抗人肿瘤坏死因子-α单链抗体与其配体的相互作用

为了在大肠杆菌中表达纯化抗人 TNF- α单链抗体并检测其结合活性与中和活性 .利用GST融合蛋白系统在大肠杆菌中表达抗人 TNF- α单链抗体 E6Sc Fv;分离包含体后进行变性和复性 ,再用亲和层析法进行纯化 ;用 ELISA法和酵母双杂交系统检测 E6Sc Fv与配体的结合 ;用 L92 9细胞检测 E6Sc Fv对人 TNF- α细胞毒作用的中和活性 .经变性 ,复性与亲和层析 ,E6Sc Fv被纯化 ,在 SDS- PAGE上为单一蛋白带 ;体外结合与中和实验表明 ,表达纯化的 E6Sc Fv可与人 TNF-α结合并中和其细胞毒活性 ;进一步用酵母双杂交系统证明当表达于细胞内时 ,E6Sc Fv仍保持了与TNF-α相结合的能力 .     

靶向EGFR二聚化界面单链抗体的构建及表达

[目的]构建靶向EGFR二聚化界面的单链抗体。[方法]构建单链抗体的基因并进行密码子优化,克隆于表达载体p GAPZα-A和毕赤酵母X-33。镍柱纯化目的蛋白,并对EGFR高表达细胞A431和EGFR正常表达细胞NIH-3T3进行体外抑制分析和抗磷酸化分析。[结果]纯化获得了分子量大小约29. 0 k Da的EGFR dimer Sc Fv蛋白。在48h体外抑制实验中,534 nmol/L EGFR dimer Sc Fv对A431和NIH-3T3的抑制率分别为34. 92±1. 30%和5. 89±0.46%,抑制作用与母本抗体相似。Western Blotting分析表明,EGFR dimer Sc Fv能显著抑制A431细胞EGFR磷酸化,而对NIH-3T3细胞显著无抑制作用。[结论]初步验证了靶向EGFR二聚化界面的单链抗体作为新型抗体药物的可行性,为后续研究奠定了基础。     

拟南芥中一种AtBAG4蛋白的抗体制备和特异性检测

以拟南芥AtBAG4的全长cDNA,构建pET-51780重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG可诱导融合蛋白高效表达,表达产物以可溶形式存在;经Ni-NTA层析柱分离纯化,可得到分子质量约为49kDa的PAGE纯蛋白。用纯化的融合蛋白pET-51780免疫家兔,可得到抗AtBAG4抗体。Western blot结果显示该抗体能特异识别原核系统内表达的抗原以及拟南芥自身的抗原。     

抗A型肉毒毒素人源单链抗体融合蛋白的重组设计*

以获得的抗A型肉毒毒素单链抗体为模板,进行融合改构,将人IgG1的Fc片段连接到ScFv的C端,在大肠杆菌中实现抗体融合蛋白ScFv-Fc的表达,表达量30%以上,蛋白以包含体形式存在,经过体外变复性的抗体融合蛋白ScFv-Fc,进行Prote in G Sepharose柱亲和层析纯化,纯度达90%~95%。体外活性检测结果表明,重组抗体融合蛋白ScFv-Fc可以特异结合A型肉毒类毒素抗原,其相对亲和力近似于母本单链抗体,其稳定性高于母本单链抗体。     

大肠杆菌表达的单链抗体柱复性的研究

单链抗体(single chain Fv,ScFv)是由抗体重链可变区V_H和轻链可变区V_L通过一段连接肽连接而成的重组蛋白。由于其分子量小,穿透力强,免疫原性低,利于基因工程操作等优点,而具有良好的应用前景。ScFv可在大肠杆菌以包含体形式高效表达,其纯化和复性是大量制备ScFv的重要环节,我们对包含体表达的抗乙肝病毒表面抗原(HBsAg)ScFv的纯化     

抗对硫磷基因工程新型抗体的制备及初步鉴定

摘要: 【目的】提高抗对硫磷抗体的亲和力以提高酶联免疫检测的灵敏度。【方法】本研究通过抗对硫磷单链抗体基因和核心链霉亲和素基因片段的拼接重组,获得抗对硫磷单链抗体-核心链霉亲和素融合基因（scfv-sa）,并将该融合基因（scfv-sa）插入到表达载体pET28a(+)中,转化大肠杆菌BL21（DE3）进行原核表达,制备融合蛋白。SDS-PAGE和Western blot鉴定scfv-sa的表达,Ni+-NTA亲和层析柱纯化融合蛋白,并用ELISA方法测定该融合抗体的亲和力。【结果】结果表明,在大肠杆菌BL21（DE3）中该融合基因能表达出分子量约为46kD的融合蛋白,形成了四价结构域-四价聚合抗体。ELISA测定结果表明该抗体能与对硫磷特异结合,抗体效价在1:1×106以上,亲和常数为4.25×107 L /mol。 【结论】制备的抗对硫磷四价聚合抗体能与抗原特异结合,与单克隆抗体相比,抗原结合位点显著增加,ELISA检测灵敏度显著提高。     

