玉米种质资源抗弯孢菌叶斑病特性研究

针对近年弯孢菌叶斑病日益严重的发生趋势,对1698份玉米种质(自交系、群体、杂交种以及特殊材料)进行了抗弯孢菌叶斑病鉴定。结果表明,中国玉米种质抗性较引进种质抗性好;不同省份所供种质抗性存在差异,北京、四川、广西种质总体抗性较好;在新选育的自交系中,鉴定出12份高抗材料;在当前培育的杂交种中,有22份高抗或抗弯孢菌叶斑病;玉米对弯孢菌叶斑病抗性在相同核基因、不同细胞质种质间无差异;玉米抗大斑病基因对抗弯孢菌叶斑病无效。     

玉米种质资源抗弯孢菌叶斑病特性研究

针对近年弯孢菌叶斑病日益严重的发生趋势,对1698份玉米种质(自交系、群体、杂交种以及特殊材料)进行了抗弯孢菌叶斑病鉴定.结果表明,中国玉米种质抗性较引进种质抗性好;不同省份所供种质抗性存在差异,北京、四川、广西种质总体抗性较好;在新选育的自交系中,鉴定出12份高抗材料;在当前培育的杂交种中,有22份高抗或抗弯孢菌叶斑病;玉米对弯孢菌叶斑病抗性在相同核基因、不同细胞质种质间无差异;玉米抗大斑病基因对抗弯孢菌叶斑病无效.     

分离自黄瓜的多主棒孢霉不同表型菌株对杀菌剂的敏感性

【目的】通过对分离自黄瓜的多主棒孢霉不同表型菌株适宜生长温度、产孢量等表型特征和对8种杀菌剂的敏感性研究,为多主棒孢霉侵染引起的黄瓜叶斑病和茎疫病的化学防治提供技术支持。【方法】采用温度梯度法测定病菌适宜生长温度;采用PDA培养基25°C黑暗培养5 d和21 d,计测不同表型菌株单位面积产孢量;采用含药平板法测定不同表型菌株对8种杀菌剂的敏感性。【结果】分离自黄瓜的多主棒孢霉不同表型菌株适宜生长温度为25-30°C;在PDA平板25°C黑暗培养5 d,气生菌丝稀少型菌株cu-4、cu-5即大量产孢,产孢量明显多于气生菌丝丰茂型菌株;在试验浓度下,5个试验菌株对8种杀菌剂的敏感性依次为:代森锰锌氟硅唑戊唑醇苯醚甲环唑速克灵百菌清嘧菌酯多菌灵。【结论】分离自黄瓜的多主棒孢霉不同表型菌株在适宜生长温度、菌丝生长速度、产孢量及对杀菌剂的敏感性等方面均存在差异。在试验浓度下,供试菌株对多菌灵和嘧菌酯的敏感性极低(抑制率40%),这2种杀菌剂已失去对该地区黄瓜褐斑病的防控作用。     

大麦主栽品种亲缘系数和对叶斑病的抗性分析

为明确我国大麦主栽品种的遗传多样性及其对叶斑病的抗性来源,采用亲缘系数(COP,coefficient of parentage)分析方法对155个主栽大麦品种的遗传系谱进行聚类分析,同时对其中79个供试大麦品种在苗期和成株期分别接种2个强毒性菌株进行抗性鉴定。结果显示,155个品种聚为6个类群,有亲缘关系的品种占全部品种14.77%。在品种间组成的11935个组合中,1763个组合间存在亲缘关系,其COP值变化范围在0~0.7500之间,亲缘系数总和为157.5867,平均值为0.0132。根据系谱分析发现了不同育种单位所育品种的核心亲本,并追溯其主要的祖先亲本。此外,通过对叶斑病的抗性鉴定,发现大多数供试的大麦品种感叶斑病,高抗品种主要集中在垦啤麦系列品种和蒙啤麦3号,部分华大麦和驻大麦系列的品种在苗期或成株期中抗叶斑病。系谱分析及抗性鉴定结果揭示了我国大麦叶斑病抗性基因存在不同来源,分析结果有利于提高抗叶斑病基因筛选效率和缩小筛选范围,也将促进抗叶斑病新基因资源的发掘和利用。     

