Snail真核表达载体的构建及功能鉴定

目的:构建Snail的慢病毒真核表达载体,并研究Snail在肿瘤发生和发展过程中对上皮-间质转化(EMT)的影响。方法:以乳腺文库为模板,PCR扩增Snail的全长编码序列,将其克隆到p CDH表达载体上,构建成p CDH-Snail真核表达载体,转染293T细胞,Western印迹检测p CDH载体介导的Snail的表达;与包装质粒共转染293T细胞,包装病毒后感染ZR75-1细胞,经嘌呤霉素筛选2周,得到稳定表达Snail的ZR75-1细胞株,检测ZR75-1细胞对EMT的影响,同时用倒置荧光显微镜观察ZR75-1稳定细胞株中上皮钙粘蛋白分布的变化。结果:Bam HⅠ、XbaⅠ双酶切及测序证实得到p CDH-Snail表达载体,Western印迹表明Snail在293T细胞内得到成功;经嘌呤霉素筛选,获得稳定表达Snail的ZR75-1细胞株;在倒置荧光显微镜下观察,ZR75-1稳定细胞株中的上皮钙粘蛋白绿色荧光明显减弱。结论:构建了p CDH-Snail的慢病毒真核表达载体,建立了稳定表达Snail的ZR75-1细胞,为进一步研究Snail在EMT过程中的机制奠定了基础。     

Slug慢病毒表达载体的构建及对ZR75-1细胞上皮间质转化的影响

目的:构建锌指蛋白Slug基因的慢病毒真核表达载体,研究Slug对ZR75-1乳腺癌细胞上皮间质转化及迁移的影响。方法:以乳腺文库为模板,PCR扩增Slug全长编码序列,将其插入pCDH表达载体,构建pCDH-Slug真核表达载体,转染293T细胞,Western印迹检测Slug的表达;将重组质粒包装慢病毒感染ZR75-1细胞,用嘌呤霉素筛选得到稳定表达Slug的ZR75-1乳腺癌细胞,Western印迹和免疫荧光检测Slug对E-钙黏蛋白表达的影响,采用划痕实验检测Slug在ZR75-1乳腺癌细胞中对细胞迁移的影响。结果:双酶切实验证明Slug慢病毒表达载体构建成功;Western印迹表明Slug在293T细胞内表达成功;稳定表达Slug的ZR75-1乳腺癌细胞株构建成功;镜下观察发现,稳定表达Slug的ZR75-1乳腺癌细胞形态变为梭形;Slug在ZR75-1乳腺癌细胞中可以抑制E-钙黏蛋白的表达;划痕实验发现Slug在ZR75-1乳腺癌细胞中可以促进细胞迁移。结论:构建了Slug慢病毒真核表达载体,Slug可以促进上皮间质转化,并通过调控E-钙黏蛋白表达促进细胞迁移。     

p300基因小干扰RNA慢病毒载体的构建及其对乳腺癌ZR75-1细胞的影响

目的:构建p300基因的小干扰RNA(siRNA)慢病毒表达载体,检测其对p300蛋白表达的干扰,以及对乳腺癌细胞ZR75-1生长的影响。方法:利用RNA干扰(RNAi)技术设计并合成针对p300基因的siRNA,并将其克隆到siRNA表达载体pSIH-H1上,经酶切和测序验证,用293T人胚肾细胞包装p300 siRNA慢病毒,感染乳腺癌细胞ZR75-1,建立敲低p300表达的稳定细胞株,通过实时定量PCR和Western印迹检验RNAi的干扰效果,利用细胞生长实验检测p300 siRNA对ZR75-1细胞生长的影响。结果:酶切和测序证明构建了p300 siRNA真核表达载体;实时定量PCR和Western印迹证明构建的siRNA能有效抑制p300基因的表达,并建立了敲低p300表达的稳定细胞株;细胞生长实验证实p300 siRNA可有效促进ZR75-1细胞的生长。结论:构建了p300基因的siRNA真核表达载体,转染细胞后能有效抑制p300基因的表达,且能促进ZR75-1细胞的生长,表明构建的p300 siRNA具有功能。     

