氧化葡糖杆菌sndh-sdh基因簇的克隆表达

目的:从氧化葡糖杆菌H763中克隆sndh-sdh基因簇,在大肠杆菌和氧化葡糖杆菌621H中分别表达山梨酮脱氢酶-山梨糖脱氢酶(SNDH-SDH),并检测其活性。方法与结果:以氧化葡糖杆菌H763基因组DNA为模板,PCR扩增包括启动子、结构基因及终止序列在内的sndh-sdh基因簇,回收3533 bp的扩增产物,连入pMD18T载体,转化至大肠杆菌DH5α中表达;以山梨糖或木糖为底物,DCIP法检测菌体裂解液,DCIP检测液颜色由蓝绿色变为黄色,表明大肠杆菌表达产物具有脱氢酶活性。构建pBBR1MCS2-sndh-sdh载体,通过接合转移导入氧化葡糖杆菌621H,重组葡糖杆菌在以山梨醇或山梨糖为底物的培养基中培养,采用薄层层析检测法检测其培养上清中的代谢产物,层析板上显示了2-酮基-L-古龙酸斑点。结论:重组大肠杆菌DH5α和氧化葡糖杆菌621H中均表达了有脱氢酶活性的SNDH-SDH。     

山梨醇脱氢酶的克隆、表达及活性检测

目的:从氧化葡糖杆菌H24中克隆山梨醇脱氢酶基因进行表达并检测其活性。方法:以氧化葡糖杆菌H24基因组DNA为模板,PCR扩增包括启动子、结构基因及其后的终止序列在内的山梨醇脱氢酶基因;将PCR产物插入pMD18T载体,转化大肠杆菌DH5α;通过活性电泳检测山梨醇脱氢酶在大肠杆菌中的表达及活性。结果:从氧化葡糖杆菌H24中扩增得到山梨醇脱氢酶基因并在大肠杆菌中实现表达,重组菌株经活性电泳检测具有醇糖转化活性。结论:原核表达的山梨醇脱氢酶具有很强的醇糖转化活性。     

食品上的应用

941219由饭化葡枪酸杆菌从山梨醉生产山梨枪的优化仁英〕/Rosenberg,M.…j Aeta Bioteehnol。-19,3,13(3)一269~274仁译自DBA,1993,12 (22),93一12907〕 研究了影响氧化葡糖酸杆菌工业菌株的静止期培养物转化山梨醇为山醇糖的参数。山梨醇浓度对耗氧的影响符合米一曼动力学。20~2009/l的山梨醇无抑制效应。高浓度付产物、山梨糖,抑制耗氧率。pHS、35~40℃时山梨醇转化最佳。30℃时培养物最稳定。在持续34小时(50℃、soorp。、1.0vvm通气、。.1 mPa压力、5%接种量、初始山梨醇浓度2009/l)的分批培养中,山梨糖产率为理论值的96纬。在分批…     

甲基营养菌MP688甲醇脱氢酶基因mpq1818的敲除及功能研究

目的:研究甲醇脱氢酶基因mpq1818在甲基营养菌MP688生长代谢中的作用。方法:利用同源重组原理构建中间为庆大霉素抗性基因Gmr、两侧mpq1818基因上下游序列同源的敲除载体pAK0-up-Gmr-down,接合转移导入MP688,通过庆大霉素抗性和组合PCR方法筛选基因敲除菌,并检测其生长、甲醇脱氢酶活性、甲醇利用及吡咯喹啉醌(PQQ)生物合成能力等方面的差异。结果:抗性和PCR验证显示mpq1818缺失株构建成功;与野生菌相比,缺失株的甲醇脱氢酶活力及利用甲醇的能力降低,而且菌株的生长和PQQ产量也有显著下降。结论:基因mpq1818的缺失影响菌株前期生长与PQQ合成。     

