OTX1基因慢病毒载体的构建及过表达研究

OTX1基因是神经发育调控中关键转录因子之一。本实验构建表达OTX1基因慢病毒载体,探讨慢病毒介导OTX1基因体外过表达的可行性。将OTX1基因克隆到慢病毒穿梭质粒DUET101内,构建表达OTX1以及GFP－OTX1基因的慢病毒载体;将pDUET－OTX1、pDUET－GFP－OTX1及pDUET101（空载体对照）质粒分别与慢病毒包装质粒pCMV R8.91、pMD.G共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带OTX1基因、GFP－OTX1基因的重组慢病毒DUET－OTX1、DUET－GFP－OTX1以及仅携带GFP基因的DUET－GFP;用重组慢病毒分别转导293T细胞、SY5Y细胞、小鼠胚胎干细胞及大鼠胚胎15天皮层神经干细胞,证实慢病毒载体能够将外源基因转导入不同细胞,且转导的OTX1或GFP－OTX1在不同细胞中均仅在细胞核内表达;培养OTX1单克隆抗体细胞,浓缩抗体上清,通过Western Blot以及细胞免疫荧光法证实慢病毒介导的OTX1基因及GFP－OTX1基因转导入293T细胞后的过表达。本实验证实慢病毒载体是高效的基因转移载体;OTX1作为发育过程中至关重要的转录因子,经过重组慢病毒体外转导后均只在细胞核内表达。     

慢病毒介导稳定表达FRT-LacZ基因的MDCK细胞株构建

[目的]通过慢病毒载体系统获得稳定表达FRT-LacZ基因的MDCK细胞株。[方法]PCR扩增FRT-LacZ基因,亚克隆至慢病毒载体p LVX-PGK-Puro。经四质粒包装系统共转染293FT细胞包装重组慢病毒并检测病毒滴度,获得的慢病毒感染MDCK细胞,经嘌呤霉素筛选和β-半乳糖苷酶原位染色检测筛选鉴定转基因细胞株。[结果]测序证实,成功构建重组慢病毒质粒p LVX-FRT-LacZ-PGK-Puro。包装产生的慢病毒滴度为4.04×107TU/m L,重组慢病毒感染MDCK细胞后筛选获得稳定表达FRT-LacZ基因的MDCK细胞株。[结论]构建了稳定表达FRTLacZ基因的MDCK细胞株。     

淀粉样肽Aβ导致线粒体功能紊乱的体内和体外研究

为探索阿尔茨海默症(AD)中β淀粉样肽(Aβ)对线粒体功能的影响,比较了稳定表达人野生型淀粉样前体蛋白(APP)的细胞和同时转入人Swedish突变APP及ΔE9突变PS1的双转细胞(swe.Δ9)的线粒体功能.结果发现,swe.Δ9细胞的线粒体膜电位、细胞色素c氧化酶活性、线粒体膜流动性、ATP含量均明显低于APP细胞,而APP细胞又明显低于对照的转入空质粒的细胞.在转基因小鼠上也得到类似结果:同时转入人Swedish突变APP和人PS1 M146V敲入的双转小鼠的细胞色素c氧化酶活性和ATP含量比只转入Swedish突变APP的Tg2576小鼠更低.结果证明了AD模型中线粒体功能损害程度与Aβ产量的正相关关系.     

大鼠Mettl9基因的克隆及其慢病毒表达载体的构建

目的:克隆大鼠Mettl9基因,并构建慢病毒表达载体,为研究Mettl9基因功能奠定基础。方法:提取原代培养大鼠星形胶质细胞的总RNA,应用RT-PCR方法,扩增出Mettl9基因的cDNA,克隆至pGEM-T载体上并测序;再将该基因亚克隆至慢病毒载体pLenti6.3-MCS-IRES-EGFP,测序鉴定,利用脂质体lipofectamine 2000转染至293T细胞进行包装,感染U251细胞,荧光显微镜下观察其表达。结果:Mettl9 cDNA的RT-PCR扩增产物为954 bp的基因片段,连接到pGEM-T载体后测序结果向GenBank递交获得收录号HQ898855;构建的pLen-ti6.3-Mettl9-IRES-EGFP慢病毒载体在293T细胞完成包装,测得慢病毒滴度达1.825×108TU/mL;经感染U251细胞,荧光显微镜下可见绿色荧光。结论:成功克隆了SD大鼠Mettl9基因,构建了该基因的慢病毒表达载体pLenti6.3-Mettl9-IRES-EGFP。     

