耐高温重组CotA蛋白的胆红素氧化酶反应动力学及活性鉴定

已知源于枯草芽孢杆菌内生孢子的CotA蛋白具有漆酶和胆红素氧化酶活性。然而,其分离纯化极为困难。本研究对表达与纯化的重组CotA蛋白的胆红素氧化酶特性及氧化还原功能进行鉴定。基因转染及筛选获得了表达CotA的P. pastoris菌株|继而,表达的重组CotA蛋白经DEAE-Sepharose FF 及Sephadex G-75层析分离与纯化,产物得率为25%,纯化产物的酶比活性为 4 U/mg。经SDS-PAGE 和 MALDI-TOF MS 分析显示,其分子质量为65 kD。纯化的CotA蛋白能够催化胆红素氧化,生成胆绿素,且催化反应速率受反应溶液中溶解氧含量的影响,提示纯化的重组CotA具有胆红素氧化酶活性。酶反应进一步证明,CotA的胆红素氧化酶反应最适pH值为pH 8.0,最适温度为60℃。该酶在90℃条件下的半衰期为7 h,提示CotA胆红素氧化酶具有高度的热稳定性。CotA修饰的摄谱仪石墨电极可直接电催化分子氧（O2）还原,具有很好的电流响应。我们的结果表明,重组的CotA蛋白具有耐高温胆红素氧化酶活性。更重要的是,我们的结果还提示重组的CotA蛋白在酶生物燃料电池阴极的制备上具有较好的应用潜能。     

一种来源于克劳氏芽孢杆菌的高碱性尿酸氧化酶的异源表达及重组酶性质分析

以碱性蛋白酶生产菌克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)基因组DNA为模板PCR扩增获得尿酸氧化酶基因(BcU),插入原核表达载体pET28α中,构建表达载体pET-BcU,并转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-BcU。经IPTG诱导,重组菌BL21(DE3)/pET-BcU表达出有活性的尿酸氧化酶,含空质粒的重组菌在同样条件下没有酶活。酶学性质分析显示,重组酶最适pH值为9.0,在pH值9.0～11范围内酶活几乎不变,是一种高碱性尿酸氧化酶。     

嗜热枯草芽孢杆菌普鲁兰酶基因的表达与重组酶的性质

克隆嗜热枯草芽孢杆菌WY-34普鲁兰酶基因并在大肠杆菌中进行表达,对重组酶进行纯化和酶学性质研究,根据枯草芽孢杆菌的普鲁兰酶蛋白序列,设计PCR引物对WY-34的普鲁兰酶基因进行克隆及异源表达.对表达蛋白的最适pH、pH稳定性及最适温度、温度稳定性等特性进行研究,并测定重组普鲁兰酶的底物特异性.将普鲁兰酶基因pluA克隆及分析序列后,发现基因长度为2.2 kb,编码718个氨基酸,在大肠杆菌中异源表达.通过Ni-IDA亲和层析一步纯化得到比活力为93.2 U/mg的纯酶,SDS-PAGE和凝胶层析测定的分子量分别为76.2 kD和74.3 kD.酶学性质研究表明,该酶的最适温度为40℃,在温度不高于45℃条件下稳定;最适pH为6.0,同一温度下pH 6.0-9.0范围内处理30 min可以保持80％以上的酶活力,此酶对普鲁兰糖有很强的底物特异性.此重组普鲁兰酶的酶学性质表明此酶具有一定的工业化应用价值.     

巨大芽孢杆菌分子伴侣GroES和GroEL新基因的克隆及同源性分析

巨大芽孢杆菌作为革兰氏阳性细菌的一种,是良好的重组蛋白的表达宿主.本研究利用PCR技术从巨大芽孢杆菌基因组克隆出一条1.9Kb的基因片段.核酸序列分析结果表明,该片段全长1984bp,包含2个ORF,分别与芽孢杆菌来源的GroES和GroEL基因有高度的相似性.氨基酸序列比对发现,GroES蛋白与枯草芽孢杆菌来源的GroES蛋白氨基酸序列同源性为91%,GroEL蛋白氨基酸序列同源性为90%.     