利用转座系统在葡糖杆菌中表达山梨糖脱氢酶

目的：利用Mini—Tn5转座系统在葡糖杆菌中表达山梨糖脱氢酶（SDH）。方法：分离得到从山梨醇产糖的快生型小菌Y25K2,利用PCR方法扩增并分析快生型小菌的16SrDNA;构建pUT-mini—Tn5-Tet转座载体,将SDH基因（sdh）插入该载体,利用接合转移,将sdh整合至快生型小菌Y25K2的染色体,通过Western印迹检测SDH的表达。结果：16SrDNA鉴定结果初步表明快生型小菌为葡糖杆菌;构建得到pUT-mini—Tn5-Tet-sdh,将sdh整合至快生型菌Y25K2基因组,并检测到其在快生型小菌Y25K2中的表达。结论：利用Mini—Tn5转座系统在葡糖杆菌中表达了山梨糖脱氢酶。     

利用山梨糖脱氢酶活性筛选氧化葡糖杆菌PQQ合成基因簇

【目的】利用山梨糖脱氢酶醌酶活性从氧化葡糖杆菌H24中分离PQQ生物合成基因簇。【方法】利用ptsG位点整合sdh基因的大肠杆菌JM109作为宿主菌构建了氧化葡糖杆菌H24的基因组DNA文库。通过山梨糖脱氢酶活性检测,从文库中筛选具有PQQ合成能力的单菌落并进行亚克隆。【结果】从氧化葡糖杆菌H24的基因组文库中筛选得到一株具有山梨糖脱氢酶活性的单菌落,亚克隆后序列分析显示插入片段全长5400bp,对应5个编码框(pqqABCDE),与其他细菌PQQ生物合成基因簇有很高的序列同源性。【结论】利用山梨糖脱氢酶醌酶活性成功从氧化葡糖杆菌H24中分离克隆得到了PQQ生物合成基因簇pqqABCDE。     

酮古龙酸菌与呼吸链偶联的2-KGA代谢途径研究进展

酮古龙酸菌可将底物L-山梨糖转化为维生素C的前体2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)。该菌共存在5种反应参与2-KGA代谢,包括:1D-山梨醇氧化为L-山梨糖;2L-山梨糖氧化为L-山梨酮;3L-山梨酮(吡喃型)氧化为2-KGA;4L-山梨酮(呋喃型)氧化为维生素C。52-KGA还原为L-艾杜糖酸。其中L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶(SSDH)参与反应123,L-山梨糖脱氢酶(SDH)参与反应23,L-山梨酮脱氢酶(SNDH)参与反应34,醛脱氢酶(ALDH)参与反应3,2-KGA还原酶(2-KGR)参与反应5。SDH/SSDH/ALDH属于Ⅰ型醌酶,其辅酶为1分子PQQ;SNDH属Ⅱ型醌酶,与PQQ、heme C共同构成quinohemoproteins,2种醌酶均分布于周质空间中与呼吸链相偶联,意味着这种膜上直接氧化过程伴随ATP产生,使得菌体可以利用环境中的底物实现快速供能。     

Gluconobacter oxydans NH-10中NAD+型阿拉伯糖醇脱氢酶基因敲除菌株的构建

氧化葡萄糖酸杆菌Gluconobacter oxydans NH-10能够转化D-阿拉伯糖醇,经木酮糖生成木糖醇,但该菌中存在的NAD+型D-阿拉伯糖醇脱氢酶可将中间产物D-木酮糖还原成D-阿拉伯糖醇,从而影响木糖醇的积累.利用同源重组基因敲除的方法构建G.oxydans NH-10 NAD+型D-阿拉伯糖醇脱氢酶( sArDH)基因敲除突变株.PCR结果显示:sArDH基因在1株重组菌中完全被卡那抗性基因替代,表明sArDH基因敲除突变体构建成功.生物学特性鉴定显示:突变菌在菌落形态,生长状态方面与原始菌无明显差异.静息细胞转化D-阿拉伯糖醇结果显示,突变株不存在还原D-木酮糖产D-阿拉伯糖醇的逆反应,终产物木糖醇的产量有所提高.     