PES1慢病毒表达载体的构建及其对乳腺癌ZR75-30细胞生长的影响

目的:利用慢病毒载体表达PES1基因,研究其对乳腺癌ZR75-30细胞生长的影响.方法:以乳腺文库为模板,PCR扩增PES1基因,克隆到pCDH载体,构建成pCDH-PES1,将其与包装载体共转293T细胞,包装成Lenti-PES1慢病毒载体并测定病毒滴度,感染乳腺癌ZR75-30细胞,Western印迹鉴定病毒载体...     

慢病毒介导雌激素受体β在乳腺癌细胞中的高表达抑制上皮细胞间质转化相关基因的表达

目的：建立稳定高表达雌激素受体β（ERβ）蛋白表达的乳腺癌ZR75-1细胞株,检测其对上皮细胞间质转化（EMT）相关基因的影响。方法：将编码人ERβ的cDNA序列插入慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro,将其与慢病毒包装辅助质粒共转染293T细胞后收集病毒上清,感染乳腺癌ZR75-1细胞,经嘌呤霉素筛选后获得稳定高表达含Myc标签的人ERβ的混合细胞集落,以及作为对照组整合有对照慢病毒载体pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro的混合细胞集落,提取细胞蛋白,用Myc抗体检测Myc-ERβ融合蛋白的表达,同时检测EMT相关基因Snail、E-Cadherin、N-Cadherin的表达水平和GSK-3β的磷酸化水平。结果：建立了稳定高表达Myc-ERβ融合蛋白的乳腺癌细胞株,和对照组相比,Myc-ERβ高表达抑制EMT相关蛋白N-cadherin和Snail的表达,增强E-cadherin分子的表达,抑制GSK-3β磷酸化水平。结论：建立了Myc-ERβ高表达的乳腺癌细胞株,发现ERβ高表达抑制EMT相关分子的表达,为深入研究ERβ分子在乳腺癌中调控EMT的机制奠定了基础。     

DEK真核表达载体的构建及其对p53启动子活性的影响

目的：构建DEK的pcDNA3-Flag表达载体,研究其对抑癌基因p53启动子活性的影响。方法：以乳腺文库为模板,PCR扩增DEK编码序列,克隆到pcDNA3-Flag载体,构建成pcDNA3-Flag-DEK,转染293T细胞,Western印迹鉴定peDNA3-Flag载体介导的DEK的表达,萤光素酶报告基因活性实验研究DEK对p53启动子活性的影响。结果：双酶切实验证实得到pcDNA3-Flag-DEK阳性克隆;Western印迹实验发现DEK在293T细胞内表达;转录活性实验表明在ZR75-1乳腺癌细胞中,DEK呈剂量依赖性抑制p53启动子的活性。结论：构建了DEK的真核表达载体,并发现此表达载体能在ZR75-1乳腺癌细胞中抑制p53启动子活性。     

CEP55慢病毒表达载体构建和U251-CEP55细胞株的建立

目的:构建CEP55慢病毒表达载体,建立稳定表达CEP55的人脑胶质瘤U251细胞株。方法:使用PCR扩增方法将CEP55基因序列进行扩增,转入质粒中,并整合到载体上,构建重组质粒GV358-CEP55载体。与p Helper 1.0和p Helper 2.0质粒共转染293T细胞使其产生慢病毒,以GV358空载体包装的慢病毒作为对照。显微镜观察绿色荧光蛋白GFP表达强度,确定慢病毒的感染效率。采用病毒梯度稀释法测定病毒滴度。慢病毒感染人胶质瘤细胞株U251后,经嘌呤霉素筛选出稳定表达CEP55基因的细胞株U251-CEP55。q RT-PCR和Western blot两种方法分别检测CEP55 m RNA及蛋白的表达。结果:测序证实慢病毒表达载体GV358-CEP55构建成功;转染293T细胞获得高滴度的病毒。病毒感染U251细胞后,使用嘌呤霉素筛选得到稳定转染细胞株U251-CEP55;q RT-PCR和Western blot方法分别检测后发现,U251-CEP55细胞株中CEP55 m RNA和蛋白水平的表达明显高于对照组。结论:成功构建CEP55慢病毒表达载体,获得稳定表达CEP55的人胶质瘤U251细胞株,为CEP55基因功能的探究给予了一定的实验基础。     