小鼠白细胞介素IL-35基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

[目的]构建小鼠白细胞介素IL-35基因慢病毒表达载体并鉴定。[方法]通过PCR法扩增出小鼠IL-35基因片段,将其与经XhoⅠ和XbaⅠ双酶切的慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1连接,构建慢病毒重组质粒pLVX-IL-35-IRES-ZsGreen1。用无内毒素试剂盒提取重组质粒后,将其与病毒包装所需的3个辅助质粒共转染到人肾胚(HEK)293T细胞中包装能表达IL-35的慢病毒颗粒。该病毒培养上清经浓缩后,梯度稀释法检测其滴度。用浓缩后的病毒感染HEK293T细胞,然后通过荧光显微镜观察荧光蛋白的表达并结合RT-PCR法检测IL-35基因在该细胞中的表达。[结果]IL-35慢病毒表达载体构建成功,包装的慢病毒滴度为1×109TU/m L,通过荧光显微镜和RTPCR检测发现IL-35在HEK293T细胞中表达。[结论]成功构建IL-35慢病毒表达载体且IL-35蛋白能在HEK293T细胞中过表达。     

APPswe／PS1dE9／TAU三转基因阿尔兹海默病大鼠模型的建立

目的大鼠的大脑比小鼠更大,是研究神经系统的重要模型。建立APPswe／PS1dE9／TAU三转基因大鼠,发展能更全面表现人类阿尔兹海默病表型的动物模型。方法构建人PrP—hAPP695K595N／M596L、PrP-hPS1dE9和PDGF-TAU转基因表达载体,显微注射法制备转基因大鼠。PCR法鉴定转基因首建鼠及其子代基因型。Western blot检测转基因大鼠脑组织中人APP、PS1和TAU蛋白的表达。Morris水迷宫检测6月龄三转基因大鼠学习记忆能力改变。APP、PHF—TAU免疫组织化学染色观察三转基因大鼠脑组织APP及TAU的表达。结果得到1个同时高表达人APP、PS1和TAU三个基因的转基因大鼠品系。转基因大鼠6月龄已经出现显著的行为学改变：学习记忆能力下降,病理学改变表现为过度磷酸化TAU增多和神经元胞浆内AB表达异常增加。结论成功建立了APPswe／PS1dE9／TAU三转AD大鼠,可做为新一代工具动物模型用于基础医学和AD转化医学研究。     

海马神经元敲低MCU改善阿尔茨海默病小鼠学习记忆功能障碍

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种严重威胁老年人健康的神经退行性疾病,目前为止仍然缺乏有效的治疗方法。最新研究表明,线粒体功能紊乱是AD发展的直接原因。线粒体钙离子单向转运体(mitochondrial calcium uniporter,MCU)位于线粒体内膜,是线粒体Ca2+摄取的主要通道。MCU表达异常可引起线粒体钙稳态失衡,最终导致线粒体功能紊乱。本研究旨在明确敲低MCU对AD海马神经元和模型小鼠学习记忆功能的影响。以慢病毒和腺相关病毒为载体转染sh RNA,分别干扰海马神经元(HT22细胞)和淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)/早老素1 (presenilin 1, PS1)/tau AD转基因小鼠海马MCU表达,用MTS法检测HT22细胞活性,用Y迷宫和Morris水迷宫实验检测APP/PS1/tau转基因小鼠学习记忆功能障碍的变化。结果显示,MCU低表达可以逆转β淀粉样蛋白1-42 (amyloid beta protein 1-42, Aβ1-42)或冈田酸(okadaic acid, OA)...     

