辣椒CaNAC55基因克隆与表达分析

为揭示辣椒NAC转录因子的功能,以高抗疫病辣椒CM334为试验材料,克隆获得CaNAC55基因全长gDNA和cDNA序列。生物信息学分析表明,CaNAC55基因gDNA全长4 164 bp, cDNA完整开放阅读框(ORF)为1 299 bp,基因编码的蛋白由432个氨基酸残基组成;基因序列比对和同源性分析结果表明,CaNAC55与辣椒(XM-016722474)、番茄(XM-004241285)和马铃薯(XM-006361027)的亲缘关系最近,氨基酸相似度分别达到99.87%、93.37%和92.62%。实时荧光定量分析表明,干旱、高盐、热激处理均可诱导CaNAC55基因表达,其中干旱、高盐、热激处理分别在24 h、24 h和12 h时表达量达到峰值,且分别为对照的3.01倍、20.92倍和8.84倍;ABA处理下,CaNAC55基因的相对表达量显著低于对照,说明CaNAC55基因的表达受到ABA的抑制。研究表明,辣椒CaNAC55转录因子对不同逆境胁迫的响应不同,推测辣椒CaNAC55基因可能作为重要的调节因子参与逆境胁迫响应。     

茶树品种‘安吉白茶’ CsDREB-A4 b基因的克隆及其对非生物胁迫的响应

采用RT-PCR方法从茶树﹝Camellia sinensis ( Linn.) O. Ktze.﹞品种‘安吉白茶’(‘Anjibaicha’)叶片的cDNA中克隆得到1个编码DREB转录因子的基因,命名为CsDREB-A4b。序列分析结果显示,CsDREB-A4b基因包含长度为873 bp的开放阅读框,编码290个氨基酸,具有保守的AP2结构域。与拟南芥﹝Arabidopsis thaliana ( Linn.) Heynh.﹞AP2/ERF家族转录因子进行同源进化分析,CsDREB-A4b转录因子属于DREB亚族中的A4组。多重比对结果显示：CsDREB-A4b转录因子与蓖麻(Ricinus communis Linn.)等植物的DREB类转录因子保守结构域氨基酸序列的相似性较高。 CsDREB-A4b转录因子为亲水性蛋白,理论相对分子质量为31938.5,理论等电点为pI 5.91,总平均疏水性为-0.603,碱性、酸性、芳香族和脂肪族氨基酸的比例分别为12%、12%、7%和15%。在高温(38℃)胁迫处理前期,CsDREB-A4b基因的相对表达量显著高于胁迫处理前;在低温(4℃)胁迫处理下,CsDREB-A4b基因的相对表达量呈显著升高的趋势;在盐(200 mmol·L-1 NaCl)和干旱(200 g·L-1 PEG)胁迫处理下,CsDREB-A4b基因的相对表达量呈先降低后显著升高的趋势。表明CsDREB-A4b基因参与‘安吉白茶’非生物胁迫的响应过程,且在不同胁迫条件下具有表达差异性。     

杨树ERF11转录因子基因应答渗透胁迫表达分析

从小黑杨(Populus simonii×P.nigra)叶片中克隆出732 bp的ERF11转录因子基因(Potri.011G057000.1)cDNA,其编码的蛋白含有243个氨基酸,属于不稳定的亲水蛋白,不存在信号肽,不具跨膜能力,含AP2/ERF家族保守结构域。系统进化树表明,小黑杨ERF11蛋白与胡杨、麻疯树、蓖麻、橡胶树、木薯遗传距离较近,说明其亲缘关系较近。亚细胞定位结果表明,ERF11蛋白定位于细胞核中。ERF11基因表达具有组织特异性,并受胁迫诱导表达。其在根中相对表达水平明显比在茎和叶中表达水平高,在盐和甘露醇胁迫下,基因均表现上调表达。表明ERF11转录因子基因可能与植物应答高盐和干旱胁迫相关。     