PES1基因小干扰RNA慢病毒载体的构建及其对乳腺癌ZR75-30细胞的生长抑制

目的:构建PES1基因的慢病毒干扰载体,研究其对乳腺癌细胞ZR75-30生长的影响。方法:设计针对PES1基因的siRNA引物,克隆到pSIH1-H1-Puro载体,包装成慢病毒,测定病毒的滴度,感染人乳腺癌细胞ZR75-30,通过Real-time PCR和Western印迹检测干扰效果,并通过生长曲线研究敲低PES1对ZR75-30细胞生长的影响。结果和结论:构建了具有明显干扰效果的PES1基因的siRNA慢病毒载体,能够有效抑制ZR75-30细胞内源的PES1 mRNA和蛋白水平,敲低PES1能够抑制ZR75-30细胞的生长。     

短发夹RNA慢病毒载体稳定抑制NLRP3表达的HepG2细胞的构建

目的:构建针对NLRP3基因的短发夹RNA(sh RNA)慢病毒表达载体,在Hep G2细胞中鉴定该载体对NLRP3的抑制效果。方法:设计针对NLRP3基因的sh RNA序列,将其插入慢病毒表达载体p WPT-U6-sh RNA-CMV-GFP中,将载体与包装质粒ps PAX2、p MD2.G共转染293T细胞,进行病毒包装;得到的病毒原液浓缩后系列稀释为9个浓度递减的病毒液,分别转染293T细胞后进行滴度测定;用获得的慢病毒液感染人肝癌细胞系Hep G2,获得稳定沉默NLRP3的细胞株;利用实时定量PCR和Western印迹检测稳定细胞株中NLRP3的沉默效应。结果:构建了具有沉默效应的慢病毒干扰载体;稀释法测定干扰病毒滴度为2×108TU/m L;实时定量PCR和Western印迹实验均证实慢病毒转染后,细胞株中NLRP3表达水平明显降低。结论:构建了人NLRP3基因特异性慢病毒干扰载体,获得NLRP3基因稳定干扰的Hep G2细胞株。     

慢病毒介导稳定表达FRT-LacZ基因的MDCK细胞株构建

[目的]通过慢病毒载体系统获得稳定表达FRT-LacZ基因的MDCK细胞株。[方法]PCR扩增FRT-LacZ基因,亚克隆至慢病毒载体p LVX-PGK-Puro。经四质粒包装系统共转染293FT细胞包装重组慢病毒并检测病毒滴度,获得的慢病毒感染MDCK细胞,经嘌呤霉素筛选和β-半乳糖苷酶原位染色检测筛选鉴定转基因细胞株。[结果]测序证实,成功构建重组慢病毒质粒p LVX-FRT-LacZ-PGK-Puro。包装产生的慢病毒滴度为4.04×107TU/m L,重组慢病毒感染MDCK细胞后筛选获得稳定表达FRT-LacZ基因的MDCK细胞株。[结论]构建了稳定表达FRTLacZ基因的MDCK细胞株。     

