白酒丢糟的多酶复配降解制备可发酵性糖

为有效利用纤维质原料制备可发酵性糖生产燃料酒精,通过NaOH-过氧乙酸预处理白酒丢糟,经质量分数2%NaOH和体积分数6%过氧乙酸处理后,白酒丢糟中木质素去除率达66.13%~77.02%,总纤维素回收率78.04%~90.73%。对处理后的白酒丢糟进行多酶复配糖化降解,通过均匀设计实验确定白酒丢糟酶降解的数学模型,得出总糖降解率与各酶添加量之间的回归关系,在最优条件下白酒丢糟降解率为(0.432 8±0.013 5)g/g。     

二步发酵丢糟生产微生物油脂的研究

目的:探索以黄曲霉和皮状丝孢酵母为菌种二步发酵大曲丢糟生产微生物油脂的最佳工艺条件.方法:利用黄曲霉对丢糟进行一步发酵,再以一步丢糟发酵物为基质,设定皮状丝孢酵母的接种量、培养温度、培养时间为三个因素,进行L9(33)正交试验.结果:黄曲霉一步发酵丢糟的最佳条件为接种量12％,在28℃下发酵5d,获得的一步丢糟发酵物还原糖含量为2.4051％;皮状丝孢酵母二步发酵丢糟生产微生物油脂的最佳条件为皮状丝孢酵母接种量12％,在30℃下培养4d,每1 000g发酵物中可得油脂19.32g.结论:利用黄曲霉的产纤维素酶的性能和皮状丝孢酵母积累油脂的性能进行二步发酵丢糟生产微生物油脂,具有一定的可行性.     

苏云金芽胞杆菌还原Cr(Ⅵ)的转座子突变体库构建和分析

将高毒性的Cr(Ⅵ)还原成低毒的Cr (Ⅲ),是处理含Cr(Ⅵ)废水常用的方法之一.以高效还原Cr(Ⅵ)的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)407为研究对象,将转座子随机突变载体pIC333转化Bt407,构建容量为1 500株的随机突变体库,从中筛选出Cr(Ⅵ)还原能力极显著差异(P＜0.01)的突变株14株.通过扩增并测定转座子插入位点的侧翼序列,确定Bt407-Cr244突变株的转座子插入位点为细胞色素氧化酶亚单位Ⅰ.Bt 407及其14株突变株的生长曲线十分相近,表明突变株Cr(Ⅵ)还原能力发生改变不是由菌株繁殖能力提高引起的.在培养24 h后,Bt 407-Cr1 49和Bt 407-Cr285培养液中的总络浓度比Bt 407极显著降低(P＜0.01),说明这2株突变株在解毒Cr(Ⅵ)过程中除了还原作用,可能还具有生物吸附,而其余12株突变子主要通过还原Cr(Ⅵ)起作用.     

苏云金芽胞杆菌LTS290菌株抑制镰孢菌的作用

旨在扩大苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)的生防范围,通过对Bt LTS290菌株的对峙培养和菌株无菌发酵液对镰孢菌的抑制作用进行研究。结果表明,Bt LTS290菌株可抑制6种马铃薯致病镰孢菌的生长,并且Bt LTS290无菌发酵液的抑菌效果显著。抑菌物质对温度不敏感,经过121℃处理20 min后仍然具有抑菌活性。在p H3-11范围内存放12 h后,抑菌活性变幅不大,并且用蛋白酶K处理后其抑菌活性依然存在。实验证明苏云金芽胞杆菌Bt LTS290是一株可以高效抑制马铃薯致病镰孢菌的生防菌株。     

利用废弃物发酵生产苏云金芽胞杆菌的研究进展

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是目前应用最广泛和产量最大的微生物杀虫剂,它对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等许多害虫有特异毒杀作用,而对人类和其它非靶标动物以及农作物无害。长期以来,人们一直致力于苏云金芽胞杆菌的筛选及发酵研究,以期能获得高毒力的绿色生物杀虫剂产品。由于发酵培养基成本较高,利用废弃物生产Bt杀虫剂既有利于资源循环利用和环境保护,又能降低Bt杀虫剂的多重优点,因此成为近年来国内外的研究热点。本文简要介绍了筛选苏云金芽胞杆菌的基本方法以及利用废弃物发酵生产Bt杀虫剂的研究进展。方法以及利用废弃物发酵生产Bt杀虫剂的研究进展。     

