雌激素受体α短发夹RNA慢病毒载体的构建及其对乳腺癌干细胞的影响

目的:构建特异抑制雌激素受体α(ERα)基因的短发夹RNA(sh RNA)慢病毒表达载体,检测其对ERα的干扰效果,并探讨其对MCF7细胞中乳腺癌干细胞含量的影响。方法:以人的ERα核酸序列为靶标,根据sh RNA设计原则设计并化学合成特异的sh RNA序列,经退火处理后与p SIH-H1质粒连接,转化大肠杆菌DH5α后挑取单克隆并测序;将该克隆进行病毒包装并感染乳腺癌MCF7细胞,用嘌呤霉素进行筛选,最终得到稳定克隆;收取细胞,用Western印迹和q RT-PCR检测ERα在m RNA及蛋白水平上的变化,流式细胞术检测敲低ERα能否影响MCF7乳腺癌干细胞的含量。结果:经测序分析表明目标sh RNA序列成功插入载体,q RT-PCR检测稳定克隆,发现该sh RNA能有效抑制目的基因的m RNA转录水平,同时Western印迹检测发现内源性ERα量明显下降;流式细胞术检测发现ERα敲低的MCF7稳定克隆中雌激素诱导的乳腺癌干细胞含量上升的现象被明显抑制。结论:设计并构建的抑制ERα的sh RNA能够有效抑制ERα的表达,并下调MCF7细胞中乳腺癌干细胞的含量,为研究ERα在乳腺癌干细胞中的功能及机制奠定了实验基础。     

转录因子SOX9基因对脑胶质瘤干细胞干性维持的相关性研究

目的:应用慢病毒干扰SOX9的表达,观察其对脑胶质瘤干细胞干性维持的影响。方法:设计2条针对SOX9转录短发夹RNA(sh RNA)的DNA序列,构建慢病毒并感染胶质瘤细胞系U87、U251细胞,利用嘌呤霉素筛选稳转细胞。在转录水平及蛋白水平检测SOX9的沉默效果,利用荧光实时定量PCR(q RT-PCR)及免疫荧光染色检测相应干细胞相关标志分子SOX2、Nestin的表达差异。比较诱导形成的胶质瘤干细胞成球能力(肿瘤干细胞成球的直径),同时利用荧光实时定量PCR(q RT-PCR)及免疫荧光染色对干细胞相关标志物SOX2、Nestin的表达水平进行比较。结果:SOX9成功包装慢病毒并有效感染U87、U251细胞,实时荧光定量PCR检测其抑制率分别可降低83.74%和80.12%。并且在稳转细胞系水平相关干细胞标志分子表达含量有明显下降。在干细胞层面沉默SOX9可以明显抑制胶质瘤细胞诱导成球的直径(P0.01),同时免疫荧光显示肿瘤干细胞相关干性分子SOX2、Nestin的表达水平较对照组明显降低。结论:慢病毒感染沉默SOX9基因可以抑制胶质瘤干细胞干性的维持,为胶质瘤的生物治疗提供了重要的靶点。     

慢病毒介导的mTOR敲低肝癌细胞株HepG2的构建及初步功能检测

目的:建立高效稳定的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)小干扰RNA(siRNA)细胞导入方法,并对mTOR敲低的HepG2肝癌细胞株的功能进行初步检测。方法:构建了2条不同的人mTOR慢病毒siRNA载体pLenti-H1/mTOR siRNA,与3个包装质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒后感染HepG2细胞;经嘌呤霉素筛选2周后,收集细胞进行Western印迹,检测mTOR敲减效果及其下游基因c-myc、周期蛋白D1(cyclinD1)表达水平及4E-BP1、S6K1磷酸化水平的变化。结果:RT-PCR和Western印迹结果显示,构建的pLenti-H1/mTOR siRNA能有效抑制mTOR基因的表达,敲低了mTOR蛋白水平,且沉默mTOR后其下游基因c-myc、CyclinD1的表达水平及4E-BP1、S6K1磷酸化水平降低。结论:构建了慢病毒介导RNA干扰mTOR表达载体,为进一步研究mTOR通路奠定了实验基础。     