玫烟色棒束孢(Isaria fumosorosea)侵染小菜蛾的表达谱分析

【背景】昆虫病原真菌对寄主的侵染是一个十分复杂的过程,是多基因共同作用的结果。玫烟色棒束孢(Isaria fumosorosea) IFCF01菌株对小菜蛾具有很高的致病力,然而有关玫烟色棒束孢对小菜蛾致病的相关基因少见报道。【目的】筛选玫烟色棒束孢侵染小菜蛾相关基因,为更好地利用玫烟色棒束孢防治小菜蛾提供基因靶点。【方法】采用第二代高通量测序技术RNA-Seq,对玫烟色棒束孢侵染小菜蛾2–3龄幼虫4、8、12、16、24、30、36 h的虫菌混合样品(处理组)及纯培养玫烟色棒束孢(对照组)进行测序分析并筛选差异表达基因,结合生物信息学方法分析差异基因涉及的功能模块和信号通路。【结果】玫烟色棒束孢侵染小菜蛾混合样品与纯培养玫烟色棒束孢对照组对比分析共获得28 384个差异基因,其中显著差异表达基因274个,上调表达118个,下调表达156个。筛选获得的显著差异表达基因,特别是上调表达基因可能与玫烟色棒束孢对小菜蛾的侵染有关。GO二级分类显示,差异表达基因能够注释到36个GO条目中,包含18个生物学过程、9个细胞组分和9个分子功能。KEGG通路分析显示共有171个差异表达基因(differentially expressed gene,DEG)注释到132个通路中,其中有66个DEG显著富集在14个通路中。这些显著差异表达基因中大部分为玫烟色棒束孢侵染过程中潜在致病毒力相关基因。【结论】本研究为筛选玫烟色棒束孢侵染小菜蛾致病相关基因提供重要数据库,也为阐明玫烟色棒束孢对小菜蛾的侵染机制提供基础。     

几株类棒束孢菌株分类地位的修订

【背景】粉棒束孢是自然环境中常见的一种昆虫病原真菌,全球广泛分布且寄主多样。然而,棒束孢属许多种形态学特征相似,仅根据经典形态学鉴定容易出现错乱现象。长期以来依据形态特征鉴定为粉棒束孢的菌株,其准确的分类地位出现了越来越多的争议。最近,该属起源被确定是多系发生的。【目的】明确粉棒束孢的分类沿革并探究先前被鉴定为粉棒束孢菌株的准确分类地位。【方法】选取6株先前被鉴定为粉棒束孢的菌株,对其进行经典形态观察,并扩增5个基因位点(nrSSU、nrLSU、TEF、RPB1和RPB2)的基因序列,进行多基因分子系统发育学分析。【结果】通过查阅文献和实验研究,明确了粉棒束孢分类研究的历史沿革;供试的6株不同来源的菌株与粉棒束孢模式种亲缘关系较远,而与新成立的组合种Samsoniella hepiali完全一致。【结论】利用经典形态学特征和构建5个基因系统发育树,重新修订6株类棒束孢菌株的正确分类地位为Samsoniella hepiali。为该类昆虫病原真菌正确分类提供合理的方法,也为开发和利用该类菌株提供科学的指导。     

玉米种质资源对六种重要病虫害的抗性鉴定与评价

在2003-2005年间,对604份玉米种质进行了抗弯孢菌叶斑病和玉米螟鉴定,筛选出抗弯孢菌叶斑病的材料93份,抗玉米螟材料22份。2006-2009年间,对836份玉米种质进行了抗大斑病、茎腐病、穗腐病和瘤黑粉病的鉴定与评价,筛选出一批高抗和多抗的资源。在836份资源中,对大斑病1、2和N号3个生理小种具有抗性的材料均为50%左右;抗茎腐病材料为41.3%,高抗和抗性种质分别为264和81份;穗腐病高抗和抗性种质分别为5和171份,占比为21.1%;瘤黑粉病高抗和抗性种质各261和14份,占总鉴定材料的32.9%。上述结果表明抗大斑病、茎腐病和瘤黑粉病的种质资源较为丰富。通过对抗性结果进行对比分析,发现不同生态区玉米种质的抗性强弱以及抗性多样性存在明显差异,黑龙江和内蒙古的种质对病虫害的抗性强弱及多样性程度明显高于四川种质。此外,玉米自交系对病虫害的抗性强弱以及多抗性程度高于农家种。     