超临界下有机酸对稻秆水解糖化的影响

采用间歇式反应器在超临界条件下,以有机酸（甲酸、乙酸和丙酸）为催化剂对稻秆进行水解糖化研究,重点考察反应温度、反应时间、固液比对还原糖产率的影响。实验表明：有机酸的加入有利于稻秆的水解糖化,稻秆水解速率和还原糖产量都有所提高,这种趋势在加入甲酸时最为明显;随着反应时间的延长,还原糖产量会逐渐减少;适当提高固液比有助于增加还原糖产量。稻秆超临界水解糖化的最佳条件：甲酸体积分数3％、固液比4：60（g／mL）、反应温度410℃、反应时间5min,在此条件下,还原糖产量最高,达6．65g／L。     

糙米发芽条件的研究

对影响糙米发芽的赤霉素(GA3)、温度、培养时间多个因素用正交设计的方法进行实验,主要以还原糖的含量作评价指标,同时对发芽糙米的芽长进行测量.最后经综合评价,认为经0.025mg/mL的GA3处理后在28℃温度条件下将糙米培养不超过8 h较为合适.这种条件下,还原糖含量为1.63%,芽长约1.0mm.     

苏云金杆菌Bt4.0718不同时期比较转录组揭示芽胞和杀虫伴胞晶体形成机制

【目的】苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)在形成芽胞的过程中产生大量杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins, ICPs)，是目前应用最广泛、最安全的微生物杀虫剂的主要菌株资源。本研究旨在比较Bt 3个重要时期的转录组，进一步探究芽胞和杀虫伴胞晶体的形成机制，为高效工程菌的构建奠定理论基础。【方法】选取高毒力Bt4.0718菌株营养生长中期(T1-10h)、芽胞形成前期(T2-20 h)、芽胞形成后期(T3-32 h)进行比较转录组分析，对代表性差异基因进行实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR, qRT-PCR)验证、特定功能基因的敲除和表型分析验证。【结果】差异表达基因数量分别为2 147个(T2/T1)、1 861个(T3/T1)、1 708个(T3/T2)。T1时期，培养基中营养相对丰富，主要为芽胞和杀虫伴胞晶体形成做准备。芽胞形成重要调控基因kinA/D、spo0A/F、sigE高水平转录对菌体的生长发育具有重要作用，Cry1Ac、碳源、能源贮藏物聚...     

苏云金芽胞杆菌dxr1基因的转录受SigH控制

【目的】萜类化合物广泛分布在生物界,是重要的生命物质。目前发现有两条萜类化合物的生物合成途径,即甲羟戊酸(MVA)途径和2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径。MEP代谢途径中的关键酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构化酶(DXR,EC1.1.1.267)催化1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸生成MEP。枯草芽胞杆菌中dxr基因编码DXR酶,而在苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)中有2个基因(dxr1和dxr2)编码DXR酶。通过分析BtHD73菌株的dxr1基因的转录活性和dxr1突变体表型,明确dxr1基因的转录调控机制和功能。【方法】通过5?RACE分析dxr1的转录起始位点;β-半乳糖苷酶活性测定分析dxr1基因启动子(Pdxr1)的转录活性;采用同源重组技术分别敲除BtHD73菌株的dxr1和dxr2基因;利用总蛋白定量确定Cry1Ac蛋白产量;利用DXR检测试剂盒检测Bt菌株的DXR活性。【结果】dxr1基因的转录起始位点位于起始密码子上游39 bp处的G碱基;与出发菌株HD73相比,Pdxr1在sig H突变体中的转录活性明显降低;dxr1或dxr2基因的缺失对菌体生长、芽胞形成率和Cry1Ac蛋白产量无显著影响,但使DXR活性下降。【结论】Bt中dxr1基因的转录受Sig H控制,dxr1基因的缺失影响DXR的活性。     

