爪哇棒束孢侵染美国白蛾过程及抗氧化酶活性变化

[目的]爪哇棒束孢Isaria javanica是一种重要的虫生真菌,已广泛应用于多种害虫的防治.本研究从美国白蛾Hyphantria cunea僵虫尸体中分离出对美国白蛾具有致病作用的爪哇棒束孢BE01菌株,为了解该菌株对美国白蛾的侵染过程,并通过研究宿主体内抗氧化酶系对爪哇棒束孢BE01菌株入侵的响应,评价该菌的杀虫作用,为爪哇棒束孢BE01防治美国白蛾提供依据.[方法]采用扫描电镜技术,观察爪哇棒束孢BE01分生孢子侵染的美国白蛾3龄幼虫,并测定美国白蛾接菌后体内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)含量的变化.[结果]爪哇棒束孢对美国白蛾侵染过程包括:分生孢子粘附在美国白蛾的角质层上,接种后6h孢子开始萌发,24h产生附着胞,48 h菌丝在体表继续生长,96h菌丝从虫体内长出并产分身孢子,120 h菌丝覆盖整个虫体.在受到爪哇棒束孢BE01侵染后,美国白蛾幼虫体内的3种抗氧化酶SOD、POD、CAT酶活性明显升高,并在侵染48 h时达到峰值.随着侵染时间的增加,48 h后3种酶的活性开始下降, 60 h后酶活性均低于对照组.[结论]爪哇棒束孢BE01孢子活力高、萌发速率快,导致美国白蛾体内的保护酶系难以发挥保护作用.爪哇棒束孢BE01菌株能够快速侵染美国白蛾幼虫,具有开发成新的高效生物防治菌株的潜能.     

2株越南槐内生真菌的抗菌活性及菌株鉴定

以2种人体病原细菌为靶标菌,采用琼脂块法从越南槐内生真菌中筛选拮抗菌株,以改良的微量肉汤稀释法测定其代谢产物的抗菌活性;根据形态和分子特征鉴定拮抗菌株的分类学地位。结果表明,菌株JXRPH-14和TRXY-9的活菌块对病原细菌的抑菌圈直径分别约等于或大于阳性对照;其代谢产物对病原细菌的最小抑菌浓度为20~40μg/m L,仅为阳性对照的20~40倍;初步鉴定这2株内生菌为不同的镰孢菌。菌株JXRPH-14和TRXY-9鉴定为不同的镰孢菌,对参试2种人体病原细菌均显示较强的抗菌活性,具有较大的开发应用潜力。     

家蝇共生真菌的抗菌活性筛选及菌株CY-03的初步鉴定

利用平板分离法从家蝇中分离出14株家蝇共生真菌,活性筛选表明CY-03有较好的抗菌活性,在供试浓度为0.1 mg/m L时,CY-03发酵液乙酸乙酯萃取物对番茄早疫病菌和苹果树腐烂病菌具有较好的抑制作用,抑制率约60%;在供试浓度为30μg/滤纸片时,与阳性对照相比,乙酸乙酯提取物对枯草芽胞杆菌有中等的抑制作用,抑菌圈直径为21.0 mm。进一步研究CY-03发酵液不同极性溶剂萃取物的抗菌活性,结果表明其活性物质主要集中在中等极性部位,在供试浓度为0.1 mg/m L时,CY-03发酵液乙酸乙酯提取物对苹果树腐烂病菌、杨树溃疡病菌、番茄早疫病菌和苦瓜枯萎病菌等具有较好的抑制作用,抑制率均大于45%;在供试浓度为30μg/滤纸片时,乙酸乙酯提取物对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌和大肠埃希菌有中等的抑制作用,抑菌圈直径范围为14.8~23.0 mm。通过形态学特征观察和5.8S r DNA测序分析,初步确定该菌株为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。CY-03作为微生物源杀菌剂值得进一步研究。     