雷公藤AP2/ERF转录因子基因的克隆与分析

该研究以雷公藤发状根为材料,根据雷公藤根转录组数据设计引物,采用RT-PCR方法克隆得到2个雷公藤AP2/ERF转录因子,分别命名为TwAP2/ERF1基因(GenBank登录号:GAVZ01042389.1)和TwAP2/ERF2基因(GenBank登录号:GAVZ01016765.1)。TwAP2/ERF1基因含有一个525bp开放阅读框(ORF),编码186个氨基酸;TwAP2/ERF2基因的ORF为789bp,编码262个氨基酸;2个基因编码的蛋白质均为亲水性蛋白质。系统进化分析表明,TwAP2/ERF1与油桐(Vernicia fordii)AP2/ERF(APQ47444.1)和木油桐(Vernicia montana)AP2/ERF(APQ47365.1)相似性较高,TwAP2/ERF2与毛果杨(Populus trichocarpa)AP2/ERF(XP_002304640.1)和樱桃(Prunus pseudocerasus)AP2/ERF(ALD84477.1)相似性较高。雷公藤发状根经MeJA诱导后,TwAP2/ERF1基因的相对表达量明显提高,并于处理后9h达到最高值,为对照表达量的16.77倍;而MeJA处理对TwAP2/ERF2基因的表达表现出抑制作用,但于处理后48h相对表达量有所提高。研究表明,雷公藤TwAP2/ERF1转录因子响应MeJA早期诱导正调控,推测其可能参与调控雷公藤植物次生代谢产物的生物合成,该研究结果为阐明雷公藤次生代谢物质的生物合成调控与利用现代生物技术提高雷公藤植物细胞中次生代谢物质的含量奠定了基础。     

辣椒CaWRKY14转录因子的生物学特性研究

WRKY转录因子是植物响应病原菌胁迫最重要的转录因子之一,且参与抗病反应及信号传导通路的调控。为研究辣椒WRKY基因的生物学特征,以辣椒高抗疫病材料CM334为试材,克隆获得响应疫霉菌诱导的转录因子CaWRKY14。生物信息学分析表明,该基因DNA全长2 530 bp,cDNA全长1 662 bp,含有5个内含子,编码553个氨基酸,含有1个WRKY保守结构域,属于Group Ⅱ(b)。实时荧光定量表达分析表明,CaWRKY14不仅受ABA和疫霉菌胁迫诱导表达,且表达量分别在12 h和24 h时达到峰值,分别是对照的8.54和8.04倍,同时也受高盐、热激和干旱胁迫诱导。利用VIGS技术对CaWRKY14转录因子进行沉默后发现,抗病材料CM334接种疫霉菌后趋于发病。研究表明,CaWRKY14基因在辣椒响应疫霉菌胁迫进程中可能发挥着重要作用。     

人工转录因子促进外源基因在CHO细胞中的高效表达

以酵母转录因子GAL4中1-147位氨基酸序列为构建人工转录因子的DNA结合结构域,单纯疱疹病毒转录激活子VP16中12肽(DALDDFDLDMLG)的4个串联重复作为人工转录因子的功能结构域,用SV40的核定位序列(NLS)将两部分连接起来,构建了人工转录因子GVP4并将其克隆进入表达载体pcDNA3·1/Hygro( )中。将不同长度的人工转录因子结合序列构建在外源基因表达载体pcDNA3·1( )启动子CMV的上游,分别连接外源基因EGFP和tPA。用表达人工转录因子和外源基因的载体共转染CHO细胞,EGFP和tPA在含不同数量人工转录因子结合位点表达载体pcDNA3·1( )转染的CHO细胞中的表达水平呈现不同程度的提高。其中,以引入10个人工转录因子结合位点的表达载体的效果最明显,EGFP和t-PA的表达效率均提高2~3倍。结果表明,人工转录因子能有效地促进外源基因在哺乳动物细胞中的表达。     

