有丝分裂诱导基因6(MIG-6)可诱导人成纤维细胞发生提前衰老

年老细胞许多基因表达发生变化,其中有些基因的表达可以诱导成纤维细胞早衰.癌基因诱导的衰老(oncogene-induced senescence,OIS)是由一些连续癌症基因的信号,以阻止细胞增殖造成的反应.有丝分裂诱导基因6(mitogen-inducible gene-6,MIG-6)是一个抑癌基因,是ErbB RTK通路的负调控因子,抑制肿瘤细胞增殖.本文以人胚肺二倍体成纤维细胞为对象,研究MIG-6蛋白在细胞衰老中的作用.通过Western印迹发现,在老年细胞中MIG-6表达升高.利用逆转录病毒载体将MIG-6基因转入年轻的人胚肺二倍体成纤维细胞中,通过Western印迹方法检测是否过表达MIG-6,然后通过SA-β-gal染色检测其阳性率,发现转染MIG-6基因后的成纤维细胞SA-β-gal染色率明显高于对照组,生长缓慢.实验结果证实,MIG-6蛋白可以诱导人二倍体成纤维细胞提前衰老.     

蒙花苷消除衰老骨髓间充质干细胞的衰老表型发挥抗衰老作用

目的:探讨蒙花苷(Linarin,LR)是否可以消除衰老骨髓间充质干细胞(BMSC)的衰老表型发挥抗衰老作用。方法:取4周龄80 g-100 g的雄性SD大鼠大腿骨髓腔内的骨髓间充质干细胞,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养至三代,使用D-gal诱导骨髓间充质干细胞衰老,使用SA-β-gal染色、活性氧检测、蛋白免疫印迹验证骨髓间充质干细胞细胞衰老状态,通过蛋白免疫印迹检测衰老BMSC与正常BMSC中细胞保护性蛋白sirt1、sirt6及衰老相关蛋白p16、p21、p53的表达水平。之后,我们通过不同浓度LR处理衰老骨髓间充质干细胞。最后,通过蛋白印迹分析检测未处理组与LR处理组衰老相关蛋白表达情况。观察蒙花苷能否可以消除衰老的大鼠骨髓间充质干细胞衰老表型。结果:衰老的骨髓间充质干细胞细胞保护性蛋白sirt1、sirt6降低及衰老相关蛋白p16、p21、p53明显增高,衰老细胞中与DNA损伤相关的细胞核内蛋白γ-H2AX表达明显增加。而蒙花苷处理后,衰老细胞组衰老相关蛋白p16、p21、p53明显降低,γ-H2AX蛋白阳性细胞明显减少。结论:蒙花苷可以剂量依赖性的消除衰老的大鼠骨髓间充质干细胞的衰老表型发挥抗衰老作用。     

咖啡因抑制辐照区和旁区细胞的γ-H2AX foci的形成

辐射诱导的旁效应不仅在体外实验存在,也在动物体内存在,这对辐射剂量的计算和辐射风险的评估有重要影响。咖啡因是一个模式辐射敏感剂,显著增强辐射的细胞毒性。咖啡因也显著增强辐射诱导的旁效应,咖啡因处理使未受辐照的旁细胞对损伤信号更加敏感,但其机理并不清楚。在正常人原代细胞AG1522中,分析了咖啡因处理对组蛋白H2AX磷酸化的影响,咖啡因显著减少α粒子辐射区和旁区γ-H2AX foci阳性细胞的比率和每个细胞γ-H2AX foci点数,表明咖啡因处理抑制了H2AX磷酸化,后者启动细胞对DNA双链断裂的修复,从而提示咖啡因增强辐射旁效应可能的机理,对辐射治疗具有重要意义。     