从红树植物中筛选具有抗菌、抗氧化和抗肿瘤活性的内生真菌

从红树植物无瓣海桑(Sonneratia apetala),海马齿(Sesuvium portulacastrum)和秋茄(Kandelia candel)中分离得到25株内生真菌,采用滤纸片琼脂扩散法、自由基清除法(DPPH、.OH和ABTS+)和MTT法对其发酵液上清乙酸乙酯抽提物的抗菌、抗氧化和抗肿瘤活性进行研究。结果显示,有12株菌株至少对一种指示菌有抑制作用,占总供测菌株的48%;对DPPH自由基、.OH自由基和ABTS+自由基具有较强清除作用(0 mg/mL﹤EC50≦1 mg/mL)的菌株分别有3株、12株和8株;对HepG2肿瘤细胞或HeLa肿瘤细胞具有抑制作用(抑制率>50%)的有8株菌株。研究结果表明,红树植物来源的内生真菌能够产生丰富的抗菌、抗氧化和抗肿瘤活性物质,是开发抗菌、抗氧化和抗肿瘤药物的重要资源。     

一种白僵菌中MAO抑制剂的分离纯化和结构鉴定

本研究对前期筛选出的一株具有较强的单胺氧化酶(MAO)抑制活性的白僵菌菌株Ba02进行了液体培养;通过不同提取剂的提取效果比较,发现乙酸乙酯能较好地提取出该发酵液中单胺氧化酶抑制剂。通过活性指导下的色谱分离,从乙酸乙酯提取物中得到了一种深红色粉末状化合物。活性测定结果显示该化合物在15μg.mL-1时对MAO-A和MAO-B的抑制率分别为97.50%和95.34%。MS和NMR的鉴定结果表明该化合物为卵孢菌素(Oosporein)。虽然该化合物是一已知化合物,但其对单胺氧化酶的抑制活性尚属首次发现。     

一株产紫杉醇菌的分离及其代谢产物对HeLa细胞抑制作用的研究

从东北红豆杉Taxus cuspidata的主干和侧枝树皮及皮下分离筛选得到181株纯化的内生菌株。经过摇瓶发酵培养,再用甲醇、乙酸乙酯萃取抽提,抽提产物经以标准紫杉醇为对照的薄层层析(TLC)、高效液相色谱(HPLC)、质谱(MS)分析,发现有1株菌株HD181-23能够产生紫杉醇,其紫杉醇产量为206.34μg/L。对菌株HD181-23菌落、菌丝体和孢子形态和产孢特征进行了研究,表明菌株HD181-23为葡萄孢属的种,暂定为Botrytissp.。该菌株的发酵提取纯化产物经HeLa细胞毒实验,结果显示对HeLa细胞具有较强的抑制作用。     

三种水生植物内生真菌多样性及其抗真菌活性

从华凤仙(Impatiens chinensis L.)、问荆(Equisetum arvense L.)和轮叶狐尾藻(Myriophyllum verticillatum L.) 3种植物中共分离到内生真菌155株。经鉴定, 它们分属于26个不同的分类单元。以杨桃炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、香蕉疫霉(Phytophthora nicotianae)和腐皮镰刀菌(Fusarium solani)等6种植物病原真菌为指示菌, 对3种水生植物内生真菌代谢产物进行抗菌活性研究。结果表明, 有37株内生真菌(占分离菌株总数的23.9%)显示出对一种或多种病原菌的抑菌活性。来自华凤仙、问荆和轮叶狐尾藻的抗菌活性菌株比例分别为29.2%、13.9%及37.1%, 都远低于已报道的陆生植物内生真菌中活性菌株的比例。抗菌活性菌株主要分布于枝孢属(Cladosporium)、木霉属(Trichoderma)和地霉属(Geotrichum)等5个属中。     

一种被毛孢菌丝体中抗肿瘤活性组分的分离纯化和液质联用分析

在一次多菌株的生物活性测定中,发现一株被毛孢菌株RCEF0851菌丝体提取物具有较强的抗肿瘤CHO细胞的活性。本研究用不同溶剂对活性组分进行了提取试验,发现乙酸乙酯能最大程度地提取出该活性成分。分离试验表明该提取物较适于用反相柱Synergi Hydro进行分离。活性指导下的分离得到一活性组分的纯品Hh-1。该组分在40μg/mL时对CHO细胞的抑制率达到83.61%。高分辨质谱分析表明该活性化合物的可能分子式是C30H22O10。该分子为首次从虫生真菌中发现。     

