SOX7基因启动子甲基化水平对乳腺癌MDA-MB-231细胞株体外迁移和侵袭的影响

目的:探讨乳腺癌MDA-MB-231细胞中,Y性别决定区基因7(SOX7)基因启动子甲基化水平对细胞的体外迁移和侵袭的影响。方法:脂质体转染pcDNA3.0-DNA甲基转移酶3a(DNMT3a)质粒至MDA-MB-231细胞中,并于24h、48h及72h后,采用蛋白质免疫印迹实验(WB)检测细胞内DNMT3a蛋白表达水平;甲基化特异性定量PCR(Q-MSP)检测DNMT3a处理组、5-aza-C处理组及对照(Control)组MDA-MB-231细胞中的SOX7基因启动子DNA甲基化水平;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及WB实验检测各组MDA-MB-231细胞中的SOX7 m RNA和蛋白表达水平;细胞划痕实验及细胞侵袭实验检测各组MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力。结果:pcDNA3.0-DNMT3a质粒转染MDA-MB-231细胞24h时,细胞内的DNMT3a蛋白表达水平最高。DNMT3a能够显著提高SOX7基因启动子DNA甲基化水平,而5-aza-C则抑制了SOX7基因启动子DNA甲基化水平(P0.05)。与Control组相比,DNMT3a处理组的MDA-MB-231细胞中,SOX7的m RNA及蛋白表达水平均明显下降,而5-aza-C处理组SOX7的m RNA及蛋白表达水平均明显增加(P0.05)。与Control组相比,DNMT3a处理组的MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力均显著增强(P0.05),而5-aza-C处理组的MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力变化不大(P0.05)。结论:在恶性肿瘤中,SOX7低表达表受其基因启动子高甲基化调节,且乳腺癌MDA-MB-231细胞中低表达的SOX7能够影响细胞的外迁移和侵袭能力。     

木犀草素通过抑制肝癌细胞Sp1活性上调抑癌基因OPCML表达

抑癌基因OPCML的甲基化失活是肿瘤发生的重要机制,因此采用药物逆转抑癌基因的失活状态是肿瘤防治的重要策略。研究表明,Luteolin可在一定程度上抑制DNA的甲基化转移酶(methyltransferase)的活性,但木犀草素是否能逆转OPCML的失活状态目前尚不明确。本研究通过体外培养肝癌细胞系HepG2,用不同浓度木犀草素处理后,采用实时定量PCR和Western blotting分别检测OPCML、DNMT1的m RNA和蛋白表达;甲基特异性PCR(MSP)和DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases)催化实验分析OPCML基因启动子区域甲基化及细胞核中甲基化活性;ELISA分析木犀草素处理前后对核转录因子Sp1活性的变化;RNA干扰及慢病毒转染等方法观察Sp1在介导甲基化及CPCML表达中的作用。最后建立裸鼠异种移植瘤动物模型,观察木犀草素对异种移植瘤生长的抑制作用。结果显示,Hep G2细胞基础状态下OPCML表达水平较低,其启动子区域甲基化水平较高,而经0~30μmol/L木犀草素处理后,能显著增强OPCML蛋白和m RNA的表达,并能降低其启动子甲基化水平以及细胞核中甲基化活性。同时,木犀草素也能抑制Hep G2细胞中Sp1的活性以及DNMT1的表达。si RNA干扰OPCML后,可逆转木犀草素对Hep G2细胞的生长抑制效应,上调细胞内Sp1表达后,同时伴有DNMT1表达增加及OPCML表达降低。此外,木犀草素也能上调裸鼠异种移植瘤中OPCML表达并抑制移植瘤生长的生长。以上结果表明木犀草素可能通过降低细胞内甲基化水平而上调OPCML基因表达,最终抑制Hep G2细胞生长增殖。     