TGFβ信号调控阿霉素诱导的衰老肿瘤细胞表达SA-β-gal

目的:细胞衰老是维持机体稳态的一种重要机制,表达SA-β-gal被认为是衰老细胞的一种特异性的标志,但有研究表明在衰老细胞中SA-β-gal染色阳性只是衰老细胞的溶酶体变大的结果,为了探究SA-β-gal的表达与细胞衰老之间的具体关系,我们验证了参与调节衰老细胞表达SA-β-gal的信号通路及SA-β-gal的表达情况是否会对细胞衰老的过程产生影响.方法:肿瘤细胞用低剂量的阿霉素处理24小时后,再分别给予不同的小分子抑制剂继续作用4天,观察SA-β-gal染色阳性的细胞数目及SA-β-gal表达与否对于衰老细胞在分泌细胞因子、生长阻滞等细胞生物学功能上的影响.结果:在阿霉素诱导细胞发生衰老的过程中,TGFβ抑制剂SB431542能够抑制衰老细胞表达SA-β-gal,而SA-β-gal表达的缺失并不影响细胞衰老的其他特征性改变.结论:低剂量的阿霉素作用肿瘤细胞后,细胞会进入衰老的状态.在细胞衰老的过程中,TGFβ受体Ⅰ的抑制剂SB431542可以抑制衰老细胞表达SA-β-gal,但是SA-β-gal的缺失表达并不影响细胞衰老的过程及衰老细胞的其他特性,如:不可逆的生长阻滞、分泌有活性的细胞因子等.结果表明:SA-β-gal并不能作为衰老细胞的特异性标志.     

超级干扰素抑制A549增殖诱导其衰老

该研究利用MTT和结晶紫的方法证明sIFNα对肺癌细胞A549增殖有很强的抑制作用,而同样剂量的普通干扰素IFNα2b抑制作用要小很多。与对照组相比,sIFNα处理后,细胞形态发生改变,细胞体积变大,形态呈扁平状;Hoechst33258染色发现,细胞核形态无变化并且未检测到凋亡;SA-β-gal染色发现大多数细胞呈现阳性,同时,衰老相关蛋白p53和p21表达量明显上调。而IFNα2b处理组细胞形态基本没有变化,SA-β-gal染色也只有少部分的细胞呈现弱阳性。由此说明,sIFNα比IFNα2b能更好地抑制癌细胞增殖,其机制可能为诱导癌细胞发生衰老。     

模拟微重力诱导PC12 细胞衰老的初步探讨

目的:构建模拟微重力条件下PC12细胞的培养体系,探讨模拟微重力对PC12细胞衰老的影响。方法:用Cytodex-3型微载体作为PC12细胞的贴附载体,旋转细胞培养系统所提供10-2g的微重力环境进行模拟微重力条件下的细胞培养。在倒置显微镜下观察PC12细胞的生长情况;用扫描电镜观察PC12细胞超微结构的变化;衰老相关β半乳糖苷酶(SA-β-gal)特异性染色对衰老的PC12细胞进行评估。结果:光镜下模拟微重力培养的PC12细胞表现出类衰老细胞的形态,扫描电子显微镜下观察发现其微绒毛增多。SA-β-gal染色的结果显示在模拟微重力的作用下,PC12细胞SA-β-gal的活性升高。结论:模拟微重力可以引起PC12细胞衰老样的形态变化,以及SA-β-gal的活性升高。     

电离辐射生物标志物γ-H2AX的检测技术研究进展

电离辐射可导致DNA双链断裂,从而使组蛋白H2AX迅速在双链断裂处磷酸化为γ-H2AX。检测细胞中γ-H2AX聚集处形成的焦点数目可用于评价DNA双链断裂情况,且与辐射剂量相关。因此,γ-H2AX可作为电离辐射的生物标志物,用来评价电离辐射的致突变能力,亦可作为电离辐射生物剂量计,用于估算个体受照剂量。γ-H2AX检测技术在辐射生物学研究、辐射分子流行病学调查,以及辐射事故应急响应与医学处置等方面具有重要应用价值。本文将重点阐述近十年来国内外基于电离辐射生物标志物γ-H2AX的检测方法研究进展和应用前景。     

模拟微重力诱导PC12细胞衰老的初步探讨

目的：构建模拟微重力条件下PC12细胞的培养体系,探讨模拟微重力对PC12细胞衰老的影响。方法：用Cytodex-3型微载体作为PC12细胞的贴附载体,旋转细胞培养系统所提供10-2g的微重力环境进行模拟微重力条件下的细胞培养。在倒置显微镜下观察PC12细胞的生长情况;用扫描电镜观察PC12细胞超微结构的变化;衰老相关β半乳糖苷酶（SA-β-gal）特异性染色对衰老的PC12细胞进行评估。结果：光镜下模拟微重力培养的PC12细胞表现出类衰老细胞的形态,扫描电子显微镜下观察发现其微绒毛增多。SA-β-gal染色的结果显示在模拟微重力的作用下,PC12细胞SA-β-gal的活性升高。结论：模拟微重力可以引起PC12细胞衰老样的形态变化,以及SA-β-gal的活性升高。     