建立人α突触核蛋白A30P突变的帕金森病大鼠模型

目的建立人α-突触核蛋白(α-synuclein,α-SYN)A30P突变型转基因大鼠的帕金森病(Parkinson’s disease,PD)模型。方法利用慢病毒系统构建过表达野生型α-SYN载体pLKO-CMV-α-SYN-WT-P2A-GFP及α-SYN A30P突变载体pLKO-CMV-α-SYN-A30P-P2A-GFP,分别转染293FT细胞,瞬时转染24 h后WB检测α-SYN的表达水平。之后经慢病毒包装、浓缩,利用立体定位技术分别对大鼠中脑黑质致密部注射病毒稀释液,过表达α-SYN野生型和A30P突变型的慢病毒颗粒。免疫荧光染色检测α-SYN和酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)的分布情况,并观察中脑黑质致密部多巴胺能神经元数量的变化。Rotating rod实验评价注射A30P慢病毒大鼠的行为改变情况。结果野生型和突变型A30P的基因表达载体在293FT细胞内能够高表达α-SYN蛋白。TH免疫荧光结果显示:与病毒稀释液组相比,过表达α-SYN野生型和A30P突变型大鼠均能导致中脑黑质致密部多巴胺能神经元数量的减少,而α-SYN A30P慢病毒注射组的中脑黑质神经元缺失的更多,具有显著性差异。对A30P转基因大鼠脑部神经元缺失部位进行免疫荧光发现,该区域TH染色几乎呈阴性,α-SYN蛋白出现大量聚集,该结果表明脑部神经元的消失同时伴随着α-SYN蛋白的聚集及TH表达的剧烈减少,进一步揭示过表达α-SYN A30P可以导致多巴胺能神经元数量的减少和退化。此外,rotating rod实验结果显示过表达α-SYN A30P大鼠表现出明显的进行性运动能力障碍。结论通过慢病毒系统建立了人α-SYN A30P突变型转基因大鼠的PD模型,为PD发病机制的研究及药物开发奠定基础。     

小鼠resistin基因慢病毒表达载体构建及在KMB17细胞中的表达

[目的]构建携带小鼠resistin基因的慢病毒表达载体,并高效转导靶细胞。[方法]从小鼠脂肪组织提取总RNA,经PCR扩增、酶切、连接、转化后构建重组质粒;通过293T细胞包装为重组慢病毒颗粒,然后感染KMB17细胞,检测小鼠resistin基因在靶细胞中的表达。[结果]PCR扩增到预期的342 bp大小的resistin基因目的片段;构建的重组质粒经酶切得到了342 bp大小的目的片段,测序鉴定为小鼠resistin基因序列;重组慢病毒包装可观察到很强的绿色荧光,说明具有较高的质粒转染效率;重组慢病毒感染KMB17后可检测到小鼠resistin基因转录水平和蛋白水平的表达,证明resistin基因得到有效转导并可在靶细胞中高水平表达。[结论]成功构建了携带小鼠resistin基因的慢病毒表达载体并可在KMB17靶细胞中获得高效表达。     

高糖对海马神经元形态破坏和APP蛋白含量的影响

为探索高糖培养对原代海马神经元形态损伤和神经退行性相关蛋白β-淀粉样蛋白前体(amyloid β-protein precursor,APP)含量的影响,分离胎龄16 d的大鼠海马神经元,分别使用含有25 mmol/L、50 mmol/L、75 mmol/L和100 mmol/L葡萄糖浓度的Neurobasal培养基进行原代培养干预,Western-blot检测APP蛋白水平,光学显微镜下观察不同浓度葡萄糖作用后海马神经元形态的变化。结果发现:高糖培养后,胎鼠海马神经元突触变短,胞体肿胀,同时APP水平随着葡萄糖浓度的递增逐渐升高。以上信息提示高糖引发的神经元形态破坏与APP高水平有关,控制血糖可能有利于保护神经元细胞,使其免受损伤。     