焦磷酸测序法检测OCT4启动子在大鼠骨髓源性肝干细胞分化中的甲基化变化

骨髓间充质干细胞具有分化成为肝细胞的潜能已得到证实,但其分化的调控机理还不完全清楚。通过检测大鼠骨髓源性肝干细胞(rat bone marrow-derived liver stem cells,RBMLSCs)诱导分化为肝细胞过程中OCT4启动子甲基化的变化,来探讨启动子甲基化调控细胞分化的机制。RBMLSCs用25μg/L重组人肝细胞生长因子和0.1 nmol/L地塞米松进行诱导,在诱导之后不同时间点(0 d,7 d,14 d)提取细胞的DNA及RNA。用荧光定量PCR法检测白蛋白(albumin,Alb)和OCT4的m RNA表达水平,应用焦磷酸测序法定量检测OCT4基因的启动子中4个Cp G位点的甲基化变化。结果表明:在RBMLSCs分化过程中,Alb m RNA持续增高(P0.05),但OCT4 m RNA表达在7 d及14 d明显减少(P0.005);同时OCT4启动子上游的Cp G 1-2-3甲基化频率显著上升(P0.001),但Cp G 4甲基化无明显变化。这些结果说明OCT4启动子高甲基化可能导致其m RNA表达减少,RBMLSCs多能性消失,但Cp G 4并不参与这一分化调控过程。     

重组腺相关病毒介导的RNAi靶向治疗作用研究

目的:采用前期成功构建的靶向沉寂CDK2基因的重组腺相关病毒r AAV-sh RNA-CDK2转染人肝癌Hep G2细胞,研究其对人肝癌细胞增殖的抑制作用。方法:取人肝癌Hep G2细胞于裸鼠前肢腋下接种,构建裸鼠皮下移植瘤模型,将成瘤裸鼠随机分为三组:肿瘤组、NC对照组、r AAV-sh RNA-CDK2给药组。各试验组均通过尾静脉注射给药,每隔五天用游标卡尺测量肿瘤的长径(a)、短径(b),计算肿瘤体积。根据每组裸鼠移植瘤体积的平均值,绘制移植瘤生长曲线。于给药24 h后处死,称取瘤重,计算抑瘤率,应用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测各组肝癌组织中CDK2基因m RNA和蛋白的表达量,观察r AAV-sh RNA-CDK2对肝癌组织CDK2表达的影响;结果:r AAV-sh RNA-CDK2能够显著抑制肝癌Hep G2细胞的增殖,其抑瘤率为72.18%;并能够下调肝癌组织中CDK2基因m RNA与蛋白表达量;结论:r AAV-sh RNA-CDK2实现了体内靶向治疗肝癌的目的,并确定静脉定量给药方式。     

长链非编码RNA对HepG2 肝癌细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨长链非编码RNA RP13-514E23.1在肝癌细胞系中的表达,并观察上调该基因后其下游基因MAPK10的变化及对肝癌细胞Hep G2增殖、凋亡的影响。方法:通过荧光定量PCR(q RT-PCR)检测RP13-514E23.1在正常肝细胞与肝癌细胞系中的表达差异,进一步构建质粒转染肝癌Hep G2细胞上调RP13-514E23.1的表达,以Mock组(只加转染试剂)和NC组(转染空载体pc DNA3.1-NC)作为对照评估转染效率及对MAPK10表达的影响。用CCK-8实验和流式细胞术检测转染前后Hep G2细胞的增殖、凋亡的变化。结果:Lnc RNA RP13-514E23.1在大部分肝癌细胞系(Hep G2,SMMC,Huh7,Hep3B)中的表达明显低于正常肝细胞(0.58±0.05 vs 1.00,P0.05);转染pc DNA-RP13-514E23.1后,q RT-PCR检测Hep G2细胞的RP13-514E23.1和MAPK10m RNA表达量显著升高(分别为29.90±1.40、2.42±0.25,P0.05),western blot检测MAPK10蛋白表达量较对照组也升高(2.10±0.16,P0.05);CCK-8结果显示Hep G2细胞在各个时间段增殖均受到抑制(P0.01),Mock组、NC组和实验组的凋亡率分别为(5.53±1.17)%、(6.40±2.84)%和(46.87±3.45)%(P0.01)。结论:Lnc RNA RP13-514E23.1在肝癌细胞系中表达异常降低,上调其表达后MAPK10的表达升高,且Hep G2细胞增殖受到抑制、凋亡增加。     

阿霉素诱导下的肝癌细胞HepG2中微小RNA差异表达分析

旨在研究阿霉素诱导引起的DNA损伤压力下,肝癌细胞Hep G2中参与DNA损伤应答的mi RNA,并分析这些mi RNA靶基因参与肝癌DNA损伤应答相关的生物学进程与通路。通过小RNA测序检测阿霉素处理肝癌细胞Hep G2前后mi RNA的差异表达情况,使用GO与KEGG通路富集方法对差异表达mi RNA靶基因进行功能富集分析。结果显示,共检测出显著表达差异mi RNA 68个,其中上调13个,下调55个。mi RNA靶基因的功能分析结果显示,53条mi RNAs靶基因显著富集于调控细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移和细胞周期等与DNA损伤应答以及肿瘤相关的生物进程和信号通路,包括p53信号通路、癌症通路、Wnt信号通路和MAPK信号通路等。研究表明,在阿霉素诱导下,Hep G2中的差异表达mi RNAs与DNA损伤相关的肿瘤生物学进程以及信号通路显著相关,预示这些mi RNAs在阿霉素引发的肝细胞癌DNA损伤应答中起着重要的作用。     

