聚-ε-赖氨酸高产菌株的筛选及其发酵工艺的初步研究

利用亚甲基蓝平板初筛、摇瓶复筛,从土壤中筛选了一株聚-ε-赖氨酸(ε-PL)高产菌株,ε-PL摇瓶产量大于2g/L,经初步鉴定该菌株为白色链霉菌(Streptomyces albulus)。对该菌株发酵生产ε-PL的培养基成分进行初步研究表明:葡萄糖是最好的碳源,酵母粉和硫酸铵是最佳的复合氮源,在优化培养基下,ε-PL摇瓶产量达到3.9g/L。     

具有双重抗生素抗性的ε-聚赖氨酸高产菌株选育及生理特性

以ε-聚赖氨酸产量为1.60g/L的Streptomyces albulus M-Z18为出发菌株,利用核糖体工程技术选育具有双重抗生素抗性的ε-聚赖氨酸高产菌株,并对高产菌株和出发菌株的生理生化性能进行比较。通过链霉素诱变成功选育出了1株遗传稳定的ε-聚赖氨酸产生菌S.albulus S-7,ε-聚赖氨酸产量为2.03g/L;对S.albulus S-7叠加巴龙霉素,获得1株遗传稳定的具有双重抗性的ε-聚赖氨酸产生菌S.albulus SP-14,ε-聚赖氨酸产量为2.37g/L,比出发菌株S.albulus M-Z18的ε-聚赖氨酸产量增加了48.10%。使用链霉素和巴龙霉素选育具有双重抗生素抗性的ε-聚赖氨酸高产菌株是一种有效的手段。     

ε-聚赖氨酸高产改造菌发酵过程分析与工艺改进

ε-聚赖氨酸(ε-PL)是我国新近批准的一种天然食品防腐剂,由链霉菌好氧发酵制备而来。通过传统育种手段强化产生菌ε-PL合成能力是提高其发酵水平的重要途径,然而高产改造菌与出发菌株发生的生理改变却很少被关注。本研究从培养特征,营养需求和发酵过程参数等方面进行比较与分析,发现高产菌株Streptomyces albulus GS114具有需氧量小、菌体量低、ε-PL产量高、单位菌体ε-PL合成能力强、转化率高等特点。为了进一步提高S.albulus GS114的ε-PL产量,通过提高pH冲击策略中预培养p H增加其菌体量,实现ε-PL产量达到53.49 g/L,较优化前提高了11.9%。研究结果将为ε-PL工业化生产奠定基础。     

一株ε-多聚赖氨酸产生菌的筛选与鉴定

【目的】筛选和鉴定产ε-多聚赖氨酸(ε-polylysine,ε-PL)的放线菌菌株,测定所产ε-PL的结构和聚合度,研究其抑制微生物生长的效果。【方法】利用亚甲基蓝和ε-PL因静电排斥而形成透明圈原理筛选ε-PL产生菌,采用Itzhaki方法复筛。考察分离菌株的形态、生理生化特征和16SrRNA基因、gyrB基因序列的同源性鉴定菌种。结合其波谱特征对其所产ε-PL进行结构和聚合度鉴定。采用抑菌圈法考察所产ε-PL对7株指示菌的抑菌活性。【结果】获得3株能够产生ε-PL的放线菌,其中X-18的ε-PL产量最高,达到0.8g/L,综合形态、生理和分子生物学分析结果,鉴定为白色链霉菌(Streptomyces albulus)。根据波谱学特征,并与标准品比对,证实该ε-PL分子聚合度为25–30,抑菌实验结果显示,它对细菌的抑菌效果明显好于真菌。【结论】从土壤中分离到1株抑菌效果较好的ε-PL产生菌S. albulus X-18,丰富了ε-PL产生菌资源。     

链霉菌ε-聚赖氨酸发酵过程中的氧化胁迫效应

【目的】探究ε-聚赖氨酸(ε-PL)产生菌对p H和ε-PL的耐受性、氧化胁迫与ε-PL合成之间的关系。【方法】选取3株ε-PL产生菌Streptomyces sp.AF3-44、Streptomyces sp.AS32和Streptomyces albulus F15,比较其在发酵性能、p H和ε-PL耐受性以及抗氧化胁迫能力上的差异,并对菌株发酵过程的活性氧成因进行分析。【结果】在3株菌中AF3-44具有最强的p H和ε-PL耐受性及抗氧化胁迫能力,因而在发酵后期能够保持良好的细胞活性和最高的ε-PL浓度;ε-PL引起的氧化胁迫主要发生在发酵前期,而发酵中后期氧化胁迫的产生主要由酸性p H导致。【结论】提高链霉菌ε-PL发酵过程中的抗氧化胁迫能力,可提升菌体活力和发酵水平。     