携带荧光素酶基因肝癌细胞株的构建及在肝癌原位移植瘤模型中应用

[目的]构建稳定表达荧光素酶基因的人肝癌细胞株,建立可实时观察的肝癌原位移植瘤模型。[方法]构建含有萤光素酶基因的慢病毒载体,利用慢病毒三质粒系统磷酸钙共转染HEK 293T细胞,收集纯化病毒感染肝癌细胞SMMC7721,嘌呤霉素(puromycin)结合有限稀释法筛选稳定转导细胞株,将细胞原位注射裸鼠肝组织,建立原位肝癌动物模型。[结果]包装纯化的慢病毒悬液的滴度为8.4×106TU/m L,感染肝癌细胞后成功筛选到稳定表达的肝癌细胞株。利用该细胞株成功建立原位注射肝癌裸鼠模型,经活体荧光成像系统观察到肝癌细胞在活体动物体内的分布情况。[结论]荧光素酶肝癌细胞株的成功构建及利用该细胞株建立的原位移植瘤肝癌动物模型为肝癌的治疗研究奠定了基础。     

C/EBP β对APP基因的表达调控作用的研究

该研究成功地构建了C/EBP β过表达慢病毒载体,在体外人胚肾细胞(HEK293FT)进行病毒包装并感染小鼠海马神经元细胞(HT22)。通过荧光素酶报告基因实验(luciferase assay)检测C/EBPβ对淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)启动子活性的影响;通过实时荧光定量PCR(Q-PCR)来检测C/EBPβ对APP和Sp1在转录水平上的表达;通过蛋白免疫印迹分析(Western blot assay)检测C/EBPβ对APP和Sp1蛋白表达的作用。萤火虫荧光素酶分析结果显示,C/EBPβ对APP启动子的表达有正调控作用;Western blot和Q-PCR分析的结果表明,C/EBPβ对APP和Sp1基因的表达有正调控作用。C/EBPβ对APP基因表达的调控作用的机制可能在于C/EBPβ上调了内源性转录因子Sp1的基因表达,而Sp1基因表达的增强直接导致了APP基因表达的上调。     

ShRNA慢病毒表达载体的构建和病毒颗粒包装

<正>慢病毒载体主要用于感染对常规方法转染效率较低的细胞,如原代细胞等。慢病毒颗粒可同时感染增殖和非增殖的细胞,且感染比较稳定、持久。运用慢病毒载体,可实现特定基因的高表达,也可以表达ShRNA以RNAi方式下调某基因的表达。本文主要介绍ShRNA慢病毒表达载体的构建和病毒颗粒包装。实验步骤如下:     

灵芝多糖对AD模型大鼠海马组织Caspase-3和FasL表达的影响

目的研究灵芝多糖（GLP）对阿尔茨海默病（AD）大鼠海马组织半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白静3（caspase-3）和FasL基因以及空间学习记忆能力的影响。方法双侧海马内一次性注射淀粉样多肽25-35片段（Aβ25—35）制作大鼠AD模型,治疗组24h后腹腔注射灵芝多糖水溶液,1周后进行Morris水迷宫检测大鼠空间学习记忆能力变化。采用免疫组织化学法和逆转录-聚合酶链式反应法（RT-PCR）分别检测大鼠海马组织caspase-3蛋白的表达量和FasL基因的表达,以及灵芝多糖对上述各指标的影响。结果灵芝多糖能明显改善AD模型大鼠低下的空间学习记忆能力。显著降低模型大鼠海马组织caspase-3和FasL的表达,而且灵芝多糖能明显改善模型大鼠脑组织海马CAI区神经元的退行性变化。结论灵芝多糖能降低海马组织内FasL和caspase-3表达量,改善海马CAI区神经元的退行性变化。对老年性痴呆大鼠学习记忆能力可能有增强和提高作用。     

人CYP39A1基因过表达慢病毒载体构建及其在HepG2中表达

[目的]构建人CYP39A1基因过表达慢病毒载体,并建立CYP39A1基因过表达的HepG2细胞株,为研究CYP39A1在肝细胞肝癌中的作用机制奠定基础.[方法]构建具有嘌呤霉素抗性的CYP39A1慢病毒载体,经酶切鉴定及DNA测序鉴定后,包装成重组慢病毒颗粒;用嘌呤霉素筛选获得CYP39A1过表达的HepG2稳转细胞...     