玉米种质资源对六种重要病虫害的抗性鉴定与评价

在2003－2005年间,对604份玉米种质进行了抗弯孢菌叶斑病和玉米螟鉴定,筛选出抗弯孢菌叶斑病的材料93份,抗玉米螟材料22份。2006－2009年间,对836份玉米种质进行了抗大斑病、茎腐病、穗腐病和瘤黑粉病的鉴定与评价,筛选出一批高抗和多抗的资源。在836份资源中,对大斑病1、2和N号3个生理小种具有抗性的材料均为50％左右;抗茎腐病材料为41.3％,高抗和抗性种质分别为264和81份;穗腐病高抗和抗性种质分别为5和171份,占比为21.1％;瘤黑粉病高抗和抗性种质各261和14份,占总鉴定材料的32.9％。上述结果表明抗大斑病、茎腐病和瘤黑粉病的种质资源较为丰富。通过对抗性结果进行对比分析,发现不同生态区玉米种质的抗性强弱以及抗性多样性存在明显差异,黑龙江和内蒙的种质对病虫害的抗性强弱及多样性程度明显高于四川种质。此外,玉米自交系对病虫害的抗性强弱以及多抗性程度高于农家种。     

一串红叶斑病的病原菌鉴定

一串红Salvia splendens叶斑病被发现在杭州市农科所栽培花卉的遮阳网大棚中,是由棒孢霉属真菌侵染引起的。在田间,病原菌侵染植株的茎和叶片,引起当年移植苗发生茎腐、落叶、植株枯萎和死亡。通过对病原菌形态学观察以及核糖体DNA ITS序列分析,证明侵染一串红的病原菌为决明生棒孢霉菌Corynespora cassiicola。致病性试验结果表明,一串红是决明生棒孢霉菌的寄主。种子带菌检验结果显示,种子带菌率仅为1%。     

环链棒束孢IcHsp104与IcHsp78的克隆及在不同胁迫条件下的表达检测

【背景】环链棒束孢(Isariacateinannulata)是一种重要的虫生真菌,许多环境因子的胁迫作用影响了该菌在田间的生防效果。【目的】热休克蛋白酪蛋白溶解蛋白酶(HeatShockProteinCasein LyticProteinase,Hsp100/Clp)是一类ATP依赖型Hsp100家族蛋白,克隆该菌株Hsp100/ClpB家族的2个关键基因IcHsp104与IcHsp78,探索该对基因在应对不同温度及盐浓度胁迫下的作用。【方法】通过前期获得的转录组数据库,采用本地BLAST方法对环链棒束孢Hsp100家族基因进行分析筛选。通过RT-PCR技术,对环链棒束孢Hsp100基因的编码区(Open Reading Frame,ORF)进行碱基验证。通过分子生物信息学分析软件,对环链棒束孢Hsp100基因的氨基酸结构、进化树、功能结构域和三级结构进行分析。通过不同温度及盐浓度处理菌株,采用荧光定量PCR(Real-TimeQuantitative PCR,RT-qPCR)技术,对获得的基因进行表达检测。【结果】共筛选出2个环链棒束孢Hsp100/ClpB基因Hsp104与Hsp78,将其命名为IcHsp104与IcHsp78,2个基因分别编码923个和805个氨基酸,分子量分别为103.199 kD和88.805 kD;2个基因均与棒束孢属、白僵菌属和虫草属3个物种的亲缘关系最近,但2个基因之间的同源性较低;2个基因编码的蛋白均为经典的AAA+-ATPase家族蛋白,三级结构以α螺旋为主。另外,经高低温处理菌株后,2个基因的表达均会上调,并随处理时间的延长上升越显著,而且高温胁迫组显著强于低温组。经不同浓度氯化钠处理后,低浓度组2个基因的表达量均上调,高浓度组2个基因的表达量均受到抑制。【结论】环链棒束孢IcHsp104与IcHsp78基因在抵抗外界温度及盐胁迫过程中起到重要的作用,为后续环链棒束孢应对环境胁迫的机理研究提供了理论基础。     

