家蚕细胞和虫体产生抗人小细胞肺癌抗体

用重组昆虫病毒表达系统,在家蚕细胞和虫体表达了抗人小细胞肺癌人-鼠嵌合抗体。重组病毒rNPVL2,rNPVH17及双重组病毒rNPVLH19感染的家蚕细胞和虫体血淋巴中都检测到抗体分子的表达。双重组病毒的双基因共表达部分产物可装配。ELISA分析表明抗体重轻链基因共表达产物具有比单基因表达产物高得多的与小细胞肺癌细胞免疫结合功能。     

猴B病毒被膜糖蛋白gC的原核表达及诊断价值评价

目的:原核表达猴B病毒糖蛋白gC胞外区片段,评价其在猴B病毒血清学检测中的特异性和敏感性,为猴B病毒检测奠定基础。方法:利用PCR方法扩增gC胞外区基因片段,同时合成该片段的优化密码子序列,将其插入表达载体pET-28b(+)形成重组质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3)并进行诱导表达;纯化蛋白先以Western印迹进行验证,再以ELISA方法和标准阳性、阴性血清评价其诊断价值。结果:直接从病毒DNA模板上获得的基因片段未能表达,而优化后的基因片段表达水平较高,表达蛋白的相对分子质量约为48×103,为包涵体形式,占菌体总蛋白的30%左右;Western印迹显示,重组蛋白能与猴B病毒阳性血清和His单克隆抗体发生免疫反应;34份标准阳性血清和25份阴性血清的ELISA检测结果显示,重组蛋白的敏感性和特异性分别为94.1%(32/34)和100%(25/25)。结论:利用原核表达系统制备的gC胞外区重组蛋白,可作为猴B病毒血清学检测抗原,其特异性和敏感性都较好。     

猪瘟病毒T细胞表位E290多肽与猪细小病毒VP2蛋白在干酪乳杆菌中的共表达及免疫小鼠特异性抗体的测定

将分别编码猪瘟病毒T细胞表位E290多肽和猪细小病毒主要保护性抗原VP2蛋白的重组基因插入干酪乳杆菌分泌型表达载体pPG中,构建了重组表达载体pPG-VP2-E290,将其电转化干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393,获得了猪瘟病毒T细胞表位E290多肽与猪细小病毒VP2蛋白的乳酸菌共表达系统,经2%乳糖在MRS培养基中的诱导表达,对诱导表达的菌体及培养上清液进行SDS-PAGE检测表明,有约70kDa蛋白得到了表达,表达蛋白的大小与理论值相符。Western blot分析结果表明所表达的蛋白具有与天然病毒蛋白一样的抗原特异性。以诱导表达上清液作为抗原进行的间接ELISA实验也表明,重组的目的蛋白获得了分泌表达。将该重组干酪乳杆菌经口服接种途径免疫BALB/c小鼠,收集粪便样品检测小鼠产生抗PPV的特异性sIgA抗体,采集血液样本检测血清中抗PPV及抗E290的特异性IgG。结果表明分泌型的重组菌pPG-VP2-E290/L.casei 393免疫小鼠能够产生明显的抗体水平,为重组猪瘟与猪细小病毒乳酸菌口服活菌疫苗的研制奠定了重要的物质基础。     

猴B病毒囊膜蛋白gB特异性抗原表位的筛选与表达鉴定

目的筛选和鉴定猴B病毒囊膜蛋白gB的特异性抗原表位,将其应用于B病毒的检测。方法利用蛋白序列比较和表位预测技术筛选猴B病毒囊膜蛋白gB的特异性抗原表位,经PCR扩增后原核表达,纯化,Western-blot鉴定融合蛋白,建立特异性表位的ELISA检测方法 ,并对其效果进行评估。结果琼脂糖凝胶电泳和测序结果显示出目的表位基因完全正确,并且重组蛋白经过SDS-PAGE、Western-blot鉴定,其相对分子质量约为27×10^3,与预期值相符。筛选出的gB-26肽表位检测结果与文献相符,特异性较好,敏感性稍低。结论建立了猴B病毒囊膜蛋白gB特异性抗原表位筛选和鉴定的实验方法 ,为进一步研制猴B病毒快速诊断试剂盒和猴B病毒亚单位疫苗奠定了基础。     