SETD8基因表达对乳腺癌细胞周期、活性氧及药物敏感性的影响

目的:构建SETD8重组慢病毒载体,探讨SETD8对人乳腺癌细胞周期、氧化应激的影响,并观察稳定敲低SETD8后对乳腺癌细胞多西他赛敏感性的影响。方法:构建含SETD8基因的重组慢病毒载体,经转染,荧光显微镜观察感染效率;采用RT-qPCR和Western blot检测SETD8 m RNA和蛋白相对表达量;采用流式细胞技术检测细胞周期及活性氧水平,通过CCK-8试剂检测稳定敲低SETD8基因的乳腺癌细胞对多西他赛的敏感性变化。结果:成功包装慢病毒,荧光观察慢病毒感染效率在85%左右,通过PCR和WB验证SETD8过表达及敲低稳转细胞系的效率显著(P0.01)。低表达SETD8的乳腺癌细胞周期停滞在G2/M和S期,细胞内ROS水平高于对照组。不同浓度多西他赛处理的SETD8敲低稳转细胞系的细胞活性较对照组明显降低(P0.01)。结论:慢病毒介导下调SETD8表达,使得乳腺癌细胞周期阻滞在G2/M期,细胞内ROS增多,与多西他赛发生协同作用,从而增加了药物敏感性。     

敲低心肌连接斑株蛋白对人胃癌SGC-7901细胞的迁移和侵袭能力的影响及机制研究

该文研究了敲低心肌连接斑株蛋白(junction plakoglobin,JUP)对人胃癌SGC-7901细胞迁移和侵袭的影响及其机制。通过sh RNA慢病毒介导的方式构建了敲低JUP基因的慢病毒载体序列及其阴性对照病毒,并感染至人胃癌SGC-7901细胞中,荧光检测细胞感染效率,获得JUP基因稳定沉默及其对照细胞株。用嘌呤霉素筛选阳性转染细胞株,采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)和蛋白质免疫印记法(Western blot)检测JUP表达水平。采用细胞划痕愈合实验和Transwell小室实验检测敲低JUP基因之后对人胃癌SGC-7901细胞迁移和侵袭能力的影响。采用Western blot检测敲低JUP之后β-连环蛋白水平的影响。结果显示,通过sh RNA介导的慢病毒成功构建了敲低JUP基因的人胃癌SGC-7901稳定细胞株。与对照组相比,敲低JUP表达可促进细胞的迁移和侵袭能力(P0.05),上调了β-连环蛋白的水平(P0.05)。以上结果表明,敲低人胃癌SGC-7901细胞中JUP基因表达后可促进胃癌细胞SGC-7901的迁移和侵袭能力可能与其上调β-连环蛋白的水平从而活化Wnt信号通路有关。     

短发夹RNA慢病毒载体稳定抑制NLRP3表达的HepG2细胞的构建

目的:构建针对NLRP3基因的短发夹RNA(sh RNA)慢病毒表达载体,在Hep G2细胞中鉴定该载体对NLRP3的抑制效果。方法:设计针对NLRP3基因的sh RNA序列,将其插入慢病毒表达载体p WPT-U6-sh RNA-CMV-GFP中,将载体与包装质粒ps PAX2、p MD2.G共转染293T细胞,进行病毒包装;得到的病毒原液浓缩后系列稀释为9个浓度递减的病毒液,分别转染293T细胞后进行滴度测定;用获得的慢病毒液感染人肝癌细胞系Hep G2,获得稳定沉默NLRP3的细胞株;利用实时定量PCR和Western印迹检测稳定细胞株中NLRP3的沉默效应。结果:构建了具有沉默效应的慢病毒干扰载体;稀释法测定干扰病毒滴度为2×108TU/m L;实时定量PCR和Western印迹实验均证实慢病毒转染后,细胞株中NLRP3表达水平明显降低。结论:构建了人NLRP3基因特异性慢病毒干扰载体,获得NLRP3基因稳定干扰的Hep G2细胞株。     

小鼠RNA干扰RelA基因慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建小鼠Rel A基因的RNA干扰慢病毒载体,转染小鼠成骨样细胞并鉴定。方法:针对小鼠Rel A基因序列,设计特异性的sh RNA序列,应用基因重组技术插入慢病毒载体GV-248。得到的重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选得到阳性克隆并扩大培养。所得质粒进行测序分析确定载体构建成功。重组质粒载体及包装辅助质粒转染293T细胞,得到目的病毒并测定相应病毒滴度。慢病毒转染MC3T3-E1细胞后,Real-time PCR及Western blot检测MC3T3-E1细胞Rel A基因及成骨相关基因ALP、OCN、RANKL的表达。结果:成功构建小鼠Rel A基因的RNA干扰慢病毒载体,感染MC3T3-E1细胞后,Rel A基因的表达明显受到抑制,同时RANKL基因表达水平明显下降,ALP、OCN基因表达水平明显上升。结论:成功构建了小鼠Rel A基因的RNA干扰慢病毒载体。当小鼠成骨细胞Rel A基因表达被干扰,NF-κB通路被抑制后,小鼠成骨细胞成骨相关基因ALP、OCN的表达明显上升,成骨功能增强;同时RANKL的表达明显下降,其介导的破骨细胞骨吸收功能减弱。     