玉米芯稀酸水解及L-乳酸发酵研究

对玉米芯稀硫酸水解条件及糖化液发酵L-乳酸进行了初步研究。结果表明,玉米芯木聚糖最适水解条件为2%H2SO_4、120℃、30 min、固液比1:10,糖化液还原糖含量可达40.8 g/L,主要成分为木塘。细菌A-19可以利用水解液中的葡萄糖和木糖产酸,最适发酵条件为45℃、pH 6.5,从45℃～51℃、pH 5.5～pH 6.5产量均较高。用未浓缩的水解液发酵24 h,L-乳酸产量为30.6g/L,残糖为1.6 g/L,糖酸转化率为82.6%;用浓缩1倍的水解液发酵48 h,L-乳酸产量为41.4 g/L,残糖4.1g/L,糖酸转化率为68.2%,在发酵48 h后继续补料发酵至72 h(补料液为浓缩3倍的水解液),L-乳酸产量为50.9 g/L,残糖6.3 g/L,糖酸转化率为71.8%。该研究为利用木质纤维素生产L-乳酸奠定了一定基础。     

苏云金芽胞杆菌Bt0601发酵条件的优化研究

应用正交实验和单因子实验,结合杀虫毒力测定,对携带杀虫基因cry1Ac和虎纹捕鸟蛛毒素基因Hwtx-I的苏云金芽胞杆菌工程菌Bt 0601的发酵工艺条件进行研究。实验获得的苏云金芽胞杆菌Bt 0601工程菌的最佳发酵条件为:发酵初始酸碱度控制在pH 7.5、发酵温度(30±0.5)℃、转速200 r/min、通气量为30 mL/300 mL,接种量为4%,培养44 h。此外,本文还对Bt 0601菌株在30 L发酵罐中的发酵特性进行了研究,摸索了通气量对其大罐发酵的影响,确定大罐发酵的最佳通气量为1.75 L/min。     

枯草芽胞杆菌B006产表面活性素的培养条件优化

芽胞杆菌产生的环脂肽类生物表面活性素surfactin具有重要抗菌、促进生物膜形成等功能,其含量和同系物组分构成影响其功能。为了提高芽胞杆菌B006产生表面活性素的产量,通过单因素实验和正交实验,测定了碳源、氮源和无机盐等营养物质及接种量、培养时间、装液量和初始pH值对芽胞杆菌B006摇瓶发酵产生表面活性素的影响;采用排油圈法测定发酵液中表面活性素的产量,采用HPLC-MS方法比较培养基优化前后surfactin的产量和组分含量。结果表明,适合芽胞杆菌B006摇瓶发酵产生表面活性素的培养基组成为:牛肉膏10 g/L、玉米粉15 g/L、硝酸铵3 g/L和氯化钠3 g/L;适合的培养条件为:初始pH值7.0、接种量10%、装液量60 m L/500 m L,发酵周期64 h。优化后surfactin的产量约为314.73 mg/L,比优化前提高了74.88%;surfactin各组分比例发生改变,其中C16和C17组分的含量明显提高,为优化前相应组分含量的1.64和8.34倍。优化的培养基组分和培养条件可明显提高芽胞杆菌B006菌株产生surfactin的产量,改变surfactin同系物组分的构成,为利用芽胞杆菌B006进行高活性表面活性素的工业生产和代谢调控研究奠定了基础。     

芽胞外壁基质组成蛋白的编码基因启动子PexsY指导的cry1Ac基因表达

【目的】利用非cry基因启动子PexsY(芽胞外壁基质组成蛋白编码基因启动子)表达Cry1Ac晶体蛋白,发现可用于cry基因表达的新元件,为高效工程菌的构建奠定基础。【方法】采用启动子融合lacZ技术,通过β-半乳糖苷酶活性分析了PexsY启动子和截短的PexsY启动子的转录活性;利用该启动子在苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)HD73菌株中表达了cry1Ac基因,通过透射电子显微镜观察晶体形态;蛋白定量、SDS-PAGE比较蛋白产量;生物活性测定进行功能验证。【结果】PexsY启动子在芽胞晚期转录活性很高,透射电镜观察到利用该启动子表达的cry1Ac基因形成了菱形晶体,SDS-PAGE分析可以检测到133kDa的Cry1Ac蛋白,且与cry3A启动子指导表达的蛋白产量相近,少于cry8E启动子指导表达的蛋白产量;生物活性测定表明PexsY指导表达Cry1Ac蛋白对玉米螟(Ostrinia furnacalis)具有杀虫活性。【结论】在Bt无晶体突变体中,非cry基因启动子PexsY可以正常表达133kDa的Cry1Ac蛋白,并形成晶体,具有在芽胞形成晚期表达cry基因的能力,该类启动子将在Bt工程菌构建中发挥重要作用。     