葡萄糖酸氧化杆菌木糖醇脱氢酶基因的克隆与表达

【目的】获得葡萄糖酸氧化杆菌(Gluconobacter oxydans CGMCC 1.637)的木糖醇脱氢酶基因,研究其酶学性质及碳源特别是D-阿拉伯醇和木糖醇对该酶活性的影响。【方法】通过已报道序列的木糖醇脱氢酶的保守区设计引物,用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增获得目的基因片段。根据获得的片段序列设计引物克隆目的基因的5’和3’片段,将所获得的片段拼接,获得完整的木糖醇脱氢酶基因。通过构建工程菌获得重组蛋白,并利用氧化还原反应测定重组酶的活性。用含不同碳源的培养基培养G.oxydans CGMCC 1.637,并测定其破胞上清液木糖醇脱氢酶氧化木糖醇的活性;用不同碳源培养的G.oxydans CGMCC 1.637转化木酮糖,用高效液相色谱法测定木糖醇的产量。【结果】获得一个新的798bp的木糖醇脱氢酶基因,所编码的木糖醇脱氢酶含265个氨基酸,属于短链脱氢酶家族。酶学性质研究发现,该木糖醇脱氢酶催化木糖醇氧化的最适合条件为35℃、pH 10.0,最高活性为23.27 U/mg,催化木酮糖还原为木糖醇的最适条件为30℃、pH 6.0。最高活性为255.55 U/mg;该木糖醇脱氢酶的对木糖醇的Km和Vmax分别为78.97 mmol/L和40.17 U/mg。碳源诱导实验表明,d-山梨醇对G.oxydans CGMCC 1.637木糖醇脱氢酶的活性有明显的促进作用,而葡萄糖、果糖、木糖、木糖醇、D-阿拉伯醇对木糖醇脱氢酶活性有明显的抑制作用。而在转化实验中,用d-甘露糖培养的G.oxydans CGMCC 1.637的转化能力明显高于其他碳源培养的G.oxydans CGMCC 1.637的转化能力,其中,用阿拉伯醇培养的G.oxydans CGMCC 1.637的转化能力最低,仅为对照的35%。【结论】克隆自G.oxydans CGMCC 1.637的木糖醇脱氢酶基因是一个新的基因,用阿拉伯醇培养的G.oxydans CGMCC 1.637破胞液木糖醇脱氢酶活性低;且阿拉伯醇对G.oxydans CGMCC 1.637木酮糖的还原能力具有抑制作用。     

代谢工程改造Gluconobacter suboxydans生产2-酮基-D-葡萄糖酸

2-酮基-D-葡萄糖酸是重要的抗氧化剂和食品添加剂——D-异抗坏血酸的重要前体。弱氧化葡糖酸杆菌(Gluconobacter suboxydans)具有丰富的周质空间氧化还原酶类,可将葡萄糖氧化为葡萄糖酸再氧化为2-酮基-D-葡萄糖酸。以提高2-酮基-D-葡萄糖酸的产量和减少副产物为目标,采用同源重组染色体修饰策略,将编码甘油脱氢酶的基因gldh置换为编码葡萄糖脱氢酶的基因gdh,将编码山梨醇脱氢酶的基因sdh置换为编码2-酮-D-葡萄糖酸脱氢酶的基因ga-2-dh。经PCR、酶活性显色及发酵产物HPLC检测验证表明:构建的工程菌株gdh和ga-2-dh基因被强化而gldh和sdh被敲除;使用10%的葡萄糖复合培养基,摇瓶发酵72h,工程菌2KGA3发酵液中没有副产物5-酮基-葡萄糖酸,2-酮基-D-葡萄糖酸的含量终浓度达到72.3 g/L,比野生菌株提高42.2g/L,工程菌和野生菌的2-D-KGA质量转化率分别为72.3%和30.1%,工程菌比野生菌提高1.4倍。构建获得的工程菌,不需要外加抗生素,可以保持稳定遗传,对于工业化规模生产具有一定优势,为获得可产业化显示的优势遗传资源打下了基础。     

