木薯MeTPS9基因克隆及表达特性分析

旨在揭示木薯Me TPS9基因在干旱、低温、遮荫等非生物胁迫应答中的作用。用RT-PCR的方法从木薯叶片中克隆Me TPS9基因(Gen Bank登录号:MF276889),用MEGA软件构建系统进化树,用Dna SP软件分析基因结构变异,用Plant CARE分析启动子元件,用荧光定量PCR技术分析Me TPS9在不同组织中以及响应不同非生物胁迫的表达特性。结果显示,从木薯中克隆了一个TPS基因Me TPS9。该基因具有2 598 bp的开放阅读框,编码865个氨基酸,含有TPS家族保守结构域。系统进化树分析表明,Me TPS9与荠菜花和拟南芥中同源基因的亲缘关系较近,序列相似性分别为76.2%和75.6%。基因结构变异发现,木薯野生种和栽培种之间共有66个突变位点,其中11个为错义突变。启动子元件分析表明,Me TPS9含有干旱相关元件MBS、低温相关元件LTR、热胁迫相关元件HSE、以及ABA相关元件ABRE。实时荧光定量PCR分析表明,Me TPS9的表达量在须根中最高,在叶片中最低。而且,Me TPS9基因的表达能被干旱、低温、和遮荫处理显著诱导。Me TPS9在转录水平对木薯干旱、低温、和遮荫胁迫起调控作用,可作为候选基因进一步研究其在木薯抗逆中的作用。     

木薯MeNCED3基因克隆、结构变异及其表达分析

旨在揭示木薯MeNCED3基因在干旱等非生物胁迫应答中的作用。用RT-PCR的方法从木薯叶片中克隆MeNCED3基因,用MEGA软件构建进化树;用Dna SP软件分析基因结构变异,用荧光定量PCR技术分析MeNCED3在不同非生物胁迫下的表达特性。结果显示,从木薯中克隆了一个NCED基因MeNCED3,该基因具有1 803 bp的开放阅读框,编码600个氨基酸,含有NCED家族保守结构域。进化树分析表明,MeNCED3与杨树和杞柳中同源基因的亲缘关系较近,序列相似性分别达到83.9%和82.5%。基因结构变异发现,木薯野生种和栽培种之间共有8个错义突变,其中5个可能与MeNCED3的表达量有关。实时荧光定量PCR分析表明,MeNCED3在根中的表达量要远远高于叶片和茎。而且,MeNCED3的表达能被PEG、ABA和NaCl处理显著诱导。因此,MeNCED3在转录水平对木薯渗透胁迫、盐胁迫起调控作用,可作为候选基因进一步研究其在木薯抗旱中的功能。     

木薯MeTPP1基因克隆、结构变异及其表达分析

旨在研究木薯MeTPP1基因在干旱、低温等非生物胁迫响应中的作用。用同源基因克隆的方法从木薯叶片中克隆MeTPP1基因,用MEGA软件构建Neighbor-joining系统进化树,用Dna SP软件分析基因结构变异,用实时荧光定量PCR技术分析MeTPP1基因在不同胁迫处理下的表达特性。结果表明,MeTPP1基因含有一个1 131 bp的开放阅读框,编码376个氨基酸,含有TPP家族保守结构域。系统进化树分析表明,MeTPP1与杨树和杞柳中同源基因的亲缘关系较近,序列相似性分别为77.8%和74.5%。基因结构变异发现,MeTPP1在木薯野生种和栽培种之间共有9个错义突变,它们可能与MeTPP1的表达有关。实时荧光定量PCR分析表明,MeTPP1表达量受到干旱、低温和ABA处理的响应。上述结果表明,MeTPP1在转录水平参与ABA介导的木薯干旱和低温胁迫,可作为候选基因进一步研究其在木薯抗逆中的功能。     

木薯MeHB2转录因子的克隆与表达分析

该研究以木薯(Manihot esculenta Crantz)Ku50为实验材料,采用RT-PCR方法从叶片中克隆了1个HD-Zip基因MeHB2。MeHB2基因含有882bp的开放阅读框,编码293个氨基酸。蛋白质保守结构预测显示,MeHB2编码的蛋白含有Homeodomain、Leu zipper和HD-Zip_N等结构域,属于HD-Zip II成员。进化树分析表明,MeHB2与麻疯树、杨树和杞柳中同源基因的亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析表明,低温胁迫、渗透胁迫、ABA和H2O2均可诱导MeHB2基因的表达,而盐胁迫抑制其表达。此外,MeHB2的表达量还受到遮荫胁迫的诱导。研究表明,MeHB2在木薯非生物逆境调控中扮演重要角色。     