应用混料实验设计制备秸秆复合降解菌剂

农业秸秆类废弃物含有大量木质纤维素,该类物质结构稳定,不易降解,为秸秆的合理利用带来诸多困难。本实验尝试利用混料实验设计对筛选出可以共同培养的五种木质纤维素降解菌的配比进行研究,寻求复合发酵降解剂各组分的最佳配比,并分析发酵产品得到适用于不同发酵目的的菌剂。通过对发酵产品中木质素和纤维素降解率及还原糖的含量的分析建立模型,分析预测纤维素降解率最高为35.75%,木质素降解率最高为27%,还原糖含量最高为3.39mg/g。通过优化得出发酵菌剂最优配比为枯草芽胞杆菌12.1%,克鲁斯假丝酵母10%,地衣芽胞杆菌27.2%,变色栓菌10.6%,黄孢原毛平革菌40%。对应三指标的实测值为：35.47%,26.41%和2.37mg/g。     

提高蛋白激发子产量的培养基及发酵条件的优化

为了进一步提高极细链格孢菌产蛋白激发子的产量,通过单因子和多因子试验与分析,筛选优化了适于极细链格孢菌产生蛋白激发子的培养基和培养条件,并检测了发酵过程中pH、还原糖、氨基氮和菌丝量变化以及与蛋白激发子产量的关系。结果表明,土豆淀粉和黄豆粉对蛋白激发子产量影响最大,其次是蛋白胨和无机盐。优化的发酵培养基主要成分（g／L）：碳源I 15、葡萄糖5、玉米淀粉5、土豆淀粉20、谷氨酸10、氮源I5、黄豆粉10、硫酸铵5。确定了优化的培养条件,调整培养基起始pH为7．0～7．5,将18h菌龄的种子培养液按10％接种量接种到装液量为75mL的500mL摇瓶中,在温度（28±1）℃、摇床转速180r／min下培养可获得理想的蛋白产量。在优化的培养基和培养条件下,发酵12～48h该菌进入对数生长期,48h进入稳定生长期,60h菌丝扣蛋白激发子产量达最高。蛋白产量与菌体生物量呈正相关,当还原糖、总糖量消耗到最低水平时,菌丝产量和蛋白激发子产量达最高。优化的培养基菌丝干重收率迭3．9g／100mL,蛋白激发子产量达到5．17g／L,比普通的土豆液体培养基提高近4倍。     

利用中温蒸煮工艺进行高浓度酒精发酵

用中温蒸煮工艺生产高浓度酒精,首先利用耐高温α－淀粉酶在9s～97℃下同时糊化和液化淀粉．接着在60℃下加高转化率的糖化酶进行糖化,最后在30℃下加酵母菌悬液进行发酵。酵母菌w4在60h内可以产生18．3％的乙醇,在成熟发酵醪中的残还原糖和总糖分别为1.2％和4．1％,细胞存活率为68．5％。如果在发酵培养基中添加一定量的硫酸铵,可进一步改进这一工艺,使成熟发酵醪的乙醇浓度提高到18.9%,发酵周期缩短到50h,残还原糖和总糖分别减少到0.27％和3.1％。     

糖类对冬虫夏草菌Ophiocordyceps sinensis芽生孢子产量及毒力的影响

冬虫夏草Chinese cordyceps是食药两用的传统名贵资源。其人工培养需要冬虫夏草菌Ophiocordyceps sinensis的优质芽生孢子。为获得高产量及高感染力芽生孢子,本研究测定不同糖类培养基对冬虫夏草菌芽生孢子产量及毒力（对小金蝠蛾Thitarodes xiaojinensis幼虫的存活率、携菌率和僵虫率）的影响。两个冬虫夏草菌株于含6种糖（葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、麦芽糖、蔗糖和海藻糖）的液体培养基中分别培养30、45和60 d,计数芽生孢子产量并将收集的孢子注射感染两个品系的小金蝠蛾6龄幼虫,置于不同温度下观察幼虫的存活率、携菌率及僵虫率。结果显示：不同糖源培养基中芽生孢子的产量差异显著,其中含麦芽糖培养基中芽生孢子产量最高;注射菌株和幼虫品系对被注射幼虫的存活率无显著差异;不同糖源培养基获得的芽生孢子对蝠蛾幼虫的存活率无显著差异,对携菌率和僵虫率产生影响;以含麦芽糖为糖源的培养基、芽生孢子培养时间显著影响被注射幼虫的存活率与僵虫率,其中培养30 d的冬虫夏草菌所注射的幼虫的存活率、僵虫率显著高于60 d的;温度也显著影响被注射幼虫的存活率、僵虫率,10℃的幼虫存活率和僵虫率显著高于14℃、18℃的。研究结果为培养优质冬虫夏草芽生孢子,提高被侵染蝙蝠蛾幼虫僵虫率提供了参考。     