基于重组氧化葡萄糖酸杆菌生物合成吡咯喹啉醌

吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone,PQQ)是一种重要的氧化还原酶辅基,具有多种生理生化功能,在食品、医药卫生及农业等领域具有广泛的应用。文中采用重组氧化葡萄糖酸杆菌生物合成吡咯喹啉醌。首先构建丙酮酸脱羧酶基因GOX1081敲除的重组菌G. oxydans T1,减少副产物乙酸的形成。然后利用筛选的内源性组成型启动子P0169融合表达pqqABCDE基因簇及tldD基因,构建重组菌G. oxydans T2。最后对发酵培养基添加物和发酵条件进行优化。结果显示重组菌G. oxydans T1、G. oxydans T2生物量较野生菌分别提高43.02%和38.76%,而PQQ的产量分别是野生菌的4.82倍和20.5倍。进一步优化G. oxydans T2碳源及培养条件,最终PQQ产量达(51.3241±0.8997)mg/L,是野生菌的345.62倍。通过基因工程手段,可以有效提高氧化葡萄糖酸杆菌的生物量和合成PQQ的产量,为改善PQQ生物合成效率奠定基础。     

地衣芽胞杆菌FLP/FRT基因编辑系统的构建及验证

地衣芽胞杆菌有效的基因编辑工具有限,为了拓展和丰富其基因编辑手段,在地衣芽胞杆菌中构建一个抗性标记可重复使用的FLP/FRT基因编辑系统,并通过敲除α-淀粉酶基因amyL、蛋白酶基因aprE及敲入外源透明颤菌血红蛋白基因vgb对该系统进行初步验证。首先以温敏质粒pNZT1为载体分别构建amyL和aprE基因敲除质粒pNZTT-AFKF和pNZTT-EFKF,两个敲除质粒各自包含针对目标基因的同源臂、抗性基因及同向的FRT位点;将敲除质粒转化地衣芽胞杆菌并经过两次同源交换过程实现目标基因的敲除;最后导入一个FLP重组酶表达质粒通过FLP/FRT系统的重组作用介导抗性基因的回收。为进一步验证本系统的实用性及编辑效率,构建了包含透明颤菌血红蛋白编码基因vgb表达盒及基因组丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflB敲除盒的重组质粒pNZTK-PFTF-vgb,并以此进行外源基因vgb在基因组上的定向敲入。结果显示,成功敲除amyL及aprE并回收了抗性标记卡那霉素基因,敲除后淀粉酶活和蛋白酶活分别减少95.3%和80.4%;vgb基因成功整合入基因组pflB位点并回收了抗性标记四环素基因,并利用荧光定量PCR技术检测到vgb的整合表达。文中首次建立了一个适用于地衣芽胞杆菌的、抗性标记可重复使用的FLP/FRT基因编辑系统,并进行了基因敲除及基因敲入验证,为地衣芽胞杆菌遗传改造提供了良好的方法参考。     

高浓度2-KLG对氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003中2-KLG合成途径关键基因表达的影响

【目的】研究高浓度的2-KLG对其生产菌株氧化葡萄糖酸杆菌生产过程中关键的脱氢酶合成基因、辅因子合成基因及其转运蛋白编码基因的影响。【方法】测定高浓度梯度2-KLG下氧化葡萄糖酸杆菌的生长情况,确定合适的添加浓度对氧化葡萄糖酸杆菌进行胁迫。使用实时定量PCR技术检测2-KLG合成中关键山梨醇脱氢酶基因sld AB、关键辅因子PQQ合成基因pqq ABCDE及5个潜在转运蛋白合成基因的变化。【结果】根据氧化葡萄糖酸杆菌在2-KLG高浓度梯度下生长测定实验结果,选定40、80和120 g/L 2-KLG作为添加浓度。实时定量PCR结果显示,在高浓度的2-KLG压力下,PQQ合成基因pqq ABCDE未受到显著影响,山梨醇脱氢酶基因sld AB以及部分PQQ潜在转运蛋白编码基因的表达均显著下调。【结论】高浓度2-KLG会抑制氧化葡萄糖酸杆菌中山梨醇脱氢酶基因的表达,有可能会影响辅酶PQQ的转运,但不会显著影响辅酶PQQ的合成。     