齐墩果酸抑制肿瘤坏死因子-α诱导的成纤维细胞样滑膜细胞炎症因子表达及其机制研究

探讨齐墩果酸(Oleanolic acid,OA)对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导成纤维细胞样滑膜细胞的炎症因子表达的影响及其机制。首先复苏培养人成纤维细胞样滑膜细胞(FLS),通过RT-PCR检测细胞IL-6及IL-1βmRNA表达,采用Western blot方法检测p38MAPK及NF-κB蛋白表达变化,通过ELISA法检测细胞上清液中IL-6及IL-1β浓度。与对照组比较,TNF-α明显诱导FLS细胞IL-6及IL-1βmRNA的表达及上清液中IL-6及IL-1β的分泌(P0.05),同时磷酸化p38蛋白和核NF-κB明显增加(P0.05),且p38MAPK阻断剂SB203580能抑制TNF-α诱导的核NF-κB增加。OA呈浓度依赖性抑制TNF-α诱导的FLS细胞p38蛋白磷酸化和核NF-κB增加(P0.05)。且OA、p38MAPK通路抑制剂SB203580或NF-κB阻断剂BAY 11-7082均能抑制TNF-α诱导的IL-6及IL-1β分泌增加(P0.05)。综上所述,OA能抑制TNF-α诱导的FLS细胞炎症因子IL-6及IL-1β的产生,其机制可能与抑制p38MAPK/NF-κB信号通路有关。     

淫羊藿苷对博来霉素诱导的GC-1细胞DNA损伤的保护作用

该文旨在探究淫羊藿苷(icariin,ICA)对博来霉素(bleomycin,BLM)诱导的小鼠GC-1精原细胞DNA损伤的保护作用及其分子机制。将GC-1细胞分为正常对照组、BLM处理组(10 μg/mL)、BLM+不同浓度(0.5、1、2和4 μmol/L) ICA组。用不同浓度ICA预保护GC-1细胞12 h后加入BLM继续处理6 h,收集细胞,Western blot法检测DNA损伤相关蛋白γ-H2AX、DNA损伤修复相关通路蛋白(p-ATM、p-Chk1、p-P53和P21)、碱基切除修复(base excision repair,BER)相关通路蛋白(OGG1、APE1和XRCC1)的表达水平;免疫荧光技术检测γ-H2AX、8-OHdG表达与定位。结果表明,与正常对照组相比,BLM处理组中γ-H2AX、p-ATM、p-Chk1、p-P53、P21、OGG1、APE1和XRCC1的蛋白表达水平均显著上升,而ICA可浓度依赖性地下调BLM诱导的γ-H2AX、p-ATM、p-Chk1、p-P53、P21、OGG1、APE1和XRCC1蛋白表达水平。免疫荧光结果显示,与正常对照组相...     

AFAP1在博来霉素诱导的A549细胞衰老中的作用机制研究

目的:研究AFAP1在博来霉素诱导的A549细胞衰老模型中的作用及分子机制。方法:用50μg/m L的博来霉素处理A549细胞5天建立细胞衰老模型。用相同浓度的博来霉素处理细胞1-5天观察细胞从周期阻滞到衰老的过程,SA-β-Gal染色检测衰老细胞数目,用Western blot方法检测AFAP1、p21、c-Src等蛋白表达。过表达AFAP1后,观察细胞衰老状态及各蛋白表达水平变化。结果:50μg/m L的博来霉素处理A549细胞5天后可以建立细胞衰老模型,表现为BLM组SA-β-Gal阳性细胞数升高(P0.01)且细胞体积显著增大(P0.01),p21表达水平升高。在衰老的A549细胞中,AFAP1和激活型(Src p Y416)表达水平变化一致,从BLM处理后出现升高第4天开始明显下降在第5天最低,c-Src和Src p Y527表达水平不变。过表达AFAP1后再用博来霉素诱导,SA-β-Gal阳性细胞数及细胞体积、Src p Y416和p21表达与空载对照比较未发现有明显差异(P0.05)。结论:衰老的A549细胞中AFAP1表达下调,c-Src活性降低;过表达AFAP1不能减轻博来霉素诱导的A549细胞衰老,也不能抑制衰老细胞中的c-Src的活性下降。     