单克隆抗体对小苍兰褪绿条纹花叶病毒及其决定簇的作用特性

采用杂交瘤技术,得到抗小苍兰褪绿色条纹花叶病毒（FCSMV）六个单克隆抗体P3、4A4,6B、,7A6,7D1和7DS。ELISA效价分别为1：1062－1：10^6。7A6攻7D1属于IgG1亚类,7D8和4A4分属IgG2a和IgG2b亚类,P3和6B1属于IgG2亚类。电镜观察单克隆抗体与病毒形成的复合物发现7D1能使病毒粒子发生严重裂断。6株单克隆抗体中P3,4A4、6B1对应于病毒外壳蛋白上的顺序决定簇。纯化的病毒外壳蛋白经酶裂解和改进的盘状电泳分离,得到八段与多克隆抗体反应的收集液。用顺序决定族的单克隆抗体检出P3对应的肽段22和4A4对应的肽段78。本文还讨论了7D1使病毒粒子发生断裂的原因和与病毒粒子表面结构的关系以及分离抗原决定族所在片段的意义。     

表达增强型绿色荧光蛋白标记的hBax 和hHGF 双基因的慢病毒 载体构建

目的:构建绿色荧光蛋白标记的hBax和hHGF双基因共表达的重组慢病毒并鉴定。方法:通过重叠PCR技术构建attB1-K-hBAX/T2A/eGFP/P2A/hHGF-attB2基因片段,利用gateway technology构建慢病毒载体质粒pLV.EX2d.null-EF1A>hBAX/T2A/eGFP/P2A/hHGF和阴性对照质粒pLV.EX2d.null-EF1A>eGFP并测序,上述两种质粒分别与辅助质粒共转染293FT细胞包装病毒,荧光显微镜检测病毒滴度。结果:经鉴定慢病毒载体质粒构建正确,荧光显微镜检测hBax和hHGF共表达慢病毒滴度为7.8×107TU/mL,仅表达绿色荧光蛋白的阴性病毒滴度为9×107TU/mL。结论:表达增强型绿色荧光蛋白标记的hBax和hHGF双基因的慢病毒构建成功并获得高滴度的病毒感染液。     

辛德毕斯病毒E2包膜蛋白可溶性表达条件的优化

目的:通过优化表达条件,提高辛德毕斯病毒E2包膜蛋白胞外区的可溶性表达量。方法:构建含E2基因胞外区的重组表达质粒pGEX-6p-1-E2,筛选合适宿主菌和诱导温度,并构建5种分子伴侣共表达系统(即pG-KJE8、 pGro7、pKJE7、 pG-Tf2和pTf16 5种分子伴侣质粒分别与重组表达质粒pGEX-6p-1-E2共表达),筛选最适分子伴侣质粒。结果:(1)E2蛋白的表达量在E.coli BL21、BL21 (DE3) pLysS、Rosetta (DE3)及Origami B (DE3) 4种表达菌中没有明显差别;(2)16℃诱导时E2蛋白在上清中可溶性表达量最高;(3)分子伴侣质粒pG-Tf2使目的蛋白的可溶性表达量提高了15.7%,作用最为显著。结论:通过优化表达条件及使用分子伴侣共表达系统提高了E2蛋白的可溶性表达,为进一步E2蛋白的相关研究奠定了基础。     

禽流感病毒H5N1亚型HA基因表达及其产物的应用

根据GenBank公布的禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因(HA)(GenBank:DQ023145)序列设计一对引物P1、P2,以重组质粒pUC-HA为模板扩增去除信号肽的HA成熟蛋白。PCR产物克隆入pMD18-T载体,经测序发现在967位A突变为T,形成一个终止密码子TAA。在突变位点附近设计两条有21个碱基配对的突变引物P3、P4,采用重叠延伸剪切法(SOE)用A定点替换T碱基,然后将正确的基因片段定向插入到表达载体pET-32a( )中,诱导表达获得正确的表达产物。Western-blot分析表明,表达的重组蛋白能与经BL21(DE3)大肠杆菌菌体裂解液处理的H5亚型禽流感病毒阳性抗血清发生特异性反应。利用纯化的重组HA蛋白初步建立了检测H5亚型禽流感病毒抗体的间接ELISA方法,该方法可以代替传统的血凝与血凝抑制方法用于区分禽流感病毒的血清亚型。本研究为禽流感病毒亚单位疫苗及新型诊断试剂盒的研究奠定了基础。     