抗对硫磷基因工程新型抗体的制备及鉴定

【目的】提高抗对硫磷抗体的亲和力以提高酶联免疫检测的灵敏度。【方法】本研究通过抗对硫磷单链抗体基因和核心链霉亲和素基因片段的拼接重组,获得了抗对硫磷单链抗体-核心链霉亲和素融合基因(scfv-sa),并将该融合基因(scfv-sa)插入到表达载体pET28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行原核表达,制备融合蛋白。SDS-PAGE和Western blot鉴定scfv-sa的表达,Ni+-NTA亲和层析柱纯化融合蛋白,并用ELISA方法测定该融合抗体的亲和力。【结果】结果表明,在大肠杆菌BL21(DE3)中该融合基因能表达出分子量约为46kDa的融合蛋白,形成了四价结构域-四价聚合抗体。ELISA测定结果表明该抗体能与对硫磷特异结合,抗体效价在1:1×106以上,亲和常数为4.25×107L/mol。【结论】制备的抗对硫磷四价聚合抗体能与抗原特异结合,与单克隆抗体相比,抗原结合位点显著增加,ELISA检测灵敏度显著提高。     

抗A型肉毒毒素人源单链抗体融合蛋白的重组设计

以获得的抗A型肉毒毒素单链抗体为模板,进行融合改构,将人IgGl的Fc片段连接到ScFv的C端,在大肠杆菌中实现抗体融合蛋白ScFv—Fc的表达,表达量30％以上,蛋白以包含体形式存在,经过体外变复性的抗体融合蛋白ScFv．Fc,进行Protein G Sepharose柱亲和层析纯化,纯度达90％-95％。体外活性检测结果表明,重组抗体融合蛋白ScFvFc可以特异结合A型肉毒类毒素抗原,其相对亲和力近似于母本单链抗体,其稳定性高于母本单链抗体。     

大鼠Scratch2蛋白锌指结构域的表达与纯化

[目的]原核表达大鼠Scratch2基因的C_2H_2型锌指结构域,纯化获得GST-C_2H_2融合蛋白。[方法]以新鲜大鼠前额叶脑组织cDNA为模板,利用PCR扩增带有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的Scratch2基因的锌指结构域后,构建原核表达载体pGEX-4T-1-C_2H_2,并将其转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导融合蛋白表达,再利用MagneGST particles亲和纯化GST-C_2H_2融合蛋白,最后通过Western Blot鉴定此融合蛋白。[结果]成功构建了pGEX-4T-1-C_2H_2原核表达载体;在20℃、0.2 mmol/L的IPTG诱导下,GST-C_2H_2融合蛋白即可有效地表达;经MagneGST particle纯化的GST-C_2H_2蛋白可被识别Scratch2锌指结构域的抗体所识别。[结论]纯化的GST-C_2H_2蛋白可用于后续研究。     

人源抗TNF—α抗体Fab基因的单链化及其表达和纯化

构建人源抗TNF－α单链抗体基因,并尝试其在E.coli中的表达和纯化,采用人工接头,按VH－linkerVL的结构将人源抗TNF－a的VH,VL基因拼接成单链抗体（ScFv)基因,并将构建好的ScFv基因插入表达载体pQE30,转染E.coli M15,以IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂纯化表达产物,构建的ScFv基因长723bp, 列分析表明,该序列拼接正确,SDS－PAGE显示,用重组的pQE30转化的M15菌经诱导后,有相对分子质量（M）约为52000的外源蛋白表达,Ni-NTA树脂纯化的表达产物纯度大于90％,因此,成功地构建了人源抗TNFa的ScFv基因,并在E.coli DH5a中表达和纯化的该基因的产物。     