肺结核患者血清IFN-γ、Il-1β和TNF-α水平的临床检测价值分析

目的:研究肺结核患者血清γ干扰素(IFN-γ)、白介素-1β(Il-1β)以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平的临床检测价值。方法:选择2015年1月～2018年12月在北京市顺义区医院治疗的25例肺结核患者作为肺结核组,并且选择同期在该院进行体检的25例健康人作为对照组。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测并且比较肺结核组以及对照组研究对象的血清IFN-γ、Il-1β和TNF-α水平,比较痰菌阴性组(n=14例)以及痰菌阳性组(n=11例)、无空洞组(n=15例)以及有空洞组(n=10例)的血清IFN-γ、Il-1β、TNF-α水平。结果:肺结核组患者的血清IFN-γ、Il-1β、TNF-α水平均明显高于对照组(P0.05);痰菌阳性组肺结核患者的血清IFN-γ、Il-1β、TNF-α水平均明显高于痰菌阴性组患者(P0.05);有空洞组肺结核患者的血清IFN-γ、Il-1β、TNF-α水平均明显高于无空洞组患者(P0.05)。结论:肺结核患者的血清IFN-γ、Il-1β和TNF-α水平明显高于健康者,有助于判断疾病进程,这些细胞因子可能在结核病的发病中发挥着重要的作用。     

PML2过表达促进Zmpste24~(-/-)早衰小鼠胚胎成纤维细胞衰老

该研究以Zmpste24基因缺陷早衰小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)为模型,探索细胞核内亚结构PML NBs(promyelocytic leukemia nuclear bodies)与细胞衰老之间的关联。在Zmpste24野生型(+/+)和缺陷型(-/-) MEF细胞中过表达GFP-PML1和GFP-PML2及对照GFP,通过传代计数监测细胞增殖,β-gal染色检测细胞衰老,免疫荧光观察PML NBs结构形态、增殖标志物Ki-67和DNA损伤应答信号γH2AX。结果显示,过表达PML2而非PML1显著抑制Zmpste24~(+/+)和Zmpste24~(-/-) MEF细胞的增殖,降低Ki-67阳性细胞比例,削弱DNA损伤修复能力,加速细胞衰老。而且,过表达PML2促进Zmpste24~(-/-) MEF细胞衰老的效应比在Zmpste24~(+/+)细胞中更为显著。此外,对比Zmpste24~(+/+),在Zmpste24~(-/-) MEF细胞中过表达PML2可诱导更高比例的细胞产生线性PML NBs结构,且实验证明这种异常结构与细胞衰老紧密关联。     

H2O2诱导的2BS早老细胞中自噬体增多

自噬在细胞复制性衰老中起着重要的作用.然而,早老细胞中的自噬现象基本无相关的报道.本文通过外源性过氧化氢(H₂O₂)的诱导,构建人胚肺二倍体成纤维细胞（2BS细胞）早老模型.首先,通过SA-β-gal染色,验证细胞早老;从形态学和特异标志分子及雷帕霉素作用的靶位点(mTOR)信号通路不同角度检测自噬的变化,其中形态学检测包括丹（磺）酰戊二胺(MDC)自噬分子定量法及电镜自噬超微结构的观察;特异标志分子LC3的检测包括GFP-LC3自噬定位法和免疫印迹法检测LC3;及检测mTOR信号通路下游激酶p70S6蛋白的表达变化.结果表明,过氧化氢诱导的早老细胞中自噬体相对年轻细胞明显增多,且具有保护早老细胞的作用.     

SAHA对TGF-β诱导人胚肺成纤维细胞α-SMA蛋白及前胶原蛋白mRNA表达的影响

目的:探讨在转化生长因子-β 1(TGF-β1)刺激下,组蛋白去乙酰化酶抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)对人胚肺成纤维细胞系HELF向肌成纤维细胞(MF)分化时,α-SMA蛋白及前胶原蛋白mRNA表达的影响.方法:体外培养人胚肺成纤维细胞系HELF,并根据不同的实验目的分为空白对照组,TGF-β1处理组以及SAHA干预组.细胞处理结束后,用Western blot检测α-SMA表达,RT-PCR检测Ⅰ、Ⅲ型前胶原的mRNA表达水平.结果:空白对照组中几乎无α-SMA蛋白表达,TGF-β1处理后α-SMA水平显著增高,而SAHA能有效降低α-SMA的水平.SAHA孵育24h后,能够明显抑制TGF-βl刺激后的细胞表达Ⅰ型和Ⅲ型前胶原蛋白mRNA,并且具有明显的剂量依赖性.结论:SAHA能降低TGF-βl诱导HELF细胞向MF转化时α-SMA表达以及前胶原蛋白表达.     