新型小发卡RNA慢病毒表达载体的构建及抗乙型肝炎病毒应用评价

目的:设计用于表达新型小发卡RNA(sh RNA)的慢病毒载体,并考察其用于抗乙型肝炎病毒(HBV)的可行性。方法:对慢病毒载体骨架SapⅠ位点进行突变,并将用于表达新型sh RNA的结构亚克隆到改造后的慢病毒载体;设计靶向HBV保守序列的sh RNA并克隆到该慢病毒载体,包装含有sh RNA序列的重组慢病毒并定量,考察单个及多个sh RNA结构串联对慢病毒滴度的影响;将重组慢病毒感染HBV稳定转染肝细胞系Hep G2.CW(MOI=3),用杀稻瘟菌素筛选稳定克隆1周后,将其重新消化,并以1×105/孔接种于24孔板,于铺板96 h后取细胞上清检测HBs Ag、HBe Ag表达水平和HBV DNA的含量。结果:构建了一种用于表达新型sh RNA的慢病毒载体,并通过设计靶向HBV保守序列的sh RNA实现了HBV复制的高效抑制;发现多个sh RNA串联效果优于单个sh RNA。结论:构建的新型sh RNA慢病毒表达载体可作为防治慢性病毒感染如HBV感染的潜在有效手段之一,值得进一步研究。     

NGF基因重组慢病毒载体的构建及其在人脐带血间充质干细胞的表达

目的:构建神经生长因子(NGF)的慢病毒表达载体,并观察其转染人脐带间充质干细胞后的表达情况。方法:采用实时定量PCR(RT-PCR)方法获取NGF基因编码片段,并将构建的慢病毒载体质粒与包装质粒和包膜质粒共转染293T细胞,包装生产慢病毒。应用相同滴度的慢病毒转导等量间充质干细胞(MSCs),观察转染后细胞的生长形态及生长曲线,再采用RT-PCR、Western Blot方法检测NGF m RNA、蛋白质的表达水平。结果:经PCR、酶切和测序结果证明成功构建NGF基因重组慢病毒载体。同时NGF基因重组慢病毒载体能够成功转染人脐带间充质干细胞,转染率达95.35%,转染后干细胞在NGF m RNA及蛋白质的表达方面较对照组明显升高,同时经倒置显微镜观察及生长曲线实验证实转染后干细胞的生长与对照组相比无明显差异。结论:重组NGF的慢病毒表达载体能够高效的转染人脐带间充质干细胞,基因转染后干细胞的增殖分化能力与未转染细胞差异无统计学意义,可作为一种高效的干细胞转染方法。     

TPP1基因慢病毒干扰载体的构建及鉴定

目的:构建抑制TPP1基因的短发夹RNA(sh RNA)干扰载体。方法:以人的TPP1基因为靶序列,设计并合成sh RNA序列TPP1-si1和TPP1-si2,分别与RNA干扰慢病毒载体pll3.7连接,双酶切鉴定质粒得到阳性克隆pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2,经测序正确后将其与慢病毒包装载体(RRE、REV、VSVG)共转染293T细胞,进行病毒的包装,将得到的病毒感染稳定高表达外源TPP1蛋白的HT1080细胞,通过Western印迹检测其对TPP1蛋白表达的抑制效果,并进行比较;将抑制效果好的病毒感染高表达外源Pot1蛋白的Hep G2细胞,检测Pot1蛋白在内源TPP1被敲低的情况下能否在端粒定位。结果:经双酶切验证,外源片段成功插入载体pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2中;pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2均能明显抑制TPP1的表达,其中pll-TPP1-si1的抑制效果最好;pll-TPP1-si1病毒感染高表达外源Pot1蛋白的Hep G2细胞,经免疫荧光鉴定能够有效抑制内源TPP1的表达,使Pot1不再端粒定位。结论:构建的抑制TPP1基因的sh RNA干扰载体能有效抑制TPP1的表达,为端粒蛋白TPP1功能的研究奠定了实验基础。     