抗EGFRvⅢ单链抗体的原核表达条件的优化及纯化

为了构建抗EGFRvⅢ单链抗体大肠杆菌表达体系,优化抗EGFRvⅢ单链抗体在大肠杆菌中的表达条件,并建立纯化方法。构建抗EGFRvⅢ单链抗体的pET-22b(+)重组质粒,将其转化到大肠杆菌BL21中,研究不同温度、不同浓度诱导剂对目的蛋白表达效率的影响。用Ni2+亲和层析纯化蛋白,并通过免疫印迹对其进行鉴定。抗EGFRvⅢ单链抗体重组质粒经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切,菌落PCR和测序验证,结果显示重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明BL21表达的目的蛋白相对分子量为29kD左右,与理论分子量一致,免疫印迹结果表明在29kD左右出现一条特异性条带,与SDS-PAGE结果一致。15℃和0.6μmol/L的诱导剂为抗EGFRvⅢ单链抗体的最佳诱导条件。本研究成功构建了抗EGFRvⅢ单链抗体大肠杆菌表达体系,并获得了大肠杆菌表达单链抗体的最佳诱导条件。     

柑桔溃疡病菌重组单链抗体的高效表达及活性检测

运用PCR方法扩增利用核糖体展示技术筛选的抗柑桔溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri,XAC)的单链抗体(ScFv95)基因片段,将单链抗体基因重组到原核表达载体pET30a( )中,构建单链抗体高效表达载体pET30a( )-XAC-ScFv。再将pET30a( )-XAC-ScFv质粒转化进大肠杆菌BL21(DE3)后诱导表达,并对表达产物进行纯化、复性及活性检测。获得了抗XAC单链抗体的高效表达蛋白,以包涵体形式存在的表达蛋白大小约32kDa。包涵体蛋白经过变性、纯化和复性后,初步获得有功能的单链抗体。同时用Biacore分析XAC-ScFv-95与XAC LPS作用,结果表明复性后的XAC-ScFv-95具有较高的亲和力,从而为柑桔溃疡病菌XAC的免疫诊断和防治研究提供了新的工具和途径。     

不同连接肽的双价单链抗体基因的构建及表达

采用基因重组技术分别借助不同长度的连接肽[G4S和(G4S)3],将两个相同的抗人大肠癌单链抗体基因ND-1scFv共价连接,构建表达载体pET-28a( )ND-1sc(Fv)2,并在大肠杆菌BL21中表达ND-1sc(Fv)2的融合蛋白。应用Ni2 亲和层析方法对表达产物进行纯化,SDS-PAGE、免疫荧光法(IFA)和ELISA对纯化后的蛋白质进行纯度和免疫活性分析。结果表明成功构建了表达载体pET-28a( )ND-1sc(Fv)2,并在大肠杆菌中获得高效表达,其表达产物以不溶性包涵体形式存在。纯化后ND-1sc(Fv)2-5、ND-1sc(Fv)2-15的蛋白质纯度分别为90%和86%。IFA及ELISA结果表明,二者均保留了亲本抗体的免疫活性,对表达在人大肠癌细胞上的肿瘤相关抗原LEA具有特异结合活性,其免疫活性均明显高于ND-1scFv,其中ND-1sc(Fv)2-15的免疫活性更接近于亲本单抗ND-1,该抗体有望成为大肠癌临床导向诊断和治疗的理想载体。     

抗汉坦病毒NP scFv基因表达及生物活性分析

诱导已构建的重组质粒pGEX-6P—1—scFv原核表达抗汉坦病毒核衣壳蛋白单链抗体,并用酶免疫实验检测单链抗体生物活性。用IPTG诱导重组原核表达质粒pGEX-6P-1-scFv表达抗汉坦病毒NP单链抗体融合蛋白,经亲和层析纯化,并应用SDS—PAGE电泳检测单链抗体融合蛋白,应用酶免疫实验检测抗NP单链抗体生物学活性。SDS—PAGE电泳检测显示,原核重组质粒pGEX-6P-1-scFv已表达分子量约为56ku的单链抗体融合蛋白;酶免疫实验检测显示,单链抗体具有与汉坦病毒NP抗原特异性结合的生物学活性。结果表明,已构建的原核表达重组质粒pGEX-6P-1-scFv,能够成功表达具有与汉坦病毒NP抗原特异性结合生物学活性的单链抗体。     