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和M融合蛋白的重组腺病毒的构建及其对小鼠的免疫原性

利用口蹄疫病毒(FMDV)2A蛋白具有自我裂解的功能,将其作为连接肽将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的GP5和M蛋白编码基因串联,置于复制缺陷型腺病毒载体的表达盒中,通过一次转录和翻译,可以同时实现2个蛋白的表达,以发挥GP5蛋白的病毒中和优势和M蛋白的细胞免疫优势作用。分别利用RT-PCR、间接免疫荧光和Western blotting等方法,对获得的重组腺病毒(rAd-GP5-2A-M)进行检测,结果均证明GP5-2A-M蛋白不仅获得了正确表达,而且能自我裂解为GP5和M蛋白。以单独表达GP5(rAd-GP5)、M(rAd-M)和融合表达GP5-M(rAd-GP5-M)的重组腺病毒为对照,研究该重组腺病毒在小鼠体内诱导免疫应答情况,结果表明,虽然4种重组腺病毒均能诱导小鼠产生特异性抗体和细胞免疫反应,但重组腺病毒rAd-GP5-2A-M所诱导产生的体液免疫和细胞免疫应答水平最高。本研究结果提示,利用具有自动裂解功能的FMDV2A多肽构建PRRSV复合基因工程疫苗是一种切实可行的新策略,也为构建其他动物病毒病的基因工程疫苗提供了新思路。     

禽流感病毒H5N1亚型HA基因表达及其产物的应用

根据GenBank公布的禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因 (HA) (GenBank DQ023145) 序列设计一对引物P1、P2,以重组质粒pUC-HA为模板扩增去除信号肽的HA成熟蛋白. PCR 产物克隆入pMD18-T载体,经测序发现在967位A突变为T,形成一个终止密码子TAA. 在突变位点附近设计两条有21个碱基配对的突变引物P3、P4,采用重叠延伸剪切法 (SOE) 用A定点替换T碱基,然后将正确的基因片段定向插入到表达载体pET-32a (+) 中,诱导表达获得正确的表达产物.Western-blot分析表明,表达的重组蛋白能与经BL21(DE3)大肠杆菌菌体裂解液处理的H5亚型禽流感病毒阳性抗血清发生特异性反应.利用纯化的重组HA蛋白初步建立了检测H5亚型禽流感病毒抗体的间接ELISA方法,该方法可以代替传统的血凝与血凝抑制方法用于区分禽流感病毒的血清亚型.本研究为禽流感病毒亚单位疫苗及新型诊断试剂盒的研究奠定了基础.     

猿猴疱疹病毒B糖蛋白D的表达及抗原性的探讨

目的表达猴B病毒糖蛋白D(BVgD)并对其抗原性进行初步研究。方法应用体外原核表达BVgD,继而进行Ni离子亲和层析纯化。采用Western blotting对蛋白抗原性进行分析,评估其抗原潜力。结果完成了对BVgD的小量表达和纯化。Western blotting结果表明表达出的重组蛋白BVgD具有特异性结合猴B病毒抗体的能力。结论BVgD重组蛋白具有良好的抗原性,与HSV-1抗体无交叉反应。具有进一步开发的潜力,也为BVgD免疫原性等方面的进一步研究提供了条件。     

多靶点复合抗原抗肿瘤基因疫苗的构建及真核表达

目的：构建含有人存活蛋白（survivin）-2B主要T细胞表位区域、人和猴绒毛膜促性腺激素β链的核心片段CTP37区域融合基因的真核表达质粒,并在人胚肾293T细胞中进行表达。方法：通过基因合成和搭桥PCR技术构建含有Survivin2B主要T细胞表位区域、人和猴CTP37区域基因的融合基因2PAG,将其插入含有人IgK链前导信号肽（sig）、人IgG-Fc和糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定信号肽融合基因序列的细胞膜锚定修饰真核表达载体pCI—Fc—GPI中,继而又将酶切后的sig2PAG-FC-GPI融合基因导入含有细小病毒内部核糖体结合位点（IRES）基因且可以共表达人GM-CSF和B7．1融合基因的真核表达载体pVAX1-IRES-GM／B7中;将构建的重组质粒pVAX1-sig-2PAG-FC-GPI-GM／B7（简称pVAX1-2PFcGB）转染293T细胞,利用流式细胞仪和免疫荧光检测其表达情况。结果：2PAG融合基因经测序正确,PCR和酶切鉴定证明已成功连入真核表达载体pVAX-IRES-GM／B7中;流式细胞仪和免疫荧光的检测结果显示,重组质粒pVAX1-2PFcGB在293T细胞中得到很好的表达。结论：成功构建了重组质粒pVAX1-2PFcGB,且在293T细胞中可以有效表达,为对该基因疫苗的后续功能研究奠定了基础。     