大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体的构建

目的构建大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体,并检测其在神经元中的表达。方法采用PCR方法获得GluR2基因启动子区目的片段（-298～＋283）,双酶切后插入到pGL3-Basic载体中构成重组表达载体,使萤火虫荧光素酶报告基因的表达受GluR2启动子控制。将构建的重组表达载体或pGL3-Basic载体分别与内参质粒pRL—CMV（表达海肾荧光素酶）共转染原代培养皮质神经元,24h后用双荧光检测试剂盒测定萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶活性。结果重组表达载体经双酶切及测序鉴定证明构建正确,该重组表达载体在神经元中特异性高表达萤火虫荧光素酶。结论成功构建大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体,并检测到该载体在神经元中的特异性表达。     

MMP3慢病毒表达载体构建及其修饰的胚胎干细胞的作用

[目的]构建基质金属蛋白酶3(Matrix metalloproteinase3,MMP3)基因过表达慢病毒载体,修饰胚胎干细胞(ES)检测其对成纤维细胞的作用。[方法]克隆MMP3基因,构建EGFP标记的MMP3慢病毒表达载体,用GP2-293T细胞包装慢病毒,修饰ES细胞,与成纤维细胞3T3共培养。镜下观察绿色荧光蛋白表达,Western Blot检测MMP3和TGF-β蛋白表达。[结果]成功钓取MMP3基因,并构建慢病毒表达载体LV-MMP3-EGFP;在转染的GP2-293T细胞中表达绿色荧光蛋白;修饰后的ES细胞表达绿色荧光蛋白,72 h蛋白表达量最高,转染效率达到80%以上;被修饰细胞中MMP3蛋白表达高于对照组,其表达量是对照组的1.5倍;共培养后3T3细胞中TGF-β蛋白表达实验组与对照组无显著变化。[结论]LV-MMP3-EGFP修饰的ES细胞能够大量表达MMP3蛋白,作用于细胞外基质,但是对成纤维细胞中TGF-β表达没有显著影响(P0.05)。     

大鼠海马神经细胞VDAC1基因shRNA慢病毒表达载体的构建及干扰效果评价

目的:构建线粒体电压依赖性阴离子通道(VDAC1)短发卡样RNA重组慢病毒(LV)载体,沉默海马神经细胞VDAC1基因表达,观察所构建的慢病毒载体对海马神经细胞的干扰效果。方法:根据基因库提供的大鼠VDAC1基因的核苷酸序列(序列号为：AB039662.1),设计合成3条LV3-VDAC1-shRNA及1条无义的阴性表达载体;将构建好的慢病毒载体转染到海马神经细胞,按照不同的转染条件对细胞分为空载组、对照(NC)组、病毒组,分别在病毒感染复数(MOI)值在100和10的条件下进行转染;采用荧光定量PCR和Western blot的方法分别检测VDAC1基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。结果:与空载组相比,慢病毒感染组的扩增倍数均大于1,VDAC1基因在mRNA水平与蛋白水平表达均明显升高(P<0.05);与对照组相比,病毒感染复数(MOI)=10与MOI=100之间没有显著差异(P>0.05);PCR结果与Western blot结果综合来看,VDAC1转录水平表达越高,蛋白水平表达越低,呈现反向关联的状态。结论:三种慢病毒对海马神经细胞都有干扰效果,VDAC1基因的mR...     

大鼠过氧化物酶体增生因子激活受体γ基因慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的：构建大鼠过氧化物酶体增生因子激活受体γ（peroxisomeproliferator-activatedreceptorgamma）基因慢病毒表达载体,获得可供转染的滴度,为进一步研究该基因在肝星状细胞活化（Hepaticstellatecells,HSC）及肝纤维化中的作用机制提供物质基础。方法：大鼠PPAR-γ基因序列进行PCR扩增,与经AgeI酶切后的pGC-FU-3FLAG载体连接产生慢病毒载体表达质粒pGC-fu-3flag-PPARG,转化DH5α,PCR筛选阳性克隆,测序并转入293T细胞Western blot鉴定,而后将pGC-fu-3flag-PPARG,pHelper 1.0,pHelper 2.0三质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒,收集上清浓缩病毒测定病毒滴度。结果：DNA测序及Westernblot鉴定证实构建的大鼠PPAR-γ基因慢病毒表达载体pGC-fu-3flag-PPARG正确,浓缩慢病毒悬液的滴度为2×108TU/ml。结论：成功构建携带大鼠PPAR-γ基因的重组慢病毒表达载体。