海南普通野生稻OrERF1的克隆和表达分析

根据EST(expressed sequence tags,EST)序列信息,从海南普通野生稻中克隆了一个AP2/ERF(apetala2/ethylene response factor)类转录因子OrERF1。该基因包含一个1 014 bp的完整阅读框,编码337个氨基酸。推导OrERF1氨基酸序列具有典型的AP2/ERF类转录因子结构特征,与水稻(Oryza sativa)、大麦(Hordeum vulgare)、玉米(Zea mays)和橙子(Citrus sinensis)中相应的AP2/ERF类蛋白具有较高的同源性。聚类分析表明OrERF1是ERF类转录因子。对OrERF1启动子序列进行分析,发现存在多种激素应答和胁迫响应的调控元件。Real-time PCR结果显示,低温、干旱和盐胁迫均能诱导OrERF1的表达。这些结果表明OrERF1可能在逆境响应过程中具有重要功能。     

辣椒CaWRKY8基因克隆及胁迫下的表达分析

为了揭示辣椒WRKY基因功能,以辣椒PI201234为实验材料,克隆得到WRKY基因全长1 647bp的cDNA序列,命名为CaWRKY8。生物信息学分析表明,该基因含有一个1 647bp完整开放阅读框(ORF),编码548个氨基酸残基。氨基酸序列分析显示,CaWRKY8编码的蛋白含有2个WRKY结构域,属于Group I。氨基酸序列比对结果表明,CaWRKY8与辣椒WRKY25、马铃薯WRKY、番茄基因组中预测的WRKY26、烟草基因组中预测的WRKY33和猕猴桃WRKY的氨基酸序列之间均具有高度的保守性。实时荧光定量分析表明,CaWRKY8受盐、高温、干旱和辣椒疫霉菌诱导表达;其中CaWRKY8的表达量在盐和干旱处理下3h达到峰值,分别是对照的2.38倍和121.10倍,在高温和疫霉菌处理下12h达到峰值,分别是对照的6.12和6.81倍。以上研究结果表明,CaWRKY8基因在辣椒响应胁迫进程中发挥着重要作用。     

棉花抗枯萎病相关ERF-B3亚组转录因子的克隆与表达

以拟南芥ERF-B3亚组转录因子的AP2/ERF结构域为探针,利用NCBI中的棉花(Gossypium hirsutum)EST数据库,通过电子克隆结合RT-PCR方法,从枯萎病菌诱导后的高抗枯萎病品种‘中棉所12’克隆到1个与抗枯萎病相关的ERF-B3亚组转录因子基因GhB301。序列分析结果显示,GhB301基因cDNA全长593 bp,开放阅读框384 bp,编码127个氨基酸,含有一个保守的AP2/ERF结构域。实时荧光定量PCR检测该基因的表达显示,枯萎病菌诱导后,GhB301基因在棉花根中、抗病品种中优势表达;在乙烯、水杨酸、干旱、低温及高盐的诱导下表达量均发生变化。研究结果表明,GhB301基因可能参与了棉花对病原菌、激素及非生物胁迫的应答反应。     

栀子ERF基因的克隆及其在果实成熟过程中的表达

乙烯反应元件因子(ethylene-responsive element-binding factor,ERF)是一类植物DNA结合蛋白,是乙烯信号传导过程中的一类转录因子,与植物的生长发育和生理过程有关。从栀子(Gardenia jasminoidesEllis)果实的cDNA文库中筛选获得栀子乙烯反应元件因子GjERF的cDNA。该基因全长962 bp,5’端非翻译区长82 bp,3’端非翻译区长100 bp,预测ORF为780 bp,编码259个氨基酸,分子量为28.6 kD。序列分析表明GjERF含有59个氨基酸构成的AP2/ERF结构域及N端的MC(MCGGAII)模体,它属于ERF家族的第Ⅶ亚类。RT-PCR分析表明GjERF基因在栀子成熟叶片中的表达高于在果实中的表达,并且在果实中的表达与果实的成熟过程无关。     