蒜头果内生真菌次生代谢产物抑制人类致病菌活性的研究

蒜头果是我国特有的单种属稀有树种,为了进一步开发利用蒜头果树皮内生真菌的抗菌活性化合物,该研究对来自蒜头果的植物内生真菌(白黄笋顶孢霉、哈茨木霉、大棘黑团孢、枝状枝孢菌、斑污拟盘多毛孢、赭绿青霉、淡紫紫孢菌、朱黄青霉、Xenoacremonium recifei、Xylaria feejeensis)进行液体培养,10 d后回收培养液并用乙酸乙酯萃取获得初提物,采用抑菌圈法检测蒜头果内生真菌初提物抑菌活性,同时测定了最低抑菌浓度(MIC)。结果表明:白黄笋顶孢霉、大棘黑团孢、枝状枝孢菌、斑污拟盘多毛孢、赭绿青霉、淡紫紫孢菌均有抑菌活性,大棘黑团孢、斑污拟盘多毛孢、淡紫紫孢菌的初提物均对缓慢芽孢杆菌、无乳链球菌和藤黄微球菌有明显抗菌活性,最低抑菌浓度在1.562 5~6.25 mg·m L~(-1)之间。这说明蒜头果树皮内生真菌的次生代谢产物具有抗菌活性,各内生真菌次生代谢产物的抗菌效果不同。     

两种八角莲内生真菌的生物活性研究

测定云南八角莲Dysosma aurantiocaulis和川八角莲Dysosma veitchii内生真菌的生物活性,为进一步从内生真菌中寻找活性成分提供指导,也为认识内生真菌相互作用提供有益的参考。从两种八角莲中分离出内生真菌187株,用滤纸片法测抗菌活性,用卤虫模型测抗卤虫活性得知大部分菌株发酵液都有活性,高活性菌株主要集中在镰孢霉属Fusarium、青霉属Penicillium、木霉属Trichoderma、丛梗孢属Monilia、毛壳菌属Chaetomium、无孢类群Mycellia sterilia、小齿梗霉属Rhinotrichum、无梗孢属Trichocladium和胶帚霉属Gliocladium。云南八角莲和川八角莲内生真菌是活性成分筛选的重要来源,并且通过活性分析发现:发酵液的活性强于菌丝体;云南八角莲的抗细菌活性菌株多于川八角莲。     

杜比亚蟑螂共生真菌次生代谢产物及其生物活性

为探究杜比亚蟑螂体内共生真菌种类,测定共生真菌次生代谢产物的抑菌活性和抗氧化活性,筛选出具有抗菌和抗氧化活性的菌株,本研究采用组织块分离法分离杜比亚蟑螂体内的共生真菌,通过形态学和分子生物学相结合的方法对分离到的共生真菌进行鉴定;分别采用薄层层析-生物自显影法和DPPH法测定共生真菌次生代谢产物的抗细菌活性和抗氧化活性。结果表明,从杜比亚蟑螂体内共分离鉴定得到5种不同的共生真菌,主要分布于青霉属(1株)、曲霉属(3株)和聚孢霉属(1株)。活性测定的结果表明,菌株Bdf-2、Bdf-4和Bdf-5表现出较好的抗菌活性,且菌液提取物的抗菌活性要强于菌丝。Bdf-1,Bdf-2和Bdf-3菌液次生代谢产物表现出抗氧化活性,IC 50值分别为0.26 mg/mL、2.20 mg/mL和0.75 mg/mL。杜比亚蟑螂共生真菌以青霉属和曲霉属为主,且具有抗菌和抗氧化活性的次生代谢产物主要分布于菌液中。     