食甲基杆菌J1-1吡咯喹啉醌生物合成突变株的筛选和鉴定

目的:通过Tn5转座诱变筛选食甲基杆菌J1-1吡咯喹啉醌(PQQ)生物合成相关基因。方法:构建食甲基杆菌J1-1 Tn5转座突变体库,筛选PQQ合成水平差异明显的突变株,利用质粒拯救法鉴定突变基因,通过基因敲除、回补及过表达进一步研究该基因与PQQ合成的关系。结果:构建了J1-1的Tn5转座突变体库,筛选得到一株PQQ合成水平显著下降的突变株,经鉴定Tn5插入位点为mpq0056基因,该突变株在以甲醇为惟一碳源的培养基中生长速度略慢;敲除J1-1中mpq0056基因后,PQQ的合成水平下降,与Tn5诱变结果一致;回补该基因后,PQQ产量恢复到野生菌水平。结论:mpq0056基因参与了PQQ的生物合成,该基因可能编码分支酸盐裂合酶,并在PQQ生物合成中起重要作用。     

山梨糖脱氢酶在乙酸钙不动杆菌中的表达

目的:在乙酸钙不动杆菌Y2004中表达山梨糖脱氢酶。方法:将酮古龙酸菌山梨糖脱氢酶基因sdh以及从pWH1266质粒上扩增的复制原点ori先后酶切连接到pBBR1MCS2质粒上,构建pBBR1MCS2-ori-sdh穿梭质粒;再以pBBR1MCS2-ori-sdh/DH5α为供体菌、乙酸钙不动杆菌Y2004为受体菌、pRK2013/HB101为辅助菌进行三亲本接合转移;从氨苄青霉素和卡那霉素双抗平板上挑取转化子进行培养,通过菌落PCR和提取质粒复转筛选阳性克隆,再通过活性电泳和体外糖酸转化实验检测阳性克隆的山梨糖脱氢酶活性。结果:构建了pBBRMCS2-ori-sdh质粒并转入乙酸钙不动杆菌Y2004中,活性电泳和体外实验证实阳性克隆具有山梨糖脱氢酶活性。结论:实现了山梨糖脱氢酶在乙酸钙不动杆菌Y2004中的表达,为单菌糖酸转化的进一步研究奠定了基础。     

炭疽芽胞杆菌mntA基因缺失突变株的构建及鉴定

目的:通过同源重组的方法敲除炭疽芽胞杆菌减毒AP422株的mntA基因,使菌株进一步减毒,用于构建新的疫苗候选株。方法:利用PCR方法扩增mntA基因上下游同源臂后与温敏质粒连接,构建打靶载体,并转化炭疽芽胞杆菌减毒AP422株;利用抗生素和温度2种选择压力实现同源重组,敲除目标基因mntA,然后利用Cre-LoxP系统去除抗性筛选标记,得到无抗性标记的缺失突变株,并利用PCR和Western印迹等方法对重组菌进行系统鉴定,最后分析突变株的生物学性状。结果:敲除了AP422株的mntA基因,获得了无抗性标记的缺失突变株,突变株的生存竞争能力比原始菌株明显减弱。结论:突变株获得了进一步减毒,可用于构建新的疫苗候选株。     