巨大芽孢杆菌分子伴侣GroES和GroEL新基因的克隆及同源性分析

巨大芽孢杆菌作为革兰氏阳性细菌的一种,是良好的重组蛋白的表达宿主.本研究利用PCR技术从巨大芽孢杆菌基因组克隆出一条1.9 Kb的基因片段.核酸序列分析结果表明,该片段全长1 984 bp,包含2个ORF,分别与芽孢杆菌来源的GroES和GroEL基因有高度的相似性.氨基酸序列比对发现,GroES蛋白与枯草芽孢杆菌来源的GroES蛋白氨基酸序列同源性为91%,GroEL蛋白氨基酸序列同源性为90%.     

嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp. N16-5表达载体的构建

【目的】构建可以在嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.N16-5中表达外源基因的表达载体。【方法】以枯草芽孢杆菌表达质粒pHCMC04为基本骨架,删除木糖诱导的启动子和木糖阻遏蛋白基因,分别插入枯草芽孢杆菌组成型强启动子P43和嗜碱芽孢杆菌N16-5的组成型启动子P EF,构建表达载体pABN165P43和pABN165P EF;将绿色荧光蛋白基因gfp作为报告基因连接至表达载体得到pABN165P43-gfp和pABN165P EF-gfp,利用原生质体转化法将其转化至Bacillus sp.N16-5,通过荧光显微镜和多功能荧光读板仪检测报告基因的表达情况。【结果】所构建的表达载体pABN165P43-gfp和pABN165P EF-gfp可以在Bacillus sp.N16-5中表达报告基因gfp,荧光定量数据显示,在7.5 h左右开始检测到绿色荧光蛋白的表达,从7.5 h到12 h荧光强度随时间增长迅速并在12 h左右达到最大,最大荧光值在7000左右。【结论】成功构建了2个嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.N16-5表达载体,实现了外源基因在嗜碱芽孢杆菌中的表达。     

嗜热脂肪地芽孢杆菌NAD激酶克隆表达及酶学性质研究

NAD激酶能催化NAD生成NADP。本研究采用PCR技术从嗜热脂肪地芽孢杆菌基因组中获得NAD激酶基因,以pET30a（＋）为表达载体、E．coliBL21（DE3）为宿主菌,实现其在大肠杆菌中异源表达,并进行酶学性质研究。结果显示,嗜热脂肪地芽孢杆菌中NAD激酶编码基因大小为816bp,酶分子量大约为35kD。酶学性质分析表明,来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌的NAD激酶最适反应温度和pH分别为35℃、pH7．5,在35qC中保温2h后仍能保持80％左右的活性。Mn2＋、Ca2＋对该酶有较强的激活作用,在最适反应条件下该酶的比活力为4．43U／mg。动力学性质分析结果显示NAD激酶对底物NAD催化的k和圪。,分别为1．46mmol／L和0．25tzmol／（L·min）。NAD激酶在大肠杆菌的异源表达为以NAD为底物生物合成NADP提供了更多生物资源。     

地衣芽孢杆菌普鲁兰酶编码基因的鉴定

对地衣芽孢杆菌基因组序列分析显示。其中标注为amyX的基因可能编码普鲁兰酶。以PCR方法,从地衣芽孢杆菌染色体DNA中扩增出amyX基因蛋白编码区,插入大肠杆菌表达载体pET28aT7启动予下游。含重组质粒的大肠杆菌BL21（DE3）在IPTG诱导下表达出有活性的普鲁兰酶。酶学性质初步分析表明,重组普鲁兰酶最适反应温度为40℃,最适pH值为6．0。     

合成利巴韦林的关键酶瞟呤核苷磷酸化酶的原核表达及活性分析

目的：在枯草芽孢杆菌中表达嘌呤核苷磷酸化酶（PNPase）并分析其活性。方法：将PNPase的编码基因deoD克隆入pDG148表达载体,构建原核穿梭型表达载体pDG148-deoD,采用电转化方法将表达载体转入枯草芽孢杆菌WB600后诱导表达重组PNPase;研究重组PNPase的活性。结果与结论：获得的重组PNPase活性较对照提高了193．9％,其最适催化条件为65℃、pH7．5、500μmol／L底物浓度和1％1,2,4-三氮唑-3-羧甲酰胺;对重组菌的发酵条件进行了初步优化,IPTG诱导6h后在发酵液中添加0．5％的Tween-80能大幅度提高重组PNPase的酶活力。     