人Six1基因真核表达载体的构建及其生物学功能研究

目的:构建带myc标签的Six1基因的真核表达载体,获得myc-Six1融合蛋白,并对其生物学功能进行初步检测。方法:以本实验室保存的乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增Six1编码序列,将其插入pXJ-40-myc载体,Western印迹检测其在人293T细胞中的表达;将重组质粒与空载体分别转染乳腺癌细胞ZR75-1,通过qRT-PCR检测细胞中VEGF-C在mRNA水平的变化。结果:双酶切和测序结果表明myc-Six1真核表达质粒构建成功;Western印迹证明转染293T细胞后成功表达;qRT-PCR结果表明myc-Six1可升高乳腺癌细胞ZR75-1的VEGF-C转录水平。结论:构建了带myc标签的Six1表达载体,为进一步研究Six1在乳腺癌转移中的作用奠定了基础。     

慢病毒介导的靶向c-Met可诱导shRNA稳定乳腺癌MDA-MB-231细胞系的构建及生物活性鉴定

目的:探讨适当敲除c-Met后对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响。方法:设计3条针对c-Met基因不同位点的短发夹RNA(shRNA)片段,将其连接到TA载体上,瞬时转染MDA-MB-231细胞,采用RT-PCR、Western印迹检测c-Met mRNA及蛋白表达情况,挑选沉默效率最佳的shRNA。以scramble为阴性对照,MDA-MB-231细胞为空白对照,挑选沉默效率最佳的TA-shRNA,并将其与pSD400慢病毒载体连接,利用293T细胞进行慢病毒组装,收集病毒液并感染MDA-MB-231细胞,将嘌呤霉素与MDA-MB-231细胞共培养,筛选稳定表达shRNA的细胞株。利用多西环素对稳定细胞系进行诱导,Western印迹检测稳定细胞系c-Met蛋白的表达量,MTT法检测敲低c-Met对稳定细胞系增殖的影响。结果:测序结果表明模板序列与设计序列正确,并筛选出沉默效率最高的shRNA为shRNA1,慢病毒包装后筛选出稳定细胞株,适当敲除MDA-MB-231细胞c-Met基因后细胞的增殖明显低于对照组。结论:构建了针对c-Met基因可诱导shRNA的乳腺癌稳定细胞系,为探讨适当敲除c-Met基因后乳腺癌细胞对化疗、放疗敏感性检测奠定了基础。     

人Six1基因真核表达载体的构建及其生物学功能研究简

目的：构建带myc标签的Sixl基因的真核表达载体,获得myc-Sixl融合蛋白,并对其生物学功能进行初步检测。方法：以本实验室保存的乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增Sixl编码序列,将其插入pXJ-40-myc载体,West-ern印迹检测其在人293T细胞中的表达;将重组质粒-9空载体分别转染乳腺癌细胞ZR75-1,通过qRT-PCR检测细胞中VEGF-C在mRNA水平的变化。结果：双酶切和测序结果表明myc-Six1真核表达质粒构建成功;Western印迹证明转染293T细胞后成功表达;qRT—PCR结果表明myc-Sixl可升高乳腺癌细胞ZR75-1的VEGF-C转录水平。结论：构建了带myc标签的Six1表达载体,为进一步研究Six1在乳腺癌转移中的作用奠定了基础。     

MPST基因慢病毒载体的构建及在SH-SY5Y细胞中的表达

为构建MPST基因慢病毒表达载体,获得稳定表达外源MPST基因的SH-SY5Y细胞株,本研究通过PCR扩增出MPST目的基因,将其克隆到慢病毒表达载体p EB-GFP (T2A) PURO上,将重组慢病毒表达载体和慢病毒包装质粒系统(pLP/VSVG, pLP1, p LP2)共转染293T细胞,用获得重组的慢病毒液感染SH-SY5Y细胞,嘌呤霉素筛选稳定表达MPST基因的(SH-MPST)细胞株。采用Real-time PCR和Western blotting以及ELISA等方法对筛出来的SH-MPST中的MPST的表达及功能进行鉴定。与空转染组(SH-PEB)相比,SH-MPST细胞中MPST mRNA及蛋白的表达水平显著增加,且细胞内MPST酶活性、酶含量及细胞释放硫化氢的水平均显著增加(p0.05)。以上研究表明,MPST基因慢病毒表达载体成功构建,并获得稳定表达外源MPST基因的SH-SY5Y细胞株,这将为MPST功能的深入研究提供依据。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建CDH1基因敲除的人乳腺癌MCF-7稳定细胞系