ε-聚赖氨酸高产菌选育与发酵性能评价

【目的】选育ε-聚赖氨酸(ε-PL)高产菌,并探究不同碳源对其发酵性能的影响。【方法】借助基因组重排和核糖体工程两种育种手段强化ε-PL产生菌的合成能力,并利用p H冲击工艺评价不同碳源对ε-PL发酵的影响。【结果】经过4轮基因组重排和4轮核糖体工程连续选育,获得1株高产突变株Streptomyces albulus GS114,其摇瓶ε-PL产量达到3.0 g/L,较出发菌提高了1.7倍。该改造菌株在5 L发酵罐中分别以葡萄糖和甘油为碳源进行192 h的补料-分批发酵时,ε-PL发酵产量分别达到了43.4 g/L和45.7 g/L,较出发菌提高了11.0%和14.9%,而菌体量分别减少了24.0%和33.2%,ε-PL得率提高了34.2%和30.7%。【结论】基因组重排结合核糖体工程育种是一种有效的ε-PL高产菌选育手段,研究结果将为ε-PL高产菌改造和工业生产碳源选择提供直接指导。     

ε-聚赖氨酸生产菌株的筛选和鉴定

建立了一种灵敏的ε-PL产生菌高通量的筛选方法。在分离培养基中加入150mg／L K2Cr2O7,以有利于放线菌的富集分离;并添加美蓝染料,利用产碱菌株碱性分泌物和美蓝之问的静电作用而形成独特的透明圈,从而灵敏地筛选得到产碱菌株;利用Dragendorff试剂与生物碱特有的颜色反应从产碱菌株中检出得到46株生物碱产生株;最后对产生物碱的菌株的发酵液进行ε-PL含量分析,确定4株ε-PL产生菌株。对其中一株ε-PL高产菌PL6-3菌株进行形态、生理生化和16S rDNA分析,结果表明PL6-3为北里孢菌属（Kitasatospora）。     

聚-ε-赖氨酸高产菌株的筛选及其发酵工艺的初步研究

利用亚甲基蓝平板初筛、摇瓶复筛,从土壤中筛选了一株聚-ε-赖氨酸（ε-PL）高产菌株,ε-PL摇瓶产量大于2g/L,经初步鉴定该菌株为白色链霉菌（Streptomyces albulus）。对该菌株发酵生产ε-PL的培养基成分进行初步研究表明：葡萄糖是最好的碳源,酵母粉和硫酸铵是最佳的复合氮源,在优化培养基下,ε-PL摇瓶产量达到3.9 g/L。     

ε-聚赖氨酸生产菌株的筛选和鉴定*

建立了一种灵敏的ε-PL产生菌高通量的筛选方法。在分离培养基中加入150mg/LK₂Cr₂O₇,以有利于放线菌的富集分离;并添加美蓝染料,利用产碱菌株碱性分泌物和美蓝之间的静电作用而形成独特的透明圈,从而灵敏地筛选得到产碱菌株;利用Dragendorff试剂与生物碱特有的颜色反应从产碱菌株中检出得到46株生物碱产生株;最后对产生物碱的菌株的发酵液进行ε-PL含量分析,确定4株ε-PL产生菌株。对其中一株ε-PL高产菌PL6-3菌株进行形态、     

ε-聚赖氨酸生物合成及其产生菌遗传转化研究进展

ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是由25-35个L-赖氨酸(L-lysine)通过α-ε酰胺键连接的具有很强抗菌活性的聚合物,是自然界中迄今为止仅发现的2种均聚氨基酸(ε-聚赖氨酸和γ-聚谷氨酸)之一。目前,研究发现ε-聚赖氨酸的合成酶是一种非核糖体肽合成酶,它催化前体物质L-lysine经多轮缩合反应合成链长不均一的ε-聚赖氨酸,与I型聚酮合成酶的合成过程相似。ε-聚赖氨酸的合成不受降解酶控制。同时,针对产生菌遗传转化的穿梭质粒载体pLAE001和pLAE003已构建成功,为进一步探索ε-聚赖氨酸生物合成提供了条件。本文主要就ε-聚赖氨酸生物合成及产生菌遗传转化体系进行综述。另外,扼要介绍了作者所在课题组的相关研究工作、取得的进展并提出了相应的见解,论文最后部分对组合生物合成在ε-PL产生菌菌种改造中的应用前景进行了探讨。     