独行菜LaAP2基因克隆、生物信息学分析及表达分析

AP2/ERF是广泛存在于植物中一类重要的转录因子,调控一些参与非生物胁迫相关基因的表达,帮助植物提高逆境胁迫能力。为了深入探讨LaAP2在独行菜耐受低温萌发及幼苗耐受低温生长中的功能,该研究基于前期对独行菜(Lepidium apetalum)转录组数据库分析,克隆获得一个显著上调表达的AP2/ERF家族序列LaAP2。该基因cDNA全长为1 005 bp,编码氨基酸序列包含一个AP2和一个B3结构域,属于AP2/ERF转录因子RAV亚家族。推定的LaAP2蛋白分子量为37.744 67 kD,等电点为9.49。该蛋白氨基酸序列同亚麻荠、拟南芥、油菜等物种显示出较高同源性,系统进化分析结果表明与拟南芥亲缘关系较近。氨基酸序列分析预测表明,LaAP2基因所编码的蛋白不具备信号肽区段,无跨膜区,不属于分泌蛋白,可能为亲水性蛋白;定位于细胞质的可能性为56.5%,定位于细胞核的可能性为21.7%;其主要二级结构元件为无规则卷曲、延伸链、α-螺旋。Real-time PCR分析独行菜幼苗中LaAP2在低温4℃处理下的表达,显示LaAP2表达受低温胁迫呈先下降后升高趋势。这表明LaAP2在独行菜幼苗抵抗低温胁迫中起调控作用。     

茶树CsDREB-A1转录因子基因的克隆及其特性分析

基于茶树品种‘迎霜’（Camellia sinensis‘Yingshuang’）的转录组数据,采用PCR方法从其基因组DNA中克隆获得编码DREB转录因子的CsDREB-A1基因。结果显示：该基因的开放阅读框（ORF）长度为585 bp,编码194个氨基酸,该氨基酸序列即为CsDREB-A1转录因子。CsDREB-A1转录因子的N端含有AP2/ERF家族转录因子典型的AP2 DNA保守结合结构域,其中包含保守的YRG元件和WLG基序,且其第14位和第19位分别为缬氨酸和谷氨酸,该结构域的上、下游分别有PKK/RPAGRx KFx ETRHP和DSAW特征序列。通过进化分析可知CsDREB-A1转录因子属于AP2/ERF家族中DREB亚族的A1组,其与茶树CBF转录因子的相似性较高,与拟南芥〔Arabidopsis thaliana（Linn.）Heynh.〕等植物的DREB类转录因子也有较高的相似性。CsDREB-A1转录因子为亲水性蛋白,理论相对分子质量为21 165.4,理论等电点为p I 9.56,碱性、酸性、芳香族和脂肪族氨基酸比例分别为18%、10%、6%和18%;该转录因子只有1个包含53个氨基酸的无序化区域,且大部分无序化氨基酸位于AP2DNA保守结合结构域内,无序化氨基酸的比例为27.32%;在CsDREB-A1转录因子的三级结构中,N端有1个α螺旋、C端有3个β折叠。研究结果显示：CsDREB-A1转录因子可能与茶树的抗寒性相关。     