抗PRRSV双功能单链抗体基因的构建、序列分析及蛋白结构预测

为构建抗PRRSV与抗人红细胞单链抗体(2E8-Sc Fv)融合的双功能单链抗体基因并预测其结构和功能,本研究以PRRSV杂交瘤细胞株为模板,通过RT-PCR和SOE-PCR构建PRRSV-Sc Fv基因,将其重组到2E8-Sc Fv C端构建双功能单链抗体基因并测序分析,利用生物信息学软件预测其结构功能。结果显示,成功获得长735 bp的PRRSV-Sc Fv基因,由Linker、VH和VL组成,VH、VL均含明确的CDR和FR区及特征性Cys,与多种鼠源Sc Fv基因高度同源,具有重组功能性鼠源抗体可变区特征,与2E8融合后形成全长1 470 bp的2E8-PRRSV-Sc Fv基因。经生物信息学分析,融合基因编码490个氨基酸,亲水性评估值为-0.365,为亲水性蛋白;结构预测分析显示,其存在丰富的二级结构,可折叠形成含有多个沟槽结构的空间构象,利于抗原的结合,理论上具有良好的抗原结合活性。本研究成功构建抗PRRSV双功能单链抗体基因并对其编码的蛋白质结构进行了预测,为今后进行融合蛋白的表达及最终研究PRRSV抗原快速检测方法奠定基础。     

转录因子LRF蛋白POZ结构域的表达与纯化

[目的]旨在原核表达转录因子LRF的POZ结构域,纯化获得GST-POZ融合蛋白。[方法]以SD大鼠海马组织c DNA为模板,利用PCR扩增带有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的LRF基因的POZ结构域,并将其插入到原核表达载体p GEX-4T-1中,将构建成功的p GEX-4T-1-POZ原核表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导融合蛋白表达,再利用MagneGST particles亲和纯化GST-POZ融合蛋白,最后通过Western Blot鉴定融合蛋白。[结果]p GEX-4T-1-POZ原核表达质粒构建成功;在37℃条件下,浓度为0. 2 mmol/L的IPTG诱导7 h能够使重组蛋白大量表达,经MagneGST particles纯化后的GST-POZ重组蛋白能够被识别LRF的抗体特异性识别。[结论]纯化后的GST–POZ重组蛋白能够用于后续的生物学研究。     

抗CD20单链抗体与力达霉素强化融合蛋白的制备及其抗肿瘤活性

抗体融合蛋白是新一代抗肿瘤抗体药物.CD20在约95%的B细胞非霍奇金淋巴瘤表面过度表达,是治疗B细胞淋巴瘤的理想靶点.力达霉素(LDM)是强效烯二炔抗肿瘤抗生素,目前已进入Ⅱ期临床阶段.采用DNA重组技术,利用大肠杆菌表达体系,制备抗CD20单链抗体与力达霉素辅基蛋白LDP的基因工程融合蛋白scFv-LDP.经纯化和...     

多胺调节因子-1原核表达与多克隆抗体制备

[目的]原核表达和纯化人多胺调节因子-1(PMF-1)并以此为抗原制备多克隆抗体。[方法]PCR扩增人PMF-1编码序列并构建原核表达质粒。将此质粒转化大肠杆菌后,IPTG诱导PMF-1蛋白表达并在变性条件下用NiNTA树脂纯化。将纯化的PMF-1用作抗原免疫大耳白兔以制备抗PMF-1多克隆抗体。ELISA法检测抗体效价,免疫印迹法和细胞免疫化学法分析抗体特异性。[结果]成功构建PMF-1原核表达质粒,在大肠杆菌中IPTG可诱导该质粒高效表达PMF-1蛋白。以纯化的PMF-1蛋白为抗原免疫大耳白兔后,获得高效价的抗PMF-1抗血清(抗体效价为1∶128 000)。该抗体能与PMF-1蛋白特异性结合,并可用于PMF-1的免疫印迹和细胞免疫化学分析。[结论]成功建立了人PMF-1原核表达和纯化技术,并制备出高特异性的抗PMF-1多克隆抗体,该抗体可用于PMF-1的免疫印迹分析和细胞免疫化学分析。     

炭疽毒素保护性抗原第四结构域在大肠杆菌中的可溶性表达

人工优化设计并合成炭疽毒素保护性抗原第四结构域基因,并与噬菌体gⅢ蛋白N端结构域基因融合,在大肠杆菌中可溶性表达融合蛋白。结果表明合成了炭疽毒素保护性抗原第四结构域基因,并在大肠杆菌中获得了高效可溶性融合表达,可溶性表达产物占细菌总蛋白量的36％左右;经亲和层析纯化获得了重组蛋白;Western印迹分析表明,表达产物能与His单抗（重组蛋白羧基端带有6xHis）发生特异性结合反应。以上结果表明获得了炭疽毒素保护性抗原第四结构域,为利用人抗体库进行筛选抗炭疽毒素的人源性中和抗体奠定了基础。