猪瘟病毒E2蛋白B/C抗原区基因在毕赤酵母中的表达与鉴定

基于猪瘟病毒主要保护性抗原---E2囊膜糖蛋白有两个相对独立的抗原结构单位---B/C抗原区和A/D抗原区 ,设计引物扩增编码猪瘟病毒E2蛋白B/C抗原区的基因 ,将大小为261bp的PCR产物插入含有强启动子P_AOX1和α-MF信号肽序列的巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)表达载体pPICZαC中 ,构建成重组质粒pPICZα-BC ,酶切线性化后电穿孔导入巴斯德毕赤酵母菌X₃₃ 中 ,经Zeocin^TM 筛选得到 3株高拷贝转化子 ,甲醇诱导表达 ,SDS-PAGE和Westernblot及ELISA试验表明 ,酵母培养上清液中含有具有良好反应原性的E2蛋白。为研究亚单位疫苗或诊断抗原打下坚实基础。     

猪瘟病毒E2蛋白A／D抗原区基因在酵母中的分泌表达与鉴定

基于猪瘟病毒主要保护性抗原E2囊膜糖蛋白有两个相对独立的抗原结构单位-B／C抗原区和A／D抗原区,设计一对特异性的引物扩增猪瘟病毒E2蛋白的A／D抗原区基因,并将PCR产物克隆入含有强启动子PAOX1和α-MF信号肽序列的巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZαC中,构建成重组质粒pPICZα-AD,酶切线性化后电穿孔导入巴斯德毕赤酵母X33菌中,经Zeocin^TM筛选得到5株高拷贝转化子,甲醇诱导表达。SDS-PAGE和Western blot试验表明酵母培养上清液中含有具有良好反应原性的E2蛋白,蛋白表达量达175．8μg／mL。N-糖基化分析显示该表达蛋白在分泌过程中发生糖基化。该研究为研制防治猪瘟的亚单位疫苗与诊断试剂盒奠定基础。     

抗羊口疮病毒ORFV118蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及其应用

制备抗羊口疮病毒118(ORFV118)重组蛋白的单克隆抗体并鉴定其生物学特性。构建ORFV118原核表达重组质粒pET33b-ORFV118,将重组质粒转化大肠杆菌BL21,诱导表达出ORFV118重组蛋白;利用Ni-NTA亲和层析法纯化ORFV118重组蛋白;以纯化蛋白为抗原免疫小鼠,通过杂交瘤技术制备单克隆抗体;利用间接ELISA法、Western blot、免疫组化等方法分别对单抗特异性、效价、亚型以及ORFV118蛋白的功能进行研究。获得了3株稳定分泌单克隆抗体的细胞株,分别命名为1A2,3B5,5D10,它们诱生的小鼠腹水效价分别为110 000,16 400,18 000。其中效价最高的1A2抗体亚型为IgG1,能特异性结合其免疫原蛋白、真核表达产物以及病羊皮肤组织中的ORFV118蛋白。免疫组化结果显示单抗1A2染色局限于皮肤表皮层角化细胞及浸润至皮下组织的炎症细胞,与病毒侵染上皮组织层的特性相符。制备的单抗1A2能特异性识别ORFV118。深入研究单抗1A2将为了解ORFV118的生物学特性,为羊传染性脓疱病的诊断、预防与治疗提供可能和新思路。     

猪瘟病毒E2蛋白A/D抗原区基因在酵母中的分泌表达与鉴定

基于猪瘟病毒主要保护性抗原E2囊膜糖蛋白有两个相对独立的抗原结构单位-B/C抗原区和A/D抗原区,设计一对特异性的引物扩增猪瘟病毒E2蛋白的A/D抗原区基因,并将PCR产物克隆入含有强启动子PAox1和α-MF信号肽序列的巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZαC中,构建成重组质粒pPICZα-AD,酶切线性化后电穿孔导入巴斯德毕赤酵母X33菌中,经ZeocinTM筛选得到5株高拷贝转化子,甲醇诱导表达.SDS-PAGE和Westernblot试验表明酵母培养上清液中含有具有良好反应原性的E2蛋白,蛋白表达量达175.8μg/mL.N-糖基化分析显示该表达蛋白在分泌过程中发生糖基化.该研究为研制防治猪瘟的亚单位疫苗与诊断试剂盒奠定基础.     