甲基转移酶对鼻咽癌细胞中DLC-1基因表达的影响

肝癌缺失基因-1(deleted in liver cancer-1,DLC-1)在多种肿瘤中呈现表达缺失或表达下调,这种异常表达主要与由DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)参与的启动子区异常甲基化有关。RT-PCR结果显示DLC-1在永生化鼻咽上皮细胞NP69和干扰DNMTs的5-8F细胞中的表达水平较未干扰的鼻咽癌细胞明显升高。甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSPCR)结果则表明DLC-1启动子区在表达下调或缺失的鼻咽癌细胞中均存在异常高甲基化,而干扰DNMTs后5-8F细胞中DLC-1启动子区甲基化状态被逆转,其中特异性干扰DNMT1后效果略为显著,提示DNA甲基转移酶活性对于鼻咽癌中DLC-1启动子区甲基化水平具有重要的调控作用,而DNMT1的调控作用更为突出。     

紫檀芪对人肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响

为了探讨紫檀芪(PTE)对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制,肝癌细胞系Hep G2被选择作为研究对象,并对紫檀芪与其的作用进行了不同角度的研究。MTT法被用来检测不同浓度紫檀芪对Hep G2细胞活力的影响;倒置显微镜和流式细胞术检测紫檀芪处理后Hep G2细胞的凋亡情况;实时定量PCR和Western blot分别检测紫檀芪处理后Bax、Bcl-2、Fas、Cycs(细胞色素C)和Caspase3基因m RNA和蛋白表达情况。结果显示紫檀芪对Hep G2细胞增殖有很强的抑制作用,在最佳条件下,抑制率为(40.85±2.55)%。形态学观察发现紫檀芪作用后的细胞呈明显凋亡状态,凋亡率为(15.61±0.71)%,出现细胞周期阻滞现象。进一步的研究表明,经紫檀芪处理后,Hep G2细胞的线粒体膜电位明显下降(p0.01),Bcl-2的表达增强,Bax、Fas、Cycs和Caspase3的表达明显降低(p0.05)。这些实验事实暗示紫檀芪能够抑制Hep G2细胞增殖并促进其发生凋亡,其机制可能是通过上调Bax、Fas、Cycs和Caspase3基因,下调Bcl-2基因来实现的。     

MFN1在肝癌转移中的调控作用研究

目的:探讨线粒体融合蛋白MFN1(mito-fusion 1)在肝癌转移中的作用及其机制。方法:1).采用免疫组化实验检测15对肝癌转移灶组织与原发灶组织中MFN1的表达,以明确肝癌转移时是否伴有MFN1表达的改变。2).采用si RNA (small interference RNA)下调肝癌细胞中MFN1的表达后,提高Transwell迁移实验和Transwell侵袭实验分别检测其迁移和侵袭能力,通过实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)和Western blot实验分别检测基质金属蛋白酶1 (matrix metalloproteinase 1,MMP1)、MMP2、MMP7及MMP9的m RNA和蛋白表达。结果:1)肝癌转移灶组织中MFN1表达显著低于原发灶组织(P0.05)。2).下调MFN1表达后,肝癌细胞的迁移和侵袭能力显著升高,MMP7的表达显著增加,而MMP1、MMP2与MMP9的表达无明显变化。结论:线粒体融合蛋白MFN1在肝癌转移组织中表达显著降低,可能通过激活MMP7表达,促进肝癌细胞侵袭和转移。     