一种来源于酒曲地衣芽孢杆菌溶菌酶基因在毕赤酵母中的诱导表达及活性分析

利用梯度稀释法和划线纯化法对酒曲中的微生物进行分离纯化,将所得微生物进行液体培养并检测其溶菌酶活性。通过分子生物学方法进行菌种鉴定,得到一株具有溶菌酶活性的地衣芽孢杆菌。提取地衣芽孢杆菌全基因组,设计特异性引物,克隆基因序列Lyz并连接至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA中,构建重组表达载体pPICZαA-Lyz。重组载体经电转化整合入甲醇型毕赤酵母菌株X33基因组中进行重组表达。摇瓶发酵结果显示,甲醇诱导72 h后,发酵液中溶菌酶活性为1 360 U/m L。酶学性质分析结果显示,重组地衣芽孢杆菌溶菌酶在pH3.0~9.0范围内可以保持较高的相对活性,具有良好的热稳定性。抑菌试验结果显示地衣芽孢杆菌溶菌酶对革兰氏阴性菌有抑菌作用。     

鲟源病原性嗜水气单胞菌拮抗芽孢杆菌的鉴定及其生物学特性

从养殖池污泥中分离筛选了1株优良的鲟源嗜水气单胞菌拮抗芽孢杆菌G1,其对鲟源嗜水气单胞菌S1产生的抑菌圈直径为18.50 mm。通过API50CH细菌鉴定系统以及16S rRNA序列分析法,菌株G1被鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),GenBank登录号HM245965.1,其16S rRNA序列与基因库中芽孢杆菌属菌株的16S rRNA序列有99%100%的同源性,而且与解淀粉芽孢杆菌Ba-74501(GenBank登录号:DQ422953.1)的亲缘关系最近。菌株G1的最适生长pH值为7,最适生长温度为30°C,其在30°C、200 r/min条件下的生长曲线为:0 6 h为生长延迟期,6 54 h为对数生长期,54 90 h为稳定期,90 h以后为衰亡期。此外,菌株G1对其他实验选用的病原性嗜水气单胞菌也表现出良好的拮抗活性。本实验结果有利于填补嗜水气单胞菌拮抗菌在分类地位、生物学特性等方面的不足,为鲟鱼嗜水气单胞菌病的生物防控提供科学资料。     

黏细菌漆酶序列筛选及其重组酶酶学性质

漆酶是一种应用广泛的绿色环保的多酚氧化酶。漆酶过去被认为广泛存在于植物、昆虫和真菌中,而近年来,越来越多的细菌中也发现了漆酶的存在。黏细菌是一类重要的资源菌,但与一般细菌相比,较难分离和纯化。文中利用生物信息学的方法,综合应用Blast和隐马尔可夫模型方法对黏细菌蛋白质组数据库进行搜索,并根据多铜氧化酶的保守铜离子结合位点进行进一步筛选,获得30个候选黏细菌漆酶序列。挑选其中9个,在大肠杆菌中进行重组表达。利用2,6-甲氧基苯酚(DMP)等常用漆酶底物检测重组酶的催化氧化活性,其中7个重组蛋白具有漆酶催化活性。选择1个对2,6-甲氧基苯酚(DMP)具有较高氧化活性的重组酶(命名为rSC-2),通过Ni-NTA亲和层析柱纯化rSC-2,测试其酶学性质。纯化的rSC-2蛋白分子量约57 kDa,在最适反应条件下,rSC-2催化DMP反应的比酶活为0.27 U/mg。催化DMP反应的最适温度为60℃,最适pH为7.0。rSC-2在pH 7.0-8.0有较高酶活,在60℃孵育1 h保留50%以上剩余酶活。低浓度的Ca~(2+)对酶活有一定的促进作用,而较高浓度的Fe~(3+)、Co~(2+)、Ba~(2+)对酶活的抑制作用较明显。这是首次对黏细菌漆酶序列进行系统性的生物信息学分析,并实现纤维堆囊菌Sorangium cellulosum序列来源的漆酶活性蛋白在大肠杆菌细胞中重组表达。     