烟草棒状弯孢菌线粒体全基因组特征及系统发育分析

近年来,由弯孢属真菌侵染引发的病害在烟草上有上升的趋势,严重影响烟叶的产量和质量。为了更好地防治由弯孢属真菌引起的烟草叶斑病,本研究利用高通量测序技术对一株分离自烟草叶片的棒状弯孢菌Curvulariaclavata线粒体基因组进行测序,组装得到一个环状的线粒体基因组,并对其组成特征、与典型叶斑病真菌的系统发育关系进行分析。结果表明,烟草棒状弯孢菌线粒体基因组长度为41 763 bp,共编码38个基因(13个蛋白编码基因、2个rRNA基因和23个tRNA基因),其碱基组成有显著的A-T偏好性,占比高达70.35%。线粒体基因组中只有3个内含子和少量重复序列,这是造成其基因组大小收缩的主要原因。通过6个近缘病原真菌线粒体全基因的共线性分析,发现其线粒体基因组发生了基因重排事件。同时,物种同源区长度与对应物种的线粒体基因组大小呈正相关关系,同源区长度可能会影响物种的线粒体基因组大小。在选择压力分析中,发现烟草棒状弯孢菌线粒体为确保优势基因稳定遗传,自然选择和纯化选择起到了主导作用。系统发育分析表明烟草棒状弯孢菌与麦根腐平脐蠕孢Bipolarissorokiniana和稻平脐蠕孢Bipola...     

草莓拟盘多毛孢叶斑病的病原菌

于2013年在北京市房山区发现了一种新的草莓叶部病害,为明确引起该病害的病原菌种类,采用组织分离法对病叶进行了病原菌的分离,经纯化得到一株病原菌CMF4。通过室内人工接种对该菌株的致病性和寄主范围进行测定,发现该菌株可以导致草莓叶片坏死和果实腐烂,可引起有伤供试植物牡丹、海棠、芍药、杏、樱桃、桃和月季发病,但不能无伤侵入,对人工接种发病的植株进行病原菌再分离可得到原接种病原菌。采用rDNA-ITS序列分析方法并结合该病原菌的形态特征进行鉴定,发现引起该病害的病原菌为棒孢拟盘多毛孢Pestalotiopsis clavispora。这是棒孢拟盘多毛孢所致草莓叶斑病在国内的首次报道。     

农杆菌介导的小孢拟盘多毛孢遗传转化及突变体筛选

本研究通过农杆菌EHA105介导的方法,以含潮霉素抗性基因和GFP基因的双元载体pCAMBgfp为转化载体,对小孢拟盘多毛孢Pestalotiopsis microspora KFRD-2菌株进行遗传转化。基于潮霉素及GFP荧光抗性进行转化子的初步筛选,随后,进一步对转化子的菌落特征、菌丝生长速率、产孢量、荧光稳定性及致病力进行验证。结果获得阳性转化子100余株,转化效率达200个转化子/10⁶个孢子。大部分转化子与野生型菌株无明显形态及致病力差异。同时,获得了14株菌丝形态、产孢量或致病力与野生型存在明显差异的突变株,可用于小孢拟盘多毛孢关键致病基因的挖掘验证及致病机理等研究。     

玫烟色棒束孢诱导的小菜蛾免疫响应表达谱分析

【目的】本研究旨在筛选小菜蛾Plutella xylostella应对玫烟色棒束孢Isaria fumosorosea侵染的免疫应答及其网络调控基因,以进一步探讨小菜蛾对玫烟色棒束孢的防御机制。【方法】采用第二代高通量测序技术RNA-seq,对处理后12 h的感染玫烟色棒束孢和健康(平行对照)的小菜蛾4龄幼虫转录组进行了测序,通过生物信息学分析对得到的差异基因进行了功能注释和分类,对差异基因参与的信号通路进行了分析。【结果】在感菌和健康小菜蛾幼虫转录组两个表达谱里,分别获得了12 346 987和12 315 210个clean reads,有60.93%和61.26%的reads分别能比对到参考基因库里,其中完美匹配(perfect match)的比例分别为32.15%和32.73%。共得到351个显著差异表达基因(differentially expressed unigenes,DEUs),上调表达基因有275个,下调表达基因有76个,与免疫防御反应潜在相关的基因有156个。GO(Gene Ontology)富集分析有102个DEUs分布到46个GO term里,KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)pathway富集分析结果显示,有132个DEUs显著富集在13个代谢通路(pathway)里。【结论】这些差异表达基因中,大部分编码潜在的与免疫识别及调控相关的基因,集中在能量代谢、疾病反应和防御反应等相关通路。研究结果为挖掘与玫烟色棒束孢侵染相关的小菜蛾免疫应答候选基因提供了重要数据库,也为阐明小菜蛾对玫烟色棒束孢的免疫机制奠定理论基础。     

东北地区保护地黄瓜根茎上真菌的分离与鉴定

对采自东北地区保护地内的38株黄瓜枯萎病病株及8株未发病黄瓜植株的根茎进行真菌分离与鉴定,共得到真菌11个属18个种,其中威尔士棒孢(Corynespora cambrensis)为中国新记录种。镰孢属(Fusarium)为优势属,分离到8个种及变种。     