一株感染杨尺蠖蛹的病原真菌的分离及鉴定

【目的】从山西省洪洞县的杨树丰产林中采集到几头自然染菌的杨尺蠖Apocheima cinerarius越冬蛹虫尸,经分离纯化得到一株病原真菌,定名为YHT01,确定该菌株的分类地位。【方法】用该菌株孢子悬浮液(1.0×108 conidia/m L)感染杨尺蠖蛹进行回接杀虫实验,扫描电镜观察菌株形态学特征,ITS序列测定并构建系统发育树对YHT01菌株进行分子鉴定。【结果】经YHT01菌株感染之后,杨尺蠖蛹节间处长出白色菌丝。该菌株在PDA培养基上的菌落呈椭圆形,白色,绒毛状,菌落背面呈橙黄色;扫描电镜观察结果显示,该菌株孢梗束呈扫帚状,分生孢子小,卵形至椭圆形,壁光滑,大小为(2.1-3.4)μm×(1.1-1.8)μm。该菌株的r DNA-ITS序列与Gen Bank中粉棒束孢Isaria farinosa(Holm:Fr.)Fr.(AB233337)的序列相似性达99%,在系统发育树的同一分支上。【结论】YHT01是杨尺蠖蛹的一株病原真菌,粉棒束孢Isaria farinosa。     

解淀粉芽孢杆菌TF28抗菌脂肽芬芥素的分离鉴定及抑菌作用

对一株解淀粉芽孢杆菌TF28产生的抗菌脂肽进行分离鉴定及抑菌活性研究,采用酸沉淀、乙酸乙酯和甲醇萃取技术制备了抗菌脂肽粗提物,经过2次HPLC分离纯化,在保留时间32～42min内获得8个抗菌脂肽纯品,经MALDI-TOF-MS鉴定为芬芥素(fengycins),对尖孢镰刀菌和禾谷镰刀菌显示出较强的抑菌活性,该研究为提高菌株TF28抗菌脂肽产量的定向遗传改造奠定基础。     

瓦布贝母内生真菌共培养发酵产物抗氧化活性研究

采用DPPH自由基清除、ABTS自由基清除及FRAP铁离子还原能力三种方法对五株瓦布贝母内生真菌单培养、两两共培养无菌发酵液进行抗氧化活性研究,再测定活性较高组合发酵液的石油醚(30~60℃)、乙酸乙酯和正丁醇提取物的抗氧化活性,以维生素C作为阳性对照。结果发现在瓦布贝母内生真菌两两共培养中,4WBY1+WBS019、6WBY3+WBS019和WBS019+WBS020三个组合无菌发酵液的抗氧化活性至少在两项抗氧化方法评价下均极显著高于单培养。试验还发现,上述三个组合的乙酸乙酯提物和正丁醇提物的抗氧化活性较强;WBS019+WBS020组合的乙酸乙酯提物在1.8 mg/m L时,对DPPH自由基清除率可达74.38%±0.65%;6WBY3+WBS019组合的正丁醇提取物(IC_(50)=0.25 mg/m L)对ABTS自由基清除作用与维生素C(IC_(50)=0.07mg/m L)相对接近;三个组合的各提取物对Fe3+还原能力均较弱,远低于阳性对照。说明在适当条件下开展内生真菌共培养具有潜在利用价值。     

三株亚肉座菌乙酸乙酯提取物生物活性及GC-MS分析

采用乙酸乙酯提取3株亚肉座菌菌丝体,测试虫生真菌乙酸乙酯提取物（EAE）的抗肿瘤、抗菌和抗氧化活性,并借助GC-MS方法分析各提取物中的化学成分。结果发现2株亚肉座菌的菌丝体EAE对HepG2细胞的抑制活性较强,IC₅₀均小于9μmol/L;抗菌结果表明2株真菌的提取物具有抑制细菌生长的作用;1株供试菌的EAE表现出较强的DPPH自由基清除活性（清除率可达85%）。GC-MS分析表明从亚肉座菌JXJG201717、JXJG201720和ARSEF7697的EAE中分别鉴定出21、35和39种成分,主要成分为酯类、醇类和酸类;盘状亚肉座菌JXJG201720与ARSEF7697有相同化合物13个,与暹罗亚肉座菌JXJG201717存在7个相同化合物。本研究表明虫生亚肉座菌具有产生丰富活性成分的能力,彰显出多种利用价值。     