短小芽孢杆菌LC01漆酶基因在毕赤酵母中的胞外表达及重组漆酶酶学性质研究

为了获得表达量高、稳定性好及染料脱色效率高的细菌漆酶,通过PCR扩增出短小芽孢杆菌LC01的漆酶基因并构建重组表达载体pPICZαA-lac,转化毕赤酵母菌株SMD1168H后利用甲醇诱导培养重组菌获得重组漆酶,纯化并分析了重组漆酶的性质。重组菌株产漆酶活性在第7天达到最高,为1 390 U/L。纯化的重组漆酶分子量为65 kD,以丁香醛连氮为底物的最适反应温度和pH分别为70℃和6.8。在pH 9.0放置10 d活性没有下降,在70℃保温10 h后仍保留36%的酶活。Al~(3+)、Fe~(3+)和Mn~(2+)完全抑制漆酶活性。在介体乙酰丁香酮参与下该漆酶能够有效脱色RB亮蓝、活性黑5和靛红,在pH 9.0时6 h的脱色率达到了90%以上,表明该重组漆酶能有效应用于染料废水的脱色处理。     

碱性β-甘露聚糖酶基因异源表达的研究

亚克隆的碱性β-甘露聚糖酶基因(man)来源于嗜碱芽孢杆菌N16-5,构建了大肠杆菌-枯草芽孢杆菌诱导型表达质粒pDG-man,在大肠杆菌JM109中获得了活性表达,经0.5 mmol/L的IPTG诱导后,可表达5 U/mL碱性β-甘露聚糖酶。重组大肠杆菌DE3-RIL(pDG-man)表达β-甘露聚糖酶水平是大肠杆菌JM109(pDG-man)的2倍。重组枯草芽孢杆菌WB600(pDG-man)可表达19.2 U/mL碱性β-甘露聚糖酶。     

重组枯草芽抱杆菌的构建及对街体的Cl , 2 位脱氢

本文将简单节杆茵3-甾酮-1-脱氢酶基因克隆到分泌表达载体pWB980上,并转入枯草芽孢杆菌WB600中,得到重组芽孢杆菌菌株。重组芽孢杆菌表达出的目的蛋白的分子量为55KDa,分光光度法检测到胞内和胞外可溶性部分的酶活分别为110±0．5mU和15±0．6mU每毫克蛋白,对甾体底物4-AD的转化率为45．3%,比出发茵简单节杆菌提高了将近10倍。     

丙氨酸消旋酶C-端结构域重组体的构建及其功能初探

[目的]将嗜碱芽孢杆菌丙氨酸消旋酶OF4DadX的N-端结构域分别与多个不同种属的丙氨酸消旋酶C-端结构域重组,探究丙氨酸消旋酶C-端结构域功能.[方法]利用基因拼接构建丙氨酸消旋酶重组基因,通过镍亲和层析纯化酶蛋白,采用D-氨基酸氧化酶偶联法检测重组酶蛋白的酶学特性,借助分子筛和HPLC液相色谱分析其聚合状态及动力学...     

氧化葡萄糖酸杆菌老黄酶Go的酶学性质鉴定

从氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)H24中克隆出老黄酶Go的基因,通过构建重组表达质粒,在大肠杆菌BL21中诱导表达可溶性的蛋白,使用离子交换柱(Hi Trap DEAE FF)对重组酶进行纯化,并对其酶学性质进行表征。结果表明:老黄酶Go的温度和p H耐受性都较好,在40℃条件下,12 h后能保持40%的活性;在p H10的条件下,12 h后能保持40%的活性;Go的底物谱十分广泛,对酰亚胺类、α,β-不饱和醛酮、萜类都有一定的活性。老黄酶Go有良好的有机溶剂耐受性,在体积分数20%的乙酸丁酯中可以保持90%左右的活性,但是金属离子对其影响较大,除Mg~(2+)和K~+外,所选的其他离子对Go都有着不同程度的抑制作用。最后,在催化性质的实验中发现,Go对柠檬醛的转化率有60%,并且其对映体过量值(e.e.)可以达到99%。     