新疆野苹果AP2/ERF转录因子家族鉴定与响应腐烂病的表达分析北大核心CSCD

AP2/ERF转录因子家族参与了植物生长发育、抵抗胁迫以及植物激素响应等诸多生物过程,是植物中最重要的转录因子家族之一。该研究基于腐烂病菌侵染后的新疆野苹果(Malus sieversii)全长转录组,使用AP2保守结构域的隐马可夫模型PF00847,鉴定新疆野苹果的AP2/ERF家族成员。利用MEGA6、NCBI CDD-batch、MEME、EXPASY、BUSCA对MsAP2/ERF家族成员进行鉴定、分类和结构分析、理化性质和亚细胞定位分析。通过RNA-seq数据和qRT-PCR实验对差异表达的MsAP2/ERFs基因的表达水平进行分析和验证,旨在鉴定新疆野苹果中潜在具有腐烂病抗性的AP2/ERF家族基因资源。结果显示:(1)在新疆野苹果中共鉴定获得106个AP2/ERF基因,涵盖全部AP2(17个)、ERF(57个)、DREB(25个)、RAV(5个)和Soloist(2个)5个亚家族。(2)进一步的细化分类发现MsERF亚家族包括B1-B6 6个组,而MsDREB亚家族中只有A2、A4、A5、A6共4个组,缺少A1和A3组的基因成员。(3)RNA-seq表达模式分析结果表明,29个MsAP2/ERF基因在腐烂病感染过程中差异表达,其中MsERF亚家族中差异表达基因数量最多(19个)。(4)12个MsAP2/ERF代表基因的qRT-PCR结果表明:8个ERF亚家族基因均受腐烂病病菌诱导显著上调表达,其中B4类ERF成员基因(MsERF40)在腐烂病病菌侵染后5 d表达量上调表达倍数最高;4个MsDREB基因中,3个受到腐烂病病原菌诱导显著上调,1个下调表达;此外,含有TIR保守结构域的MsERF05在腐烂病病菌侵染1 d后上调表达69倍,表明ERF亚家族的MsERF40和MsERF05在新疆野苹果抗腐烂病过程中发挥重要作用。该研究结果为新疆野苹果AP2/ERF基因响应腐烂病的功能和机理研究奠定了基础。     

茶树CsCBF1基因克隆和转录活性分析

采用RACE技术克隆了一个受冷诱导的茶树CBF基因全长cDNA,命名为CsCBF1(GenBank登录号为EU563238)。CsCBF1cDNA全长序列为1 211bp,开放阅读框编码259个氨基酸。氨基酸序列分析表明,CsCBF1具有CBF家族典型的保守结构域,与其他植物的CBF具有较高的相似性;与拟南芥、辣椒和橡胶树编码的CBF相似性分别为56%、63%和56%。亚细胞定位结果表明,CsCBF1位于细胞核内。分别将10个CsCBF1缺失突变体与GAL4DNA结合域融合的结果显示,CsCBF1的羧基末端酸性结构域(第137位氨基酸至259位氨基酸)在酵母中具有转录激活活性。实时定量RT-PCR分析表明,CsCBF1基因受低温的快速诱导表达。     

梅花CBF转录因子的克隆及表达

根据GenBank中与梅花同属的桃、甜樱桃等已发表CBFs转录因子序列设计简并引物,采用PCR和RT-PCR方法,从梅花基因组DNA和cDNA中克隆CBF转录因子片段。结果表明,两种途径获得的CBF基因序列一致,基因全长821bp,编码238个氨基酸,其氨基酸序列具有典型的CBF蛋白特征,包含保守的AP2/EREB DNA结合结构域及CBF家族蛋白特征短多肽序列(PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR)。氨基酸相似性分析结果表明,该基因与欧洲甜樱桃、矮扁桃等CBF转录因子相似性较高。相对荧光定量PCR结果显示,4℃低温胁迫下,其表达量符合CBF转录因子表达特点,随着胁迫时间的增长表达量呈上升趋势,8h时达峰值,说明该基因在低温胁迫下上调表达。     

沙冬青响应非生物胁迫的转录因子基因鉴定与分析

以沙冬青[Ammopiptanthus mongolicus(Maxim.ex Kom.)Cheng f.]幼苗为实验材料,对其转录组进行测序,筛选出质量体积分数18%聚乙二醇6000模拟干旱胁迫下差异表达的转录因子基因;在此基础上,对干旱胁迫下差异表达bHLH转录因子的系统进化关系以及干旱胁迫和100 mmol·L~(-1)NaCl胁迫下差异表达bHLH基因的表达模式进行分析。结果表明:沙冬青中存在49个转录因子基因家族,共包含1 575个转录因子基因。干旱胁迫下沙冬青地上部有44个转录因子基因表达量的差异倍数大于等于2倍,其中33个转录因子基因上调表达,11个转录因子基因下调表达;地下部有57个转录因子基因表达量的差异倍数大于等于2倍,其中50个转录因子基因上调表达,7个转录因子基因下调表达。沙冬青响应干旱胁迫的差异表达转录因子基因主要分布于AP2-EREBP、MYB、WRKY、NAC和bHLH基因家族。沙冬青地上部和地下部表达量上(下)调2~5、5(含5)~10(含10)及10倍以上的差异表达转录因子基因数分别为28、7和9个,以及11、27和19个。聚类分析结果显示:沙冬青6个差异表达bHLH基因编码的氨基酸序列与拟南芥[Arabidopsis thaliana(Linn.)Heynh.]bHLH基因编码的氨基酸序列有不同程度的相似性。干旱胁迫和NaCl胁迫下,沙冬青6个差异表达bHLH基因的表达受到不同程度的诱导。本结果为研究非生物胁迫过程中沙冬青调控机制提供了大量的转录因子基因资源。     