糖多孢红霉菌多拷贝表达载体pZM的构建

对糖多孢红霉菌染色体上红霉素生物合成基因进行改造 ,已经合成了多种红霉素类似物。在糖多孢红霉菌中对红霉素类似物进行结构修饰 ,以pWOR1 0 9质粒为基础构建糖多孢红霉菌多拷贝表达载体pZM。pZM载体带有PermE启动子、fd终止子、多克隆位点、硫链丝菌肽和氨苄青霉素抗性基因、以及在大肠杆菌和糖多孢红霉菌中复制的ColE1ori和pJV1ori复制子 ,系可在大肠杆菌和糖多孢红霉菌中扩增的穿梭质粒。在糖多孢红霉菌中 ,pZM可以表达氨普霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因 ,从糖多孢红霉菌中提取的表达质粒酶切图谱与转化前一致 ,表明pZM是糖多孢红霉菌中多拷贝、稳定的表达载体。     

转WMV-2 CP基因黄瓜植株的再生

以黄瓜无菌苗子叶切段为外植体 ,通过叶盘转化法与根瘤农杆菌进行共培养建立了黄瓜的转基因系统。农杆菌菌株为LBA44 0 4,内含双元载体pBPMWMV。该质粒载体带有一个npt Ⅱ基因 (筛选具有卡那霉素抗性的植株 )和一个WMV 2CP基因。抗卡那霉素 (Kanr)的黄瓜植株经DNA分子点杂交、PCR检测以及Southernblot证实 ,外源的WMV 2CP基因确实已导入黄瓜细胞且能稳定地遗传到子一代。对WMV 2CP基因在子一代的分离进行了统计。获得的转基因子一代植株对WMV 2表现出较强的抗性 ,可以延迟发病时间 ,减轻发病程度     

马尾松纯林虫生真菌群落组成及优势种生态位研究

对麻姑山马尾松纯林的虫生真菌群落进行了调查研究,共发现了3科6属14种。该林区虫生真菌群落的主要成分是环链棒束孢、球孢白僵菌和粉棒束孢,虫生菌种类较少,较为单一。对3种优势虫生真菌环链棒束孢、球孢白僵菌和粉棒束孢的营养、时间及营养-时间二维生态位进行了分析。结果表明,环链棒束孢与粉棒束孢的营养生态位重叠度最大,与球孢白僵菌时间生态重叠度最大。而球孢白僵菌的营养生态位宽度、时间生态位宽度和营养-时间二维生态位宽度都为最大。球孢白僵菌在自然界中发生时间长,分布范围广,寄主昆虫丰富,生存能力强的实际情况也支持这一分析结果。     

黄孢原毛平革菌基因启动子的分离与鉴定

利用启动子探针型载体pSUPV8直接在大肠杆菌(Escherichia coli)中分离黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)基因启动子片段,获得6个潮霉素抗性(Hyg-r)重组子。对重组子CH2、CH6进行序列分析,结果发现它们都存在真核生物基因启动子的保守序列;用原生质体转化法将其转化黄孢原毛平革菌,仅pCH6获得了潮霉素抗性转化子;PCR和斑点杂交分析表明,pCH6已成功导入黄孢原毛平革菌,并启动潮霉素抗性基因的表达。     

黄瓜转新型抗菌蛋白基因GNK2-1及其抗枯萎病的研究

GNK2-1为一种来自银杏（Ginkgo biloba）种仁的新型抗真菌蛋白,具有较强的真菌抗性且性质稳定。序列分析表明,其结构与所有已知的抗真菌蛋白不同,而与富含半胱氨酸的植物类受体激酶的胞外结构域相似。为探索GNK2-1基因在黄瓜（Cucumis sativus）抗病反应中的作用,利用基因重组技术构建了GNK2-1的高效组成型表达载体,并利用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导转入黄瓜栽培品种农城3号（Cucumis sativus＇ Nongcheng No.3＇）基因组中。通过对获得的抗性植株进行PCR、RT-PCR和Western blot检测分析,结果表明GNK2-1基因可在T0代转基因植株中转录表达,并能在T1代转基因黄瓜中稳定遗传。离体枯萎病抗性鉴定结果表明,转GNK2-1基因的黄瓜对枯萎病的抗性增强,GNK2-1可以作为黄瓜抗病性改良的潜在基因资源。