HIV-1Tat蛋白抑制DNA修复和增强细胞辐射敏感性

近年来临床研究发现,艾滋病合并肿瘤患者放疗后产生的正常组织和皮肤毒性反应明显高于普通肿瘤患者.本研究将探讨HIV-1Tat蛋白是否影响细胞对电离辐射敏感性及机理. 两个表达Tat蛋白的细胞系TT2和TE671-Tat均来源于人的横纹肌肉瘤细胞（TE671）并已转染了不同来源的tat基因.使用细胞辐射后克隆形成率检测辐射敏感性,RT-PCR和Western 印迹检测基因表达,彗星电泳和γ-H2AX位点检测DNA双链断裂和修复. TT2和TE671-Tat细胞的辐射敏感性与转染空载体及对照细胞相比明显增加.彗星电泳和γ-H2AX位点检测表明,在表达Tat蛋白的细胞中,辐射诱导DNA双链断裂的修复水平明显降低.通过RT-PCR和Western 印迹检测进一步证实,表达Tat蛋白的细胞中DNA修复蛋白DNA-PKcs的表达被抑制. HIV-1Tat蛋白抑制DNA-PKcs的表达,降低DNA双链断裂的修复,使细胞的电离辐射敏感性增高.本研究为了解AIDS合并肿瘤患者对放射治疗敏感性变化提供了重要信息.     

丝裂霉素C诱导小鼠NIH-3T3细胞出现衰老相关分泌表型

衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)是指随细胞衰老而出现的分泌功能亢进,其分泌的因子参与细胞衰老、免疫调节、血管生成、细胞增殖及肿瘤侵袭等过程。与人类细胞相比,目前小鼠细胞的体外SASP模型尚十分缺乏,而建立该模型将为研究SASP的发生机制及生物学作用提供便利。为此,本文以INK4a基因座缺失(编码p16INK4a蛋白)的小鼠NIH-3T3细胞系及野生型小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEF)为研究对象,用丝裂霉素C(mitomycin C,MMC)诱导细胞DNA损伤,并通过细胞形态、衰老相关β-半乳糖苷酶(β-gal)活性染色、Ed U整合率、Western blot、定量RT-PCR及ELISA等检测方法,观察细胞的衰老情况及SASP因子的表达和分泌水平。结果显示,MMC(1μg/m L)处理12 h或24 h,并继续培养到第8天后,NIH-3T3细胞体积变大,β-gal染色阳性(蓝染)细胞的百分率明显升高,分别达到77.4%和90.4%,并伴有P21蛋白表达上调及Ed U整合率下降(P0.01)。同时,IL-6、TNF-α、IL-1α和IL-1β等常见SASP基因的m RNA表达水平显著上调,ELISA检测证明IL-6的分泌量亦显著升高(P0.01)。相反,尽管MMC处理12 h或24 h也能诱导野生型MEF出现细胞体积增大、β-gal染色阳性率升高(分别达71.7%和80.2%)及P21表达上调,但其IL-6的分泌量无显著上升。本研究表明,MMC能诱导NIH-3T3和野生型MEF出现细胞衰老,但只有NIH-3T3细胞出现了典型的SASP现象。衰老NIH-3T3细胞可能是研究小鼠SASP的合适模型。     

IL-1α、IFN-γ、TNF-α和NGF-β在胚胎后期皖西白鹅中脑的表达

用免疫组化SABC法研究白介素-1α(IL-1α)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和神经生长因子-β(NGF-β)在胚胎后期皖西白鹅中脑的表达与分布,并作统计学处理。结果发现,中央灰质层、中央白质层、室周灰质纤维层、半圆丘、峡核细胞胞质与突起阳性反应明显,其中峡核阳性反应最为明显,顶盖最不明显,且峡核大细胞部纤维着色明显;IL-1α在4种细胞因子中分布范围最广,阳性反应最强;IFN-γ与TNF-α阳性反应中,部分树突着色明显,且IFN-γ染色效果强于TNF-α;NGF-β的阳性突起与纤维较少。由结果可得,细胞因子可能是通过峡核-顶盖通路的作用,由峡核传递到顶盖;IL-1α在中枢神经系统中有重要作用;IFN-γ作为中枢神经系统介质的作用强于TNF-α。