(2+)平衡位点对粘质沙雷氏菌脂肪的影响

为了研究粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)脂肪酶lip A中的Ca~(2+)对酶活力的影响,采用定点突变的方法对平衡Ca~(2+)的位点D388进行定点突变,对突变体进行诱导表达后,纯化目的蛋白并进行酶学性质分析。与野生酶相比,突变酶的最适温度由40℃降低到25℃,最适p H值由8.5降到8.0,T_(1/2)值比野生酶提高了2℃。由此可知,该Ca~(2+)对脂肪酶lip A酶学性质有着至关重要的作用。     

改性壳聚糖固定化脂肪酶的研究

以化学改性后的壳聚糖为载体固定假丝酵母99-125脂肪酶,研究了不同的活化剂对壳聚糖表面羟基基团的活化程度,及以活化后壳聚糖为载体采用不同固定化方法对假丝酵母脂肪酶固定效果的影响。结果表明1-乙基-3-(3-甲基氨基)丙基碳二亚胺可有效的活化壳聚糖表面羟基,活化后的壳聚糖表面氨基与戊二醛偶联后形成的壳聚糖为良好的脂肪酶固定化载体,其固定脂肪酶的水解活力可高达86.8U/g。此外,还对影响固定化进程中的各种因素进行了研究,确定最优条件,比较了固定化前后酶的热稳定性、有机溶剂稳定性及最适反应温度。并考察了该固定化脂肪酶催化合成棕榈酸十六酯的操作稳定性,结果表明,连续反应16批之后棕榈酸十六酯的转化率仍能达到85%以上。     

海南豇豆枯萎病病原鉴定及生物学特性初步研究

从海南乐东豇豆地采集到的枯萎病病样,经形态学观察、致病性测定和真菌ITS序列分析,将其病原鉴定为尖孢镰刀菌菜豆专化型(Fusarium oxysporum f.sp.phaseolus)。生物学特性分析表明:该病原菌菌丝生长适宜温度为20~30℃,最适温度为25℃,50℃时不能生长;适宜p H为6~10,最适p H值为8.0;全黑暗和全光照有利于菌丝的生长;可利用多种碳、氮源,最适碳源为果糖和D-甘露醇,氮源为蛋白胨和硝酸钠。     

载体两性电解质修饰对固定化γ-谷氨酰转肽酶pH耐受性和催化活性的影响

针对γ-谷氨酰转肽酶(GGT)p H耐受性差的缺陷,首先以硅烷化改性的介孔氧化钛晶须(s MTw)为载体对重组枯草芽胞杆菌GGT进行固定化,再以p H 8.0~10.5的载体两性电解质Pharmalyte(CA,p H 8.0~10.5)对其进行后修饰,得到固定化酶s MTw-GGT-CA。结果发现:s MTw-GGT-CA的p H耐受性较游离酶明显提高,可在p H 6.0~11.0范围内保持稳定的催化活性。同时,s MTw-GGT-CA的热稳定性也较游离酶有所提高,其最适作用温度为50℃左右,热失活反应活化能Ed为49.88 k J/mol。s MTw-GGT-CA对γ-谷氨酰对硝基苯胺(Gp NA)的亲和力常数Km为0.579 mmol/L,与游离酶相近。     

一种来源于运动替斯崔纳菌KA081020-065的新型卤醇脱卤酶的表达纯化及性质分析

卤醇脱卤酶(Halohydrin dehalogenase)不仅对于含氯污染物的生物降解、净化环境具有重要意义,而且在手性医药中间体合成中也是一种重要的生物催化剂,但其数量较少。采用基因挖掘在基因组数据库中获得一种来自运动替斯崔纳菌Tistrella mobilis KA081020-065的新型卤醇脱卤酶基因Hhe TM,将该基因克隆、表达在大肠杆菌BL21(DE3)中,利用镍柱亲和层析将该酶进行纯化并研究了其酶学性质。Hhe TM是一种同源四聚体;最适温度为50℃;不同的p H缓冲液对其活性有较大影响;在碱性、30℃以下的条件下稳定性高。在氰根离子存在的条件下,Hhe TM能够催化(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯合成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯,为酶法合成阿托伐他汀关键中间体提供了一种新的卤醇脱卤酶。     

3-氰基吡啶水合酶的反应条件及影响因子

研究了芳腈水合酶催化水合3-氰基吡啶生成尼克酰胺的反应条件及影响因子.酶反应的最适pH为8.0,最适温度为25℃.酶在pH8.5于25℃保温4小时或在25—30℃于pH8.0保温3小时是稳定的.反应液中加入Fe~(3+)(1.5 mmol/L)可使酶活力增加 50%,而加入NH_4~+(300 mmol/L)则使酶活降低了67%.Ag~+和 Hg(2+)”强烈地抑制酶反应活性,在浓度均为 5mmol/L时,抑制率分别为99.7%和100%.NaCN(50 mmol/L)和苯甲腈(100 mmol/L)对酶活性的抑制率分别为78%和85%.该酶作用于 3-氰基吡啶的Km为62.5 mmol/L,V_(max)为85.8 μmol·min~(-1)·mg~(-1).