木薯MeASR基因克隆及表达分析

脱落酸-胁迫-成熟诱导蛋白(Abscisic acid-stress-ripening,ASR)在植物对非生物逆境胁迫的应答过程中发挥着重要作用。利用PCR技术从木薯中克隆了第一个ASR基因Me ASR,序列分析表明该基因开放阅读框(ORF)330 bp,编码109个氨基酸。多序列比对和进化树分析表明该基因所编码的蛋白具有ASR家族蛋白的保守结构域,与番茄ASR家族蛋白Sl ASR4具有较近的亲缘关系。亚细胞定位分析表明Me ASR定位在细胞核,实时荧光定量PCR分析表明该基因的表达显著受渗透胁迫和ABA诱导。结果表明,Me ASR可能作为转录因子参与木薯对干旱逆境胁迫应答及ABA信号调节。     

苹果叶绿素合成关键酶基因MdHEMA1生物信息学和表达分析

HEMA1编码谷氨酰-tRNA还原酶(Glu TR)的合成,是叶绿素生物合成的关键酶基因。本研究利用RACE技术从苹果叶片中克隆Glu TR的编码基因,将其命名为MdHEMA1。生物信息学分析表明:MdHEMA1基因位于苹果8号染色体上,其CDS长1638 bp,编码545个氨基酸残基,蛋白分子量为59279.4 Da,等电点为8.45。蛋白序列及结构分析显示该蛋白包含保守的谷氨酰-tRNA还原酶的N端结构域、莽草酸/奎尼酸脱氢酶结构域及谷氨酰-tRNA还原酶二聚结构域。进化树分析显示MdHEMA1蛋白与白梨(Pyrus×bretschneideri)Pb HEMA1亲缘关系最近。qRT-PCR结果显示,MdHEMA1在根、茎、叶、花、果实各组织器官中均有表达,但光合组织(茎、叶、果实)中的表达水平较高;该基因在叶片和果实不同发育期表达存在差异,表达量与叶片和果实内叶绿素含量变化趋势一致;而且干旱胁迫能够诱导该基因表达。启动子分析显示MdHEMA1基因启动子区域含有多种非生物胁迫相关的顺式作用元件。     

巴西橡胶树HbCPP1基因的克隆与表达分析

CPP基因家族是广泛存在于动植物中,成员数目较少的一类转录因子家族,在植物生殖发育和细胞分裂过程中起着重要的调控作用。本研究以橡胶树优良品种‘热研7-33-97’为供试材料,通过RT-PCR方法,在橡胶树花器官中克隆到一个CPP基因,命名为Hb CPP1(登录号为MF360959)。序列分析表明,Hb CPP1基因开放阅读框为1 755 bp,编码584个氨基酸,蛋白质分子量为63.676 k Da,等电点(PI)为8.4。序列多重比对结果显示,HbCPP1蛋白具有CPP蛋白的特征基序,含有2个保守的CXC结构域和1个比较保守R结构域。进化树分析表明,Hb CPP1属于A亚族基因,与其近缘物种木薯的Me CPP基因以及麻风树的Jc CPP7基因同源性较高,进化关系较近。氨基酸组分、理化性质以及蛋白结构预测分析显示,Hb CPP1蛋白是一个不具有跨膜结构和信号肽的不稳定亲水蛋白,可能定位于细胞核,其二级结构主要由两个蛋白结合区域和多个无规则的卷曲螺旋组成,其三级结构中CRC结构域构成了该蛋白的核心结构。利用QRT-PCR对Hb CPP1基因在橡胶树不同组织中的表达量进行检测,分析结果表明Hb CPP1基因在橡胶树茎尖、花序以及雌花中特异性高调表达。在干旱、盐、高温胁迫以及ABA处理下,Hb CPP1基因的表达量呈显著下调表达;而在低温处理下,Hb CPP1基因的表达量则呈显著上调表达,推测Hb CPP1基因可能参与了橡胶树花器官发育以及对多种非生物学胁迫的响应过程。     

杨树ERF11转录因子基因应答渗透胁迫表达分析

从小黑杨(Populus simonii×P.nigra)叶片中克隆出732 bp的ERF11转录因子基因(Potri.011G057000.1)cDNA,其编码的蛋白含有243个氨基酸,属于不稳定的亲水蛋白,不存在信号肽,不具跨膜能力,含AP2/ERF家族保守结构域。系统进化树表明,小黑杨ERF11蛋白与胡杨、麻疯树、蓖麻、橡胶树、木薯遗传距离较近,说明其亲缘关系较近。亚细胞定位结果表明,ERF11蛋白定位于细胞核中。ERF11基因表达具有组织特异性,并受胁迫诱导表达。其在根中相对表达水平明显比在茎和叶中表达水平高,在盐和甘露醇胁迫下,基因均表现上调表达。表明ERF11转录因子基因可能与植物应答高盐和干旱胁迫相关。     