酚类化合物代谢中受UV-C辐照调控的转录因子的筛选

SlPAL5基因是酚类化合物代谢的关键基因。UV-C辐照可以有效提高番茄果实中酚类化合物的含量。因此研究调控SlPAL5基因表达的转录因子,对于进一步阐明UV-C诱导番茄果实酚类化合物合成的调控机制具有重要意义。文中通过构建番茄酵母单杂交文库,利用酵母单杂交技术筛选调控酚类化合物合成关键基因SlPAL5表达的转录因子。通过测序和Blast同源性分析得到转录因子SlERF7,并证实SlERF7可以与SlPAL5的启动子相互作用。另外,UV-C辐照可以显著提高SlERF7的表达水平。结果表明受UV-C辐照诱导的SlERF7可能参与了SlPAL5的转录调控,为研究UV-C诱导番茄果实酚类化合物合成的调控机制提供了基础。     

棉花抗枯萎病相关转录因子基因的克隆与表达

以枯萎病菌诱导棉花基因表达谱中获得的差异表达bZIP作为探针,采用电子克隆结合RT-PCR方法从棉花抗枯萎病品种‘中棉所12’中克隆了1个TGA转录因子基因,命名为GhTGA2.2。序列分析表明,该基因的cDNA全长1 356bp,编码451个氨基酸,预测分子量为50.04kD,等电点为5.85,含有保守的bZIP结构域。系统进化树分析表明,GhTGA2.2属于bZIP亚家族的TGA转录因子,与拟南芥AtTGA2、烟草NtTGA2.2亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,经枯萎病菌诱导后,GhTGA2.2基因在抗病品种中呈上调表达,随处理后时间的推移,其相对表达量呈先升高后降低的趋势,并于处理后24h表达量达到最大;水杨酸诱导后1h,GhTGA2.2基因相对表达量迅速增加;茉莉酸和乙烯诱导后GhTGA2.2基因的相对表达量明显降低,呈下调表达。研究推测,GhTGA2.2基因可能通过水杨酸信号传导途径参与对枯萎病菌的防御反应。     

罗汉果几丁质酶基因家族的生物信息学分析

几丁质酶是一类在植物抵抗病原真菌等过程中具有重要作用的蛋白质,为探讨几丁质酶在罗汉果抗根结线虫病中的调控作用,本研究基于南方根结线虫侵染下的罗汉果幼苗根系的转录组测序结果,采用生物信息学技术对筛选到的15个罗汉果几丁质酶基因进行分析。结果表明,15个罗汉果几丁质相关蛋白基因编码的氨基酸序列其N段均有一段信号肽,亚细胞定位在胞外;分子量从27 kDa到37 KDa不等;多数为酸性蛋白。基于氨基酸保守结构域和系统发育关系分析,15个罗汉果几丁质酶分属于GH18和GH19两大家族中的3个组别(Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ)的成员,GH18家族成员三级结构预测具有典型的(α/β)_8桶状结构,而GH19家族成员三级结构预测只有α螺旋结构域。这些分析结果可为今后深入研究罗汉果几丁质酶的生物学功能和调控机制提供一定的理论依据,为罗汉果抗根结线虫病育种提供参考。