热稳定性丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶异源表达及其在乙酰辅酶A合成中的应用 *

乙酰辅酶A被广泛应用到生物医学研究中,使用TPP代替昂贵的ATP为辅因子合成乙酰辅酶A受到广泛关注.新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)来源的丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶(TnPFOR)在大肠杆菌中进行了重组表达,分析了其酶学特性,并探讨了利用嗜热酶(TnPFOR)酶法合成乙酰辅酶A.采用pET-20b(+)载体,将新阿波罗栖热袍菌来源的四亚基组成的嗜热酶(TnPFOR)在大肠杆菌中进行异源表达;通过热处理和阴离子交换层析法纯化嗜热酶(TnPFOR);重组表达的嗜热酶(TnPFOR)的最适反应温度和pH分别为90℃和6.5,TnPFOR在90℃下孵育1h时保留了50%活性.利用嗜热酶(TnPFOR),以TPP为辅酶合成了乙酰辅酶A,并探讨了不同温度,丙酮酸钠底物浓度和反应时间对乙酰辅酶A合成的影响.得到的优化条件为:最适反应温度为90℃,丙酮酸钠浓度为1.5mmol/L,反应时间为2min.     

蜡样芽孢杆菌胶原酶基因colR75E在毕赤酵母中的重组表达

【目的】利用毕赤酵母真核表达系统表达蜡样芽孢杆菌胶原酶Col R75E,寻找一种安全、稳定的方式体外制备具有高活性的胶原酶。【方法】以蜡样芽孢杆菌R75E基因组DNA为模板,采用PCR法扩增胶原酶col R75E基因,构建p PICZαA/col R75E重组质粒,将该质粒线性化后电转化至毕赤酵母X-33菌株,诱导其表达并对表达条件进行优化。将表达后的酵母发酵液上清通过硫酸铵沉淀、脱盐处理及亲和层析纯化步骤获得高纯度重组Col R75E胶原酶。利用胶原酶活力测定、SDS-PAGE电泳、胶原酶谱、I型胶原蛋白及不同底物蛋白降解产物电泳等方法对重组胶原酶Col R75E的活性及底物特异性进行分析。【结果】毕赤酵母中最佳表达重组胶原酶Col R75E的条件为p H 6.0,甲醇终浓度为2.5%,诱导时间72 h,诱导后的蛋白经SDS-PAGE、胶原酶谱以及I型胶原蛋白降解产物电泳分析发现,毕赤酵母中表达的重组胶原酶分子量符合预期,蛋白纯度超过95%,具有较好的胶原蛋白水解活性并测得其比活力为4.977 U/mg。该酶对I型胶原蛋白表现出较好的专一性,但是对牛血清白蛋白、酪蛋白及溶菌酶蛋白没有水解活性。【结论】利用毕赤酵母真核表达系统能够获得高活性的蜡样芽孢杆菌胶原酶Col R75E,为该胶原酶广泛应用于医疗、食品等工业领域奠定了理论和方法基础。     

重组枯草芽孢杆菌诱导表达AiiA及酶活性鉴定

[目的]由于Aii A(Autoinducer inactivation,Aii A)蛋白能有效降解AHLs(N-acyl-homoserine,AHLs),导致病原菌由于群体淬灭(Quornm quenching,QQ)失去生存优势而抑制其致病能力;利用强启动子构建能高效表达Aii A蛋白的枯草芽孢杆菌,检验枯草芽孢杆菌中Pspac启动子表达Aii A蛋白的能力,寻求有效生物防治手段防治病原菌侵害。[方法]通过已知的aiiA基因序列和启动子Pspac序列设计引物,经搭桥PCR搭连启动子Pspac和aiiA基因,构建重组表达载体Pspac-aiiA-PHY300PLK,经酶活反应确定重组菌活性。[结果]成功克隆并搭连Pspac启动子和aiiA基因,Aii A蛋白成功在重组枯草芽孢杆菌C11中表达。经酶活检验,野生菌株和重组菌株Pspac-aiiA-C11有降解信号分子AHLs的能力,但重组菌降解能力更强。[结论]重组菌Pspac-aiiA-C11较野生菌株有更强的降解AHLs效力;要利用工程菌进行生物防治还需进一步提高工程菌表达Aii A蛋白的能力及稳定性。