FUT8基因RNAi慢病毒载体的构建及对MCF-7细胞增殖的影响

旨在构建FUT8基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体并观察其对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响。针对FUT8基因设计3组短发夹RNA序列,退火合成双链DNA,通过连接线性化的p GC-LV-GFP载体,构建mi RNA慢病毒载体质粒,并将其转化至感受态细胞DH5α;测序验证正确后进行FUT8基因慢病毒载体的包装及病毒滴度测定,将获得的重组慢病毒p GC-sh FUT8转染MCF-7细胞,利用Real time-PCR、Western blot分别验证转染后MCF-7细胞中FUT8 m RNA及蛋白的表达,MTT法及克隆形成实验检测sh FUT8对MCF-7细胞增殖能力的影响。测序证实成功构建针对FUT8基因的RNAi慢病毒载体;慢病毒载体经293T细胞包装成功,测定病毒悬液滴度5×108 TU/m L;荧光显微镜下观察各转染组细胞GFP的表达,转染效率达90%以上;Real-time PCR、Western blot结果显示干扰组FUT8的m RNA及蛋白表达水平较对照组显著降低,其中p GC-sh FUT8-2序列对FUT8基因的干扰效率可达80%,干扰效果最佳,FUT8沉默后MCF-7细胞增殖能力下降。     

p300基因小干扰RNA慢病毒载体的构建及其对乳腺癌ZR75-1细胞的影响

目的:构建p300基因的小干扰RNA(siRNA)慢病毒表达载体,检测其对p300蛋白表达的干扰,以及对乳腺癌细胞ZR75-1生长的影响。方法:利用RNA干扰(RNAi)技术设计并合成针对p300基因的siRNA,并将其克隆到siRNA表达载体pSIH-H1上,经酶切和测序验证,用293T人胚肾细胞包装p300 siRNA慢病毒,感染乳腺癌细胞ZR75-1,建立敲低p300表达的稳定细胞株,通过实时定量PCR和Western印迹检验RNAi的干扰效果,利用细胞生长实验检测p300 siRNA对ZR75-1细胞生长的影响。结果:酶切和测序证明构建了p300 siRNA真核表达载体;实时定量PCR和Western印迹证明构建的siRNA能有效抑制p300基因的表达,并建立了敲低p300表达的稳定细胞株;细胞生长实验证实p300 siRNA可有效促进ZR75-1细胞的生长。结论:构建了p300基因的siRNA真核表达载体,转染细胞后能有效抑制p300基因的表达,且能促进ZR75-1细胞的生长,表明构建的p300 siRNA具有功能。     

一种高效抑制Jurkat细胞表达RhoGDI2的方法

目的:RhoGDI2是RhoGTP酶的解离抑制因子,在白血病细胞内表达量很高。构建Rho GDI2短发夹RNA(sh RNA)的慢病毒载体,并鉴定该慢病毒在急性T细胞白血病细胞系Jurkat内的抑制效率。方法:针对人rho GDI2基因序列合成sh RNA序列,通过限制性内切酶Bam HⅠ和XhoⅠ、T4DNA连接酶,将该sh RNA序列插入慢病毒载体p EN_h H1c,测序正确后通过LR重组酶与p DSL_hp UGIP重组,转化感受态细菌,筛选阳性克隆,测序鉴定正确后用脂质体法将质粒与ps PAX2、p MD2共转染293T细胞、包装病毒并侵染Jurkat细胞,采用荧光显微镜观察侵染效率、West-ern印迹鉴定Rho GDI2 sh RNA在Jurkat细胞内的表达。结果:构建的Rho GDI2 sh RNA慢病毒成功侵染Jurkat细胞并抑制Rho GDI2的表达。结论:构建并鉴定了RhoGDI2 shRNA的慢病毒表达质粒,为研究RhoGDI2在白血病中的作用奠定了基础。     

长非编码RNAZ38对BT549细胞多能因子表达调控的初步研究

该文旨在研究长非编码RNA Z38对BT549细胞中多能因子表达的影响。通过流式细胞术和实时荧光定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)进行Z38与CD44+CD24–/low亚群细胞相关性分析,并利用慢病毒Z38-sh RNA感染BT549细胞以干扰Z38表达,通过RT-qPCR和蛋白质印迹实验检测多能因子表达水平。结果显示,Z38表达水平与CD44+CD24–/low亚群细胞比例存在差异性,以BT549细胞Z38表达水平和CD44+CD24–/low比例相对较高,干扰BT549细胞Z38表达水平后,CD44+CD24–/low比例下降,NANOG和SOX2 m RNA和蛋白质水平皆被下调,而OCT4 m RNA和蛋白质水平无明显变化。干扰Z38影响BT549多能因子的表达,尤其可下调与乳腺癌干细胞分化密切相关的NANOG和SOX2基因表达,提示它可能与乳腺癌干细胞的分化有关。     