木薯磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因全长cDNA克隆及表达分析

应用巢式PCR从木薯栽培种(Manihot esculenta)Arg7和野生种W14(M.esculenta subsp.flabellifolia)叶片中克隆到磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因pepc全长cDNA,GenBank序列号为JN387052和JN387053。cDNA全长2945 bp,含1个2895 bp的开放阅读框,预测编码的蛋白含964个氨基酸,具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶保守结构域。木薯PEPC与麻疯树和蓖麻的PEPC氨基酸序列具有高度同源性。表达分析表明pepc在W14和Arg7叶中的表达量最高,其次是须根和块根,茎中最低。单日表达量动态分析表明,Arg7叶中pepc总体表达量高于W14,但是16∶00后W14高于Arg7,推测两种木薯pepc调控区域存在差异。     

苦荞转录因子基因FtbHLH3的克隆及其非生物胁迫下的表达分析

根据苦荞花期转录组数据,采用RT-PCR技术和PCR技术克隆得到一条新的b HLH类蛋白基因FtbHLH3(登录号:KU296217),并分析了逆境胁迫下该基因在芽期苦荞胚轴和子叶中的表达量。结果显示,Ftb HLH3基因cDNA全长1 273 bp,包含一个957 bp的开放阅读框,编码蛋白含318个氨基酸。蛋白结构域分析表明,FtbHLH3编码蛋白N-端和C-端分别含有一个bHLH家族典型的结构域。系统进化树分析表明,FtbHLH3与其它植物参与抗逆的bHLH蛋白聚为一簇。荧光定量PCR分析表明,UV-B处理苦荞后,胚轴中FtbHLH3相对表达量在6 h内缓慢增加至1.08,12 h后显著上升至48 h的2.96;而子叶中FtbHLH3相对表达量在3 h后就显著上升,至24 h达到最大值6.64后趋于稳定。4℃冷处理苦荞后,胚轴和子叶中FtbHLH3相对表达量均随时间持续上升,并在48 h后达到最大值,分别为3.22和10.27。可见,本研究克隆的Ftb HLH3基因可能参与了苦荞对UV-B和寒冷等非生物胁迫的应答反应。     

盐胁迫下盐穗木HcThi1基因的表达分析

环境胁迫能够导致植物的DNA损伤,而DNA损伤修复基因与盐胁迫可能具有密切的相关性。根据盐穗木盐胁迫下响应的转录组测序结果,克隆获得了盐穗木具有DNA损伤修复功能的硫胺素噻唑合成酶(thiazole biosynthetic enzyme)基因,其开放阅读框1 077 bp,编码358个氨基酸,命名为HcThi1。保守结构域分析显示,保守结构域分析发现其具有SDR超家族保守结构域,合成硫胺素噻唑。系统进化树分析显示HcThi1为独立的分支,亚细胞定位于细胞质,为无信号肽的不稳定蛋白。实时荧光定量PCR分析表明,在100 mmol/L NaCl胁迫72 h后,同化枝中HcThi1的表达迅速上调并达到最大值,约为对照组的18.66倍,随着盐浓度的提高,HcThi1的表达逐渐降低。说明HcThi1基因表达受盐胁迫的诱导。研究结果有助于阐明HcThi1基因表达与植物抗盐的相关性。     

野生大豆盐碱胁迫相关GsTIFY11b的克隆与功能分析

以耐盐碱野生大豆(Glycine soja L.G07256)为材料, 采用同源克隆方法和RT-PCR技术获得一个TIFY 类基因的全长cDNA(命名为GsTIFY11b)。进化树分析表明, 与其他物种相比, GsTIFY11b与拟南芥的AtTIFY11a基因相似性最高, 达到56%; 序列分析表明GsTIFY11b蛋白除具有 TIFY保守结构域外, 还具有一个N端保守结构域和一个C端保守的Jas结构域; 实时荧光定量PCR结果显示该基因受盐和碱胁迫诱导表达; 将GsTIFY11b转化拟南芥来验证其耐盐碱功能, 获得两个转基因纯合体株系, 盐碱胁迫分析结果表明, GsTIFY11b的超量表达没能提高拟南芥对盐碱胁迫的耐性, 并且与野生型相比, 转基因植株在种子萌发期和苗期表现出对盐胁迫更加敏感。盐胁迫信号通路相关marker基因在转基因拟南芥中的表达特性分析表明, GsTIFY11b可以调控RD29B、KIN1、DREB等基因的转录。在洋葱表皮细胞中瞬时表达GsTIFY11b-GFP融合蛋白的结果表明, GsTIFY11b定位于细胞核中。上述结果表明, 该基因在细胞核中起着转录调节子的作用, 可能是通过调控盐胁迫信号通路中关键基因的表达来改变植物对盐胁迫的耐受性。     