一种基于单交换原理的地衣芽孢杆菌基因敲除方法及应用

目的：基于同源单交换原理构建地衣芽孢杆菌基因快速敲除方法,提高基因敲除效率。方法：以地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）20085内切纤维素酶基因celb为拟敲除对象,利用重叠PCR技术将celb基因内约500bp片段与氯霉素抗性基因（Cm^r）相连接,经末端单酶切后电转化至B.licheniformis 20085感受态细胞中,仅通过一次同源单交换,将抗性基因Cm^r插入至celb基因内部,实现目的基因的敲除。结果：经过氯霉素抗性筛选和基因组PCR鉴定,成功获得celb基因缺失菌株B.licheniformis 20085Δcelb;发酵验证结果显示,B.licheniformis 20085Δcelb较原始菌株滤纸崩解能力显著降低,其中发酵60h后内切纤维素酶（CMC酶）活力由1.86U/ml降低至0.50U/ml,表明celb基因在地衣芽孢杆菌降解纤维素的过程中起着重要作用。结论：通过重叠PCR技术结合同源单交换原理能够实现地衣芽孢杆菌目的基因的快速敲除,为该菌株甚至其它微生物提供了一种基因功能快速鉴定的手段。     

兽疫链球菌透明质酸分解酶基因的敲除

以透明质酸分解酶基因（Hyl）为改造目标, 利用同源重组技术获得 Hyl基因敲除的重组菌。首先以兽疫链球菌的基因组DNA为模板扩增出部分透明质酸分解酶基因（Hyl-1）,然后将其克隆到载体pMD19-T上,再以质粒pUC19为模板, PCR扩增得到氨苄青霉素抗性基因,通过反向PCR将其插入Hyl-1基因的中部,得到基因敲除载体pMD19T-SA。该载体与质粒pBR322分别用EcoRⅠ、PstⅠ双酶切后进行连接,得到基因敲除的重组载体pBR322 SA,PCR 及限制性酶切分析,构建的敲除载体与设计结果相符。最后,利用这两种敲除载体通过同源重组技术得到一株重组菌,经PCR 及酶活鉴定,这株菌的Hyl 基因已缺失。     

大肠杆菌ptsG基因的敲除及其对L-phe生产的影响

L-phe是重要的食品和医药中间体,用大肠杆菌发酵葡萄糖生成phe时,对葡糖糖转运起重要作用的磷酸烯醇丙酮酸糖磷酸转移酶系统(PTS)对phe产量合成有很大影响,在大肠杆菌PTS系统中,葡糖糖主要由ptsG基因编码的葡萄糖特异性转运蛋白酶ⅡCBGlc转运入细胞,通过基因敲除技术获取ptsG缺陷菌株,可以减少菌株对葡糖糖的摄取,减少乙酸的生成,利于菌株的高密度发酵和相关代谢中间物获得。利用Red同源重组技术将大肠杆菌染色体上的ptsG基因进行敲除,得到PTS缺陷菌株MD-ptsG-。该菌株在以葡萄糖为惟一碳源的培养基中摇瓶培养,菌密度为对照菌株的3.5倍,L-phe产量提高12%。     

Knockout of ptsG Gene in Escherichia coli and Its Influence on Production of L-phenylalanine

L-phe 是重要的食品和医药中间体,用大肠杆菌发酵葡萄糖生成 phe 时,对葡糖糖转运起重要作用的磷酸烯醇丙酮酸糖磷酸转移酶系统(PTS)对 phe 产量合成有很大影响,在大肠杆菌 PTS 系统中,葡糖糖主要由 ptsG 基因编码的葡萄糖特异性转运蛋白酶ⅡCBGlc转运入细胞,通过基因敲除技术获取ptsG缺陷菌株,可以减少菌株对葡糖糖的摄取,减少乙酸的生成,利于菌株的高密度发酵和相关代谢中间物获得.利用 Red 同源重组技术将大肠杆菌染色体上的 ptsG 基因进行敲除,得到 PTS 缺陷菌株 MD-ptsG-.该菌株在以葡萄糖为惟一碳源的培养基中摇瓶培养,菌密度为对照菌株的3.5倍,L-phe 产量提高12％.