利用杆状病毒表达幽门螺杆菌cagA基因

幽门螺杆菌cagA基因克隆到杆状病毒表达系统的 pBlueBacHis2A转移载体中 ,将重组质粒 pBlueBacHis2A CagA与亲本病毒Bac N blueDNA共转染Sf9细胞 ,以空斑法纯化获得的重组杆状病毒。经PCR法鉴定后进行扩增培养 ,SDS PAGE和Westernbolt检测结果证实所表达的蛋白为CagA蛋白 ,间接ELISA分析表明 ,表达产物可与Hp感染者血清发生特异性的免疫反应     

分子伴侣促进截短型人乳头瘤病毒58亚型L1蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达

目的:采用分子伴侣pTf16共表达的形式促进截短型人乳头瘤病毒(HPV)58亚型L1蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达。方法:将重组表达质粒pGEX-6P-HPV58-L1转入含有分子伴侣pTf16的大肠杆菌BL21感受态细胞中,在2.0 mg/mL L-阿拉伯糖诱导表达20 min之后加入1.0 mmol/L的IPTG,18℃诱导表达24 h,使目的蛋白与伴侣蛋白共表达;重组蛋白经GST亲和纯化后去除GST标签免疫昆明鼠,ELISA检测免疫血清效价。结果:分子伴侣pTf16能显著提高目的蛋白的可溶性表达,经纯化及去除GST标签,用SDS-PAGE与Western印迹检测,约在相对分子质量50×103处出现特异性反应条带,该条带与截短型HPV58 L1蛋白预期大小相符,免疫动物后经ELISA检测小鼠血清的抗体效价为1∶6400。结论:获得了截短型HPV58 L1蛋白,动物免疫试验证实该蛋白具有较好的免疫原性,为进一步研制HPV58预防型疫苗奠定了基础。     

人细胞周期蛋白D1/CDK4基因的真核表达及生物活性鉴定

通过生物工程获得人重组细胞周期蛋白 (cyclinD1 )及细胞周期蛋白激酶CDK4蛋白 ,作为抗癌药物筛选的分子靶点 .从人HL 6 0细胞中获得细胞周期蛋白D1 CDK4基因的cDNA ,先克隆至pGEMT Easy载体上 ,再经重组构建供体质粒pFastBac D1和pFastBac CDK4 .重组供体质粒转化感受态DH1 0Bac细胞 ,挑取确证为白色克隆的菌落振荡培养 ,分离制备高纯度杆粒DNA .以重组病毒适量感染昆虫细胞Tn 5B1 4 ,利用Bac to Bac杆状病毒表达系统在昆虫细胞Tn 5B1 4 (Hi5 )中表达相应的重组蛋白 .应用昆虫杆状病毒表达系统 (Bac to Bac)在昆虫细胞Tn 5B1 4中分别高效表达了人细胞周期蛋白D1和CDK4蛋白 .SDS PAGE分析表明 ,表达量占细胞可溶性蛋白质的 2 0 %左右 ,表达产物经Ni2 + NTA亲和层析纯化后纯度达 85 %以上 .研究表明 ,昆虫细胞表达的细胞周期蛋白D1和CDK4蛋白能促进Rb蛋白的磷酸化 ,具有生物活性 .成功构建了细胞周期蛋白D1及CDK4真核杆状病毒表达载体 ,并且在昆虫细胞中正确表达了具有生物活性的细胞周期蛋白D1及CDK4融合蛋白 .     

重组幽门螺杆菌ureA,ureB低温表达、纯化及抗原鉴定

目的：建立经济有效的方法,从大肠杆菌表达,纯化重组幽门螺杆菌尿素酶A、B亚单位。方法：含重组表达质粒pGEX-2T/ureA,pGEX-2T/ureB大肠杆菌分别在不同浓度IPTG、不同温度条件下作诱导培养,以SDS-PAGE分析表达产物,采用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和层分离纯化表达产物,以Western-blotting和ELISA对纯化产物作抗原性分析鉴定。结果：IPTG诱导浓度为0.1mmol/L;诱导温度为28℃,含重组质粒大肠杆菌表达可溶性融合蛋白GST-ureA、GST-ureB各约占总表达产物的78%和87%,经亲和层析,得纯度90%以上的GST-ureA约为14mg/L。GST-ureB约为18mg/L;融合蛋白呈ureA、ureB抗原性反应。结论：建立了低温诱导及纯化高纯度ureA、ureB基因表达产物的方法,所得纯化产物具有ureA、ureB抗原活性,为进一步的应用研究打下基础。