核糖体工程技术选育ε-聚赖氨酸高产菌株

【目的】利用核糖体工程技术选育Streptomyces albulus AS3-14的链霉素和利福平双重抗性突变株,以提高其ε-聚赖氨酸合成能力。【方法】通过链霉素抗性筛选,获得链霉素抗性的ε-聚赖氨酸产量提高突变株;在此基础上,继续筛选其利福平抗性突变株,实现链霉素和利福平双重抗性ε-聚赖氨酸高产菌选育。【结果】获得的双重抗性高产突变株Streptomyces albulus WG-608的ε-聚赖氨酸摇瓶产量达到3.7 g/L,5 L发酵罐补料分批发酵ε-聚赖氨酸产量达到53.0 g/L,较出发菌株分别提高了42.3%和32.5%。【结论】链霉素和利福平双重抗性选育能够显著提高ε-聚赖氨酸产生菌Streptomyces albulus的产物合成能力。     

卷枝毛霉pyrG基因缺陷突变株的诱变筛选与鉴定

为制备新的遗传筛选标记用于构建高产番茄红素的工程菌株,实验运用化学诱变的手段,以N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍为诱变剂,以番茄红素生产菌株卷枝毛霉MU616为出发菌株,诱变获得5株尿嘧啶缺陷型突变株,突变株在基本培养基中培养5天后仍不能生长。通过同源转化带有pyrG基因(编码乳清酸核苷-磷酸盐脱羧酶)的质粒pEPM1确定突变株Mt1、Mt4和Mt5为pyrG基因缺陷突变株。随之对pyrG突变株进行生长特性的研究和产番茄红素性能的检测,结果表明,其中突变株Mt4的生物量为(9.0±0.6)g/L,番茄红素产量在黑暗和光照条件下分别为(1 648±185)μg/g和(3 234±281)μg/g,均与出发菌株相似,适宜作为进行卷枝毛霉转化的带有遗传标记的受体菌。pyrG基因缺陷突变菌株的获得对构建高产番茄红素的卷枝毛霉工程菌具有重要的意义。     

ε-聚赖氨酸产生菌新菌株的筛选和产物结构鉴定

通过对Nishikawa的方法进行改进,在广东各地土样中筛选到一株产量为0.846 g/L的新ε-聚赖氨酸(ε-PL)产生菌株,命名为Str-8。对Str-8菌株进行形态、生理生化和16S rDNA分析,初步确定为不吸水链霉菌Streptomyces ahygroscopic。纯化的发酵产物通过水解、质谱、紫外光谱等性质确定为ε-PL。     

聚-ε-赖氨酸补料发酵的初步研究

在5L自动发酵罐中,通过分批发酵和补料分批发酵,对白色链霉菌(Strepomyces albulus)生物合成聚-ε-赖氨酸(ε-PL)进行了初步研究。结果表明,在分批发酵中,利用pH控制策略,ε-PL产量从0.6 g/L提高到2.4 g/L。在分批补料发酵中,采用pH控制策略,当糖浓度在10g/L以下,补加葡萄糖和硫酸铵,则菌体大量生长,ε-PL产量提高到16.81 g/L,为分批培养的27倍。     

Breeding of ε-poly-L-lysine producing strain using succinic acid as sole carbon source

本文旨在通过诱变和耐受性筛选的手段提高放线菌ε-PL的产量.以稠李链霉菌Streptomyces padanus LS-L5为出发菌,经紫外诱变,在以琥珀酸为唯一碳源的培养基上筛选快速生长的菌株,测定突变株的ε-PL发酵水平和遗传稳定性.经初筛和复筛,获得突变株H3,其摇瓶发酵ε-PL产量为0.68 g/L,较出发菌提高了41％,传代4次产量基本稳定.H3在5L发酵罐中分批发酵,ε-PL产量达到2.0 g/L,较出发菌提高了一倍.在固定二氧化碳的能力方面,突变株H3的PEP羧化酶酶活较出发菌株LSL5的PEP羧化酶酶活提高了1.67倍.     