拜赖青霉活性产物的抗真菌作用研究

采用平板对峙实验和生长速率法,筛选和测定拜赖青霉ACCC 30440对尖孢镰刀菌与大丽轮枝菌的抑制活性。结果表明,ACCC 30440的PDB发酵液和乙酸乙酯提取物均能够抑制尖孢镰刀菌与大丽轮枝菌的生长,含10%发酵液的培养基对尖孢镰刀菌与大丽轮枝菌的抑制率均达40%以上,含20%发酵液则可完全抑制这两株病原真菌的生长;ACCC30440的乙酸乙酯提取物对尖孢镰刀菌与大丽轮枝菌的半抑制浓度分别为518.63μg/m L和443.42μg/m L。说明拜赖青霉ACCC 30440菌株能够产生抑制植物病原真菌生长的活性物质。     

人工蝉花孢梗束粗多糖的提取工艺和活性

通过单因素试验和正交试验研究了人工蝉花孢梗束粗多糖的提取工艺,并通过粗多糖对果蝇寿命、果蝇体内SOD活性及MDA含量的影响研究了粗多糖的活性。试验结果表明:人工蝉花孢梗束粗多糖的最佳提取工艺为液料比20∶1、时间2 h、温度90℃、浸提2次、醇沉乙醇浓度70%、醇沉时间为24 h;在该条件下的粗多糖得率为8.65%。孢梗束粗多糖能明显延长雌雄果蝇的寿命,延长率分别为18.78%和26.23%;孢梗束粗多糖能显著提高雌雄果蝇的SOD活性,并明显降低了雄性果蝇体内MDA含量,说明人工蝉花孢梗束粗多糖具有抗氧化活性和延长果蝇寿命的作用。     

云南程海湖淡水真菌抗菌活性筛选

从云南程海湖分离到473株淡水真菌,用滤纸片法测定其抗菌活性,活性菌株经显微形态观察进行分类鉴定。结果显示有290株菌对至少1种病原菌具有抗菌活性,占总菌株数的61.31%;高抗菌活性菌株59株(抑菌圈直径≥15 mm),占总菌株的12.47%。将具有抗菌活性的菌株鉴定为46个属,优势属为青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)和枝孢属(Cladosporium)。     

固态发酵苦荞制备多肽菌种的筛选

【目的】筛选固态发酵苦荞高产多肽及发酵产物液具有抗菌、抗氧化活性的菌株。【方法】采用米曲霉、酱油曲霉、雅致放射毛霉和少孢根霉分别对苦荞进行固态发酵,以蛋白酶活力、水解度、可溶性肽得率、抑菌率和体外自由基清除率作为筛菌指标。【结果】米曲霉固态发酵苦荞的可溶性肽得率最高达38.83%±1.18%,发酵产物液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为96.62%±1.66%和97.54%±0.54%,同时羟自由基(·OH)清除率和二苯基苦味酰基苯肼自由基(DPPH·)清除率分别为55.65%±1.25%和10.84%±1.03%。对米曲霉发酵2 d发酵产物液的不同分子量分布及活性分析表明,分子量大小对抗菌及抗氧化活性有一定的影响。【结论】米曲霉可作为固态发酵苦荞制备多肽且发酵产物液具有抗菌及抗氧化活性的最佳菌株,并在多肽产量提升及抗菌、抗氧化活性的研究上具有巨大空间。     

球孢白僵菌不同菌株清除自由基活性评价

选择不同来源的12株球孢白僵菌,分别测定菌丝体2种溶剂提取物在不同抗氧化模型中的抗氧化作用。结果表明,不同溶剂提取物对二苯基苦味酰基苯肼自由基(DPPH)和羟自由基(.OH)均有清除作用,但是清除自由基的活性不同,乙酸乙酯提取物对.OH的清除作用最为显著,活性较高,最高清除率达到71.54%。甲醇提取物活性均较低,30 min时甲醇提取物对DPPH和.OH清除率最高分别为36%和38.96%,12株白僵菌间的清除自由基活性有较大的差异。