慢病毒介导SRB-1 受体基因沉默对人脑小胶质细胞吞噬Aβ蛋白能力的影响

目的:利用慢病毒载体筛选人脑小胶质细胞(HM1900)清道夫受体SRB1基因敲减稳定细胞系,检测该细胞系对AD致病蛋白Aβ的吞噬水平变化。方法:采用反转录PCR确认人脑小胶质细胞(HM1900)SRB1(Gene ID:949)基因表达情况,利用软件设计三组不同序列的针对人SRB1基因的慢病毒sh RNA干扰载体,包装为慢病毒感染HM1900细胞,实时荧光定量PCR检测各慢病毒干扰载体的靶基因干扰效率。选用干扰效果最佳的RNA干扰慢病毒筛选并获得SRB1基因敲减细胞系,稳定传代后用realtime-PCR检测SRB1受体表达下调情况。通过蛋白内吞实验测定基因敲减后该细胞系对病理蛋白Aβ的吞噬能力,与正常小胶质细胞进行比较。结果:利用筛选出的干扰载体完成对HM1900细胞系的SRB1基因敲减,荧光定量PCR检测显示SRB1基因在靶细胞HM1900中表达抑制率达83.7%。蛋白内吞实验显示该基因敲减细胞系对病理蛋白Aβ的吞噬能力下降到对照组的57%(P0.05)。结论:通过慢病毒载体成功建立SRB1基因稳定敲减的人脑小胶质细胞系,SRB1受体参与了小胶质细胞对病理蛋白Aβ的吞噬及清除过程。     

慢病毒载体介导的层黏连蛋白受体稳定抑制细胞株的建立

目的:构建靶向层黏连蛋白受体(LR)基因的小发卡RNA(sh RNA)慢病毒表达载体,鉴定其对LR的抑制效果,并筛选LR稳定抑制的He La细胞株。方法:设计针对LR的sh RNA序列,将此序列和H1启动子克隆入含有EGFP报告基因的p Lenti6/v5慢病毒表达载体,通过病毒包装、细胞感染、抗生素筛选获得稳定细胞株,用real-time PCR和Western印迹检测筛选得到的稳定细胞株中LR的表达水平。结果和结论:构建了含有LR靶向sh RNA的慢病毒表达载体,包装成病毒后感染He La细胞,经抗生素筛选后获得了稳定抑制LR的细胞株;筛选后的细胞均可观察到报告基因EGFP的表达;经m RNA和蛋白水平检测,LR-sh6和LR-sh7均可显著抑制He La细胞株中LR的表达。     

下调人脐带间充质干细胞Mbd3基因shRNA慢病毒的构建及鉴定

研究构建靶向抑制人Mbd3表达的sh RNA慢病毒颗粒,感染人脐带间充质干细胞并用嘌呤霉素筛选获得Mbd3稳定下调的细胞系,为进一步探讨Mbd3在诱导型多潜能干细胞形成中的作用提供实验基础。研究根据Gene Bank中公布的Mbd3基因序列设计特异性si RNA干扰序列并合成可产生sh RNA的双链DNA,经双酶切后克隆至p LVsh RNA-EGFP(2A)Puro载体上构建慢病毒重组质粒,转化DH5α大肠杆菌PCR检测筛选阳性质粒,利用HEK293Ta包装产生含有Mbd3sh RNA的慢病毒颗粒。通过RT-PCR和Western blot检测慢病毒感染人脐带间充质干细胞(h UC-MSC)后Mbd3的转录和蛋白表达情况,进一步检测重组慢病毒对Mbd3的沉默效果并筛选出最佳抑制效果的sh RNA慢病毒载体。结果显示成功构建并筛选出下调Mbd3的最佳慢病毒干扰载体,慢病毒感染人脐带间充质干细胞48h后于荧光显微镜下可见绿色荧光,经嘌呤霉素筛选9 d后,RT-PCR检测Mbd3表达显著降低,Western blot检测Mbd3蛋白表达明显减少。说明构建的sh RNA重组慢病毒包装成功,具有较高的感染活性,可有效抑制人脐带间充质干细胞Mbd3的表达,为后续研究脐带间充质干细胞跨胚层分化打下前期研究基础。     