高效抑制O157:H7 B.s.2012的选育及抗菌物质提取的研究

对枯草芽胞杆菌2012进行诱变,提高抗菌物质的产量,并提取抗菌物质。用紫外线及亚硝基胍协同诱变处理对数生长中期的枯草芽胞杆菌2012(B.s.2012),在大肠埃希菌为敏感菌的生物鉴定板上筛选产量提高的菌株。比较用乙酸乙酯法、80%乙醇法和甲醇法提取抗菌物质的优劣。正交试验优化甲醇提取法。突变株B.s.2012-21和B.s.2012-28的抑菌圈直径比原菌株分别增大84.62%和40.38%。甲醇法提取的得率最高。正交试验结果表明,提取p H为2.0,菌株发酵时间为36 h,4℃处理时间为36 h时,抗菌物质的得率最高。获得抗菌物质产量大幅提高的B.s.2012-21突变菌株。甲醇法是提取抗菌物质得率最高的方法。     

牛乳铁蛋白肽(LfcinB)在苏云金芽胞杆菌中的融合表达

牛乳铁蛋白肽（bovine lactoferrincin,LfcinB）来源于牛乳铁蛋白（bovine lactoferrin）,是目前已知所有乳铁蛋白肽中活性最高的。前期研究表明,可以通过大肠杆菌表达体系和毕赤酵母表达体系表达有活性的LfcinB,但得到的产物难以纯化,产量也不理想,所以研究构建新型的LfcinB表达体系有很重要的意义。苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）能在芽胞形成的同时产生一种δ-内毒素组装成的杀虫晶体,在发酵完成后细胞裂解,将芽胞和晶体释放到培养基中。基于Bt的这种优势,将LfcinB与分子量为35kDa的Cry60Ba晶体蛋白作融合表达。通过PCR扩增和酶切连接,将LfcinB基因连接到 cry60Ba 的下游,构建融合基因并转入无晶体Bt菌株中表达,得到了工程菌4Q7/pPFT60Ba-LfcinB。利用GYS培养发酵48h,再经过超声破碎、包涵体纯化,SDS-PAGE分析表明,工程菌表达了一条38kDa左右的蛋白质条带。将纯化的融合蛋白盐酸水解后进行SDS-PAGE分析,得到近似于3kDa的蛋白质条带,挖取目的条带进行胶内酶解和质谱分析,质谱结果显示,挖取的目的条带样品为LfcinB蛋白的特异性肽段,说明在酸水解过后,融合蛋白Cry60Ba-LfcinB中的Cry60Ba和LfcinB分离开,得到单独的LfcinB蛋白。由此可见,利用晶体蛋白在苏云金芽胞杆菌中进行融合表达可能作为一种新型有效的LfcinB的高效表达体系,为采用基因工程的方法大量生产具有活性的牛乳铁蛋白肽LfcinB蛋白奠定基础。     

金针菇菌丝体的深层培养及多糖制取

从２０株金针菇菌株中筛选出适于液体发酵的９４Ｂ２株。该菌种适宜的摇瓶培养条件：培养温度２３～２４℃,ｐＨ６．５,接液体种量１０％,装液量≤５０ｍｌ／５００ｍｌ瓶;不同的间歇振荡形式对菌丝球产量和形态有显著影响。深层发酵工艺相似于抗生素发酵。发酵期间发酵液ｐＨ变化幅度很小,总糖、还原糖、氨基氮与菌丝生长量有一定的相关性。发酵酵的菌丝产量可达４７．５ｇ（湿重）／１００ｍｌ、胞外多糖达１７４．７ｋｇ／１００ｍｌ发酵液上清、胞内多糖达３３８．１ｍｇ／１００ｇ湿菌丝体。