氧载体对小白链霉菌发酵生产ε-聚赖氨酸的影响

为了有效改善发酵体系中的溶氧水平,提高小白链霉菌Streptomyces albulus PD-1发酵生产ε-聚赖氨酸的能力,文中通过对氧载体的种类、最佳添加浓度以及添加时间进行筛选,最终确定在0 h添加0.5%(V/V)的正十二烷促进ε-聚赖氨酸生产效果最佳。在5 L发酵罐0 h添加0.5%的正十二烷进行批次补料发酵,ε-聚赖氨酸的产量和菌体干重分别可以达到(30.8±0.46)g/L和(33.8±0.29)g/L,较之对照组分别提高了31.6%和20.7%。ε-聚赖氨酸的产量和菌体干重的提高归因于0.5%正十二烷的添加促进发酵液中溶氧水平从23.8%提高到32%,同时发酵液中的一种主要副产物(聚二氨基丙酸)的含量下降31%。实验结果表明,正十二烷的添加可以提高S.albulus PD-1发酵液中的溶氧水平,抑制副产物的生成,促进ε-聚赖氨酸的合成。     

以琥珀酸为唯一碳源选育ε-聚赖氨酸高产菌

本文旨在通过诱变和耐受性筛选的手段提高放线茵￡一PL的产量。以稠李链霉菌Strepto—myces padanus LS-L5为出发菌,经紫外诱变,在以琥珀酸为唯一碳源的培养基上筛选快速生长的菌株,测定突变株的ε-PL发酵水平和遗传稳定性。经初筛和复筛,获得突变株H3,其摇瓶发酵ε-PL产量为0．68dL,较出发菌提高了41％,传代4次产量基本稳定。H3在5L发酵罐中分批发酵,ε-PL产量达到2．0g／L,较出发菌提高了一倍。在固定二氧化碳的能力方面,突变株H3的PEP羧化酶酶活较出发菌株LS-L5的PEP羧化酶酶活提高了1．67倍。     

ε-聚赖氨酸产生菌TUST-2的分离鉴定

【目的】ε-聚赖氨酸是一种天然氨基酸同聚物,本研究目的为分离筛选新的ε-聚赖氨酸产生菌。【方法】采用一种新的分离方法从土壤中分离ε-PL产生菌。分离方法含3步:(1)富集培养ε-PL耐受菌;(2)通过改进的Nishikawa方法筛选;(3)挑选高浓度ε-PL耐受菌株。【结果】从海南省土样中分离获得ε-聚赖氨酸产生菌TUST-2。分类和形态特征属链霉菌属。16S rDNA序列分析比对结果表明TUST-2属淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)。经特征反应分析、水解物分析、红外光谱、1H NMR、13C NMR和MALDI-TOF-MS分析表明TUST-2发酵产物为ε-聚赖氨酸。【结论】根据16S rRNA基因序列比对和形态及生理生化特征表明ε-聚赖氨酸产生菌TUST-2属于淀粉酶产色链霉菌,命名为淀粉酶产色链霉菌TUST-2。     

GFP基因在新疆小拟南芥和拟南芥中的表达分析

以质粒pMCB30为模板,扩增GFP基因,连接到载体pCMBIA2300-35S-OCS上,构建过量表达载体p35S:GFP,将其转入农杆菌GV3101.通过农杆菌介导法将p35S:GFP载体分别转入新疆特色植物小拟南芥和拟南芥中.T0代经含有卡那霉素的1/2MS培养基筛选,获得了T1代转基因小拟南芥2株,T1代转基因拟南芥9株.通过激光共聚焦显微镜观察,在转基因小拟南芥和拟南芥的根尖细胞中均可检测到GFP绿色荧光蛋白;对转基因植株进行PCR扩增,均可检测到GFP基因,表明GFP基因已成功转入小拟南芥和拟南芥中.该研究建立了小拟南芥的遗传转化体系,为进一步利用GFP基因和进一步研究小拟南芥的功能基因奠定基础.     

运用萎锈灵抗性基因构建香菇聚乙二醇介导的遗传转化方法

【背景】萎锈灵抗性基因作为筛选标记在植物和真菌中得到广泛应用。【目的】构建可以使用萎锈灵作为筛选标记的香菇遗传转化技术。【方法】利用溶壁酶消化培养4 d的香菇菌株411-4的菌丝体获得原生质体,加入适量pL-cbx质粒和聚乙二醇溶液,混合物涂布于再生筛选培养基上,培养后挑选菌落进行验证试验。【结果】在原生质体数目108个和添加4μg质粒DNA的情况下,得到了40个抗性转化子。利用PCR实验和转代实验对转化子进行验证,结果显示38个转化子的抗性可稳定遗传,表明萎锈灵抗性基因整合进入了供试菌株的基因组中。【结论】利用香菇411-4菌株建立了一套运用萎锈灵抗性基因作为分子标记的遗传转化技术体系。