敲低CXCR4表达抑制胃癌细胞HGC27的增殖

目的:初步探索CXCR4与胃癌细胞HGC27增殖的关系。方法:构建携带CXCR4短发夹RNA(shRNA)的慢病毒载体质粒,并转染至293T细胞中,48 h后收集上清感染HGC27细胞,用Western印迹鉴定其干扰CXCR4蛋白表达的效果,采用CCK8实验检测敲低CXCR4表达对HGC27细胞增殖的影响。结果:双酶切鉴定和基因测序表明敲低CXCR4慢病毒载体质粒构建成功;慢病毒感染后有效抑制HGC27细胞中CXCR4蛋白水平,敲低CXCR4表达对HGC27细胞增殖有显著的抑制作用。结论:CXCR4参与了胃癌细胞HGC27的增殖,提示CXCR4有望成为一个新的胃癌治疗靶点。     

利用慢病毒载体建立fractalkine基因敲低的HK-2稳定细胞株

目的利用慢病毒载体建立fractalkine(FKN)基因敲低的HK-2稳定细胞株,为探讨FKN基因在肾脏组织肾小管上皮细胞转分化(EMT)重构中的作用奠定实验基础。方法通过双酶切将FKN目的基因连接到GV248载体(hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin),经扩增、转化、验证、测序、质粒抽提,将携带目的基因的工具GV248载体质粒及病毒包装辅助质粒Helper1.0、Helper2.0转染293T细胞,完成慢病毒包装及质量检测后获取慢病毒工具载体LV-FKN-RNAi,病毒感染HK-2细胞72h后筛选稳定表达的细胞株HK-2/LV-FKN-RNAi,采用Western blot测定FKN的表达水平,CCK-8检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果经对比,构建LV-FKN-RNAi阳性克隆序列与目的基因FKN相符;HK-2细胞达到80%感染效率的最佳感染条件为:在Enhanced Infection Solution(ENi.S)培养基中进行感染,设定感染复数(MOI)为10,感染时间为72h。Western Blot结果显示,经筛选的HK-2/LV-FKN-RNAi细胞中FKN基因表达水平降低;细胞形态成梭形,多有伪足出现。CCK-8检测显示,FKN基因敲低组细胞活力降低;流式细胞术检测显示,FKN基因敲低组细胞凋亡率增加。结论本研究成功构建一种低表达FKN基因的慢病毒载体;LV-FKN-RNAi感染HK-2细胞后可实现目的基因的低表达,并且FKN基因敲低后HK-2细胞活力下降,凋亡率增加。经筛选的HK-2/LV-FKN-RNAi细胞株可用于后续实验研究。     

JNK1基因沉默对3T3-L1脂肪细胞高分子量脂联素表达的影响

利用短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)构建慢病毒载体,利用慢病毒感染3T3-L1细胞,沉默3T3-L1脂肪细胞的JNK1基因,观察其受抑制后二硫键A氧化还原酶样蛋白(disulfide-bond A oxidoreductase-like protein,Dsb A-L)和高分子量(high molecular weight,HMW)脂联素表达的影响。建立携带sh RNA-JNK1的慢病毒载体,用q PCR和Western blotting从基因和蛋白水平筛选出最佳干扰效果的sh RNA-JNK1慢病毒。利用筛选出的sh RNA-JNK1慢病毒沉默3T3-L1脂肪细胞JNK1基因,通过Western blotting检测Dsb A-L、HMW脂联素的表达,并探讨了JNK1基因沉默是否干扰了AMPK通路的活化。在3T3-L1细胞中筛选出对JNK1沉默效果最佳的sh RNA-JNK1组,抑制率达到60%以上(p0.001)。用sh RNA-JNK1慢病毒感染3T3-L1脂肪细胞,用Western blotting检测,结果 AMPK、P-AMPK、Dsb A-L和HMW表达明显增加(p0.001);在3T3-L1脂肪细胞中sh RNA-JNK1慢病毒逆转了AMPK抑制剂Compound C对AMPK、P-AMPK、Dsb A-L和HMW脂联素表达的抑制。3T3-L1脂肪细胞中,沉默JNK1基因后可促进Dsb A-L和HMW脂联素的表达,且JNK1有可能通过AMPK通路实现对脂联素多聚化的调控。