目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建CDH1基因缺失的人乳腺癌MCF-7稳定细胞系。方法:根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计能特异性针对CDH1基因的sgRNA,以lentiCRISPR v2质粒为骨架构建能表达此sgRNA和Cas9蛋白的重组质粒。测序鉴定后,将重组质粒与逆转录病毒包装质粒VSVG、PAX2在氯化钙介导下共同转入HEK293T细胞进行病毒包装,转染48 h后收集病毒上清,直接感染人乳腺癌MCF-7细胞。采用嘌呤霉素筛选CDH1缺失的乳腺癌MCF-7细胞,通过DNA测序、Western印迹及免疫荧光染色实验验证获得的MCF-7细胞。结果:构建了靶向CDH1的CRISPR/Cas9质粒;DNA测序和Western印迹实验结果表明获得了稳定敲除CDH1的人乳腺癌MCF-7细胞。免疫荧光染色结果显示,相比对照组,稳定敲除CDH1的MCF-7细胞中已无法明显观察到E-钙黏蛋白的表达分布。结论:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了CDH1基因缺失的MCF7细胞系,为进一步研究CDH1在肿瘤免疫治疗中的作用提供了基础。     

过表达SGK3肝癌细胞BEL-7402在去甾体激素血清中的抗凋亡研究

目的:构建过表达血清与糖皮质激素调节激酶3(SGK3)的质粒以及稳定表达SGK3的肝癌细胞系BEL-7402,研究其在去甾体激素胎牛血清(FBS)中的抗凋亡能力。方法:PCR扩增SGK3基因,将扩增产物连接到p CDH载体,构建出p CDH-SGK3的慢病毒载体质粒,将其同空白对照p CDH-NC分别与慢病毒包装载体共转入293T细胞,包装成慢病毒p CHD-SGK3和p CDH-NC;将构建的慢病毒感染肝癌细胞BEL-7402并用嘌呤霉素筛选,Western印迹检测SGK3的表达;观察细胞在FBS及去甾体激素FBS中的生长情况。结果:包装出p CDH-SGK3重组慢病毒,此慢病毒感染肝癌细胞系BEL-7402后获得表达;CCK8实验表明过表达SGK3可促进肝癌细胞的生长,BEL-7042细胞中有雄激素的表达,去甾体激素FBS中细胞生长受到抑制,过表达SGK3可增强肝癌细胞在去甾体激素血清中的抗凋亡能力。结论:在肝癌细胞BEL-7402中过表达SGK3可促进细胞生长,可增强细胞在去甾体激素FBS中的抗凋亡能力。     

稳定表达猪APOBEC3F的PK15细胞单克隆株的建立

目的:利用慢病毒载体建立稳定表达猪载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3F(pAPOBEC3F,简称pA3F)的PK15细胞系。方法:以实验室前期构建的pBPLV-flag-pA3F质粒为模板,PCR扩增pA3F基因,克隆到pLenti-Puro-3Flag载体构建成pLenti-Puro-pA3F-3Flag质粒,Western印迹鉴定其在HEK293T细胞中的表达;将pLenti-Puro-pA3F-3Flag质粒与包装载体共转染HEK293T细胞,包装成Lenti-pA3F慢病毒并测定病毒滴度;将Lenti-pA3F慢病毒感染PK15细胞,通过嘌呤霉素压力筛选并结合有限稀释法,筛选稳定表达pA3F的细胞单克隆株,最终Western印迹检测细胞单克隆株中pA3F的表达。结果:菌落PCR和序列测定表明pLenti-Puro-pA3F-3Flag质粒构建正确,Western印迹显示该质粒可在HEK293T细胞中表达pA3F蛋白;包装了Lenti-pA3F慢病毒,滴度为1.32×10~8TU/mL,慢病毒感染PK15细胞后可检测到pA3F蛋白的表达;经Western印迹鉴定,筛选得到的单克隆细胞可稳定表达pA3F蛋白。结论:建立了稳定表达pA3F的PK15细胞单克隆株,为进一步深入研究猪内源性反转录病毒在pA3F作用下的免疫逃逸机制奠定了基础。     