野生大豆盐碱胁迫相关GsTIFY11b的克隆与功能分析

以耐盐碱野生大豆(Glycine soja L.G07256)为材料,采用同源克隆方法和RT-PCR技术获得一个TIFY类基因的全长cDNA(命名为GsTIFY11b)。进化树分析表明,与其他物种相比,GsTIFY11b与拟南芥的AtTIFY11a基因相似性最高,达到56%;序列分析表明GsTIFY11b蛋白除具有TIFY保守结构域外,还具有一个N端保守结构域和一个C端保守的Jas结构域;实时荧光定量PCR结果显示该基因受盐和碱胁迫诱导表达;将GsTIFY11b转化拟南芥来验证其耐盐碱功能,获得两个转基因纯合体株系,盐碱胁迫分析结果表明,GsTIFY11b的超量表达没能提高拟南芥对盐碱胁迫的耐性,并且与野生型相比,转基因植株在种子萌发期和苗期表现出对盐胁迫更加敏感。盐胁迫信号通路相关marker基因在转基因拟南芥中的表达特性分析表明,GsTIFY11b可以调控RD29B、KIN1、DREB等基因的转录。在洋葱表皮细胞中瞬时表达GsTIFY11b-GFP融合蛋白的结果表明,GsTIFY11b定位于细胞核中。上述结果表明,该基因在细胞核中起着转录调节子的作用,可能是通过调控盐胁迫信号通路中关键基因的表达来改变植物对盐胁迫的耐受性。     

茶树CsTMFs的克隆与表达分析

基于茶树全基因组数据,筛选鉴定茶树（Camellia sinensis(L.)O. Ktze.）TATA元件调控因子（TATA element modulatory factor,TMF）CsTMFs家族成员。克隆茶树叶片中CsTMFs编码区序列（coding sequence,CDS）全长。使用生物信息学方法对CsTMFs的保守结构域、基因结构、理化性质、蛋白质二级结构和系统发育关系进行分析。基于转录组数据进行组织特异性表达的分析,利用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time fluorescent quantitative PCR,qPCR）方法检测冷胁迫和干旱胁迫下CsTMFs在茶树叶片中的表达情况。结果表明,CsTMFs家族有2个CsTMF基因,序列CDS区长度分别为2 934和2 904 bp,均具有TMF-DNA-bd和TMF-TATA-bd完整保守结构域。CsTMF1和CsTMF2具有组织表达特异性,CsTMF1在花与茎中表达较高,CsTMF2在成熟叶与茎中表达较高。CsTMF1受冷胁迫诱导,CsTMF2受冷胁迫和干旱胁迫抑制。     

小麦TaNAC5基因克隆及表达分析

NAC转录因子在植物对非生物逆境胁迫的应答过程中发挥着重要作用。该研究利用RACE技术从小麦中克隆了1个NAC基因TaNAC5(HQ650113.1)。序列分析显示,TaNAC5基因开放阅读框(ORF)924bp,编码307个氨基酸。多序列比对和进化树分析显示,TaNAC5基因所编码的蛋白具有NAC家族蛋白的保守结构域,与玉米ZmNAC5有较近的亲缘关系。实时荧光定量PCR分析显示,TaNAC5基因的表达显著受渗透胁迫、低温胁迫、乙烯和双氧水诱导,而受高盐胁迫和ABA抑制。研究表明,TaNAC5参与非生物逆境胁迫及相关信号分子的应答。     

旱麦草EtAP2基因的克隆及其对干旱胁迫的响应表达

以旱麦草(Eremopyrum triticeum)为实验材料,利用RT-PCR技术从旱麦草叶片中克隆了1个AP2/ERF家族基因,命名为EtAP2(GenBank登录号KX622583)。EtAP2基因含有1 128bp开放阅读框,编码375个氨基酸,相对分子质量40.87kD,等电点为5.36。多序列比对和进化树分析表明,该基因编码蛋白具有2个AP2保守结构域,与小麦AP2/ERF家族蛋白具有较近的亲缘关系。实时荧光定量PCR分析表明,15%PEG 6000模拟干旱胁迫可诱导EtAP2基因在根和叶中表达,且在根中对干旱胁迫的响应大于叶片。研究表明,EtAP2可能参与旱麦草对干旱逆境胁迫应答的调节。     