GPRC6A过表达前列腺癌细胞株构建及EMT相关研究

目的:构建GPRC6A基因过表达的前列腺癌LncapC4-2细胞株,检测细胞迁移和侵袭能力改变及EMT相关基因表达,为研究GPRC6A介导的EMT在前列腺癌发生发展过程中的作用奠定基础。方法:构建过表达GPRC6A的慢病毒载体pCDH-GPRC6A,人胚肾293T细胞包被病毒并感染Lncap C4-2细胞株,Puromycin筛选获得稳定过表达GPRC6A的细胞株。RT-PCR和Western blot验证细胞GPRC6A的过表达情况。划痕和transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,qPCR检测EMT相关基因表达。结果:成功构建GPRC6A表达的慢病毒载体,RT-PCR和Western blot检测LncapC4-2 GPRC6A过表达细胞株中GPRC6A的mRNA和蛋白质表达增高,与对照相比较,在过表达GPRC6A的LncapC4-2细胞中,细胞迁移和侵袭能力增强,并且EMT相关基因E-cadherin表达降低而SNAIL表达增高。结论:成功构建过表达的GPRC6A的前列腺癌细胞株,肿瘤细胞中的GPRC6A可能通过增强细胞迁移和侵袭能力并促进细胞EMT而参与前列腺癌发生发展过程。     

TRAIL 慢病毒载体构建及其在肝癌细胞中的表达

目的:构建携带TRAIL基因的慢病毒表达载体并实现其在肝癌细胞株HepG2中的稳定高表达。方法:构建TRAIL重组慢病毒表达载体pCDH-CMV-TRAIL-EF1-GFP-T2A-Puro,脂质体法将重组慢病毒载体和包装质粒混合物共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,纯化并测定病毒滴度。利用Western blotting检测TRAIL蛋白在HepG2中的表达。结果:酶切以及测序证实,成功构建TRAIL基因重组慢病毒载体,纯化的慢病毒滴度为1.02×104ifμ/μL。利用嘌呤霉素筛选获得稳定表达TRAIL的细胞系,经Western blot方法检测到TRAIL蛋白的稳定高表达。结论:成功构建了带有TRAIL基因的慢病毒载体,并实现其在HepG2的稳定高表达。     

GFP-LC3B真核表达载体的构建及表达鉴定

目的:构建人自噬相关基因LC3B的真核表达载体p EGFP-C1-LC3B,并鉴定其表达。方法:以乳腺文库为模板,PCR扩增LC3B全长基因,将其克隆至p EGFP-C1表达载体,得到p EGFP-C1-LC3B重组质粒,酶切和测序鉴定后,转染ZR75-1细胞,Western印迹检测真核细胞中GFP-LC3B融合蛋白的表达,用倒置荧光显微镜观察自噬诱导剂雷帕霉素处理和未处理ZR75-1细胞质中GFP-LC3B的分布。结果:Western印迹可见GFP-LC3B融合蛋白表达条带;在荧光显微镜下,ZR75-1细胞内可见绿色荧光,雷帕霉素刺激后有明显绿色荧光聚集体形成。结论:人自噬相关基因LC3B的真核表达载体p EGFP-C1-LC3B构建成功,为进一步研究自噬在乳腺癌细胞中的作用机制奠定了基础。