巴西橡胶树赤霉素信号转导途径HbRGA1结构和功能分析

DELLA蛋白是赤霉素激素信号负调控因子,具有抑制植物生长发育的作用。解析其家族成员结构与功能将有助于揭示橡胶树DELLA蛋白家族成员调控橡胶树生长发育的机制。本研究从橡胶树热研73397叶片中克隆HbRGA1的cDNA全长序列。该基因长为2136 bp,含1839 bp的ORF,编码613个氨基酸。HbRGA1蛋白序列包含DELLA和GRAS保守结构域,与杨树、木薯和橡胶树DELLA基因相似性高达82.5%。qRT-PCR分析发现HbRGA1在橡胶树叶片中表达量高,在树皮和胶乳中表达量极低。叶片中HbRGA1表达量受喷施赤霉素和脱落酸等诱导显著上调。本研究表明HbRGA1与橡胶树赤霉素等激素信号密切相关,为深入研究其在橡胶树生长发育中的结构和功能打下良好基础。     

小桐子MYB基因家族的鉴定及JcMYB308基因的克隆与低温表达分析

MYB转录因子家族参与植物生长发育及对环境胁迫的应答等过程。该实验基于小桐子基因组数据库,对MYB基因家族进行鉴定,克隆了小桐子Jc MYB308基因,并对其功能结构域、系统进化、基因结构及低温表达特性进行了分析。结果表明,小桐子全基因组共鉴定到213个MYB基因家族成员,聚类为6个亚家族。克隆的Jc MYB308基因片段长度为713 bp,基因结构具有较高的保守性,均含有两个外显子,进化树显示其与同属大戟科的蓖麻亲缘关系最近,序列一致性为62.7%。q RT-PCR表达分析表明,小桐子Jc MYB308基因的表达存在组织表达特异性,在根中表达量较高,而在叶片中表达量相对较低,在根与茎中低温胁迫24 h时达到最大表达量。     

花花柴KcbHLH71基因的克隆及表达分析

高温胁迫可引起植物体内生长素类激素含量和活性变化,也可影响其生理生化过程进而产生胁迫蛋白以提高自身抵抗或适应逆境的能力。根据高温胁迫下花花柴转录组测序分析结果,发现生长激素合成相关基因bHLH显著上调,通过PCR克隆获得该基因碱基序列,命名为KcbHLH71,并利用定量PCR对高温胁迫下该基因的表达模式进行分析。结果显示,花花柴KcbHLH71基因完整ORF为1 038 bp,编码345个氨基酸,分子量大小为38.8 kD,pI为6.8;编码蛋白含有b HLH蛋白家族的特征基序列和保守结构域,有信号肽,无跨膜结构,定位于细胞核。系统发育结果显示花花柴KcbHLH71与菊科的向日葵、莴苣bHLH71蛋白的相似性分别为88%和83%,即认为它们同源性最高,亲缘关系最近。表达分析结果显示,高温胁迫下,花花柴KcbHLH71基因2 h的表达量受到最大抑制,之后逐渐上升,当12 h时达到高峰,12～24 h再次出现下降,但仍高于对照水平。以上研究结果表明,高温可以显著诱导KcbHLH71基因的表达,推测该基因可能参与花花柴响应高温胁迫的正调控。     

葡萄VvBAP1基因的克隆及表达特性分析

以抗性葡萄品种‘F-242’组培苗为材料, 利用同源克隆法克隆了葡萄VvBAP1基因。测序结果显示, VvBAP1扩增片段大小为531 bp, 可编码176个氨基酸序列。利用生物信息学分析VvBAP1基因编码的蛋白序列显示, 该蛋白分子量为19.43 kDa, 含有保守的钙离子依赖性的C2结构域; 等电点pI为9.42; 不稳定系数为37.09, 推测为稳定的亲水性蛋白; 含有多个丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点。实时荧光定量PCR表明, 该基因在根茎叶中均有表达, 其中在叶片中表达量较高; 盐胁迫、低温等逆境因子及逆境相关的信号物质, 如水杨酸和一氧化氮均可诱导VvBAP1的表达, 其中低温对其表达量影响更为显著, 推测该基因参与了葡萄抵御逆境胁迫的过程, 尤其是与低温相关的过程。