5''-Aza-CdR 对B细胞淋巴瘤的抑制作用及对瘤细胞CHFR 表达和甲基化的影响

目的:探讨5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5'-Aza-Cd R)对人伯基特淋巴瘤Raji裸鼠移植瘤的抑制作用,以及对瘤组织中CHFR表达和甲基化的影响。方法:1皮下接种Raji细胞悬液构建荷瘤裸鼠模型18只,并随机分为实验组和对照组,分别予腹腔内注射等体积的5'-Aza-Cd R(1μg/g)及生理盐水,计算肿瘤体积大小,绘制肿瘤生长曲线,24天后比较两组移植瘤体积大小和重量。2分别从移植瘤组织中提取DNA及RNA,应用实时荧光定量PCR检测CHFR m RNA的表达,甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测CHFR基因甲基化情况。结果:1实验组移植瘤生长速度较缓慢。实验结束时,实验组移植瘤体积、重量与对照组相比,差异有显著统计学意义(P0.01)。2实验组瘤细胞中CHFR m RNA的表达水平(3.69±1.20)与对照组(1.04±0.30)相比,差异有显著统计学意义(t=3.94,P0.001)。3实验组中的甲基化条带与对照组相比明显变暗,同时出现非甲基化条带,对照组中CHFR基因启动子只有甲基化条带被扩增。结论:5'-Aza-Cd R能抑制人伯基特淋巴瘤的生长,诱导瘤细胞CHFR m RNA表达增加,其机制可能为5'-Aza-Cd R使甲基化的CHFR启动子发生去甲基化。     

短发夹RNA慢病毒载体稳定抑制NLRP3表达的HepG2细胞的构建

目的:构建针对NLRP3基因的短发夹RNA(sh RNA)慢病毒表达载体,在Hep G2细胞中鉴定该载体对NLRP3的抑制效果。方法:设计针对NLRP3基因的sh RNA序列,将其插入慢病毒表达载体p WPT-U6-sh RNA-CMV-GFP中,将载体与包装质粒ps PAX2、p MD2.G共转染293T细胞,进行病毒包装;得到的病毒原液浓缩后系列稀释为9个浓度递减的病毒液,分别转染293T细胞后进行滴度测定;用获得的慢病毒液感染人肝癌细胞系Hep G2,获得稳定沉默NLRP3的细胞株;利用实时定量PCR和Western印迹检测稳定细胞株中NLRP3的沉默效应。结果:构建了具有沉默效应的慢病毒干扰载体;稀释法测定干扰病毒滴度为2×108TU/m L;实时定量PCR和Western印迹实验均证实慢病毒转染后,细胞株中NLRP3表达水平明显降低。结论:构建了人NLRP3基因特异性慢病毒干扰载体,获得NLRP3基因稳定干扰的Hep G2细胞株。     

PNPLA3在实验性非酒精性脂肪性肝病中的表达及其CpG岛甲基化状态的研究

目的:探讨PNPLA3在非酒精性脂肪性肝病中的表达水平及其Cp G岛甲基化状态,探讨PNPLA3在NAFLD发生、发展中的作用。方法:1.采用10μg/m L的油酸作用于人正常肝细胞株L02建立脂肪肝细胞模型,72 h后经油红O染色,观察正常组、脂肪肝模型组及给药组细胞内脂滴形成情况,并用荧光定量PCR检测PNPLA3在三组肝细胞中的表达情况。2.采用专用DNA提取试剂盒分别提取正常组、脂肪肝模型组、给药组细胞中DNA,经亚硫酸转化后行PCR扩增目的基因,并用焦磷酸测序方法检测不同组PNPLA3 Cp G岛中甲基化水平,探讨其在非酒精性脂肪肝中的作用。结果:1、脂肪肝模型组肝细胞PNPLA3 m RNA的表达高于正常组,经姜黄素给药后,其表达降低,差异均有统计学意义(P0.05)。2、在PNPLA3启动子区6个检测位点中,脂肪肝组位点2甲基化水平高于正常组,姜黄素给药后甲基化水平降低,差异均有统计学意义(P0.05),在其余各检测位点中甲基化水平无差异。结论:1、油红O染色后,脂肪肝模型组细胞内发现有大量红色脂滴积聚,而正常组基本上未见脂滴,姜黄素给药组脂滴较模型组减少,表明用10μg/m L的油酸诱导能成功建立体外肝细胞模型。2、PNPLA3 m RNA在肝细胞中高表达及其启动子区甲基化状态异常参与非酒精性脂肪肝发病。3、抑制肝脏PNPLA3活性或降低肝细胞PNPLA3 m RNA的表达水平可能是今后治疗非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的一个新的治疗方法。     

CRY2分子对肝癌细胞生长和转移的影响

目的:探讨节律分子CRY2(cryptochrome circadian clock 2)在肝细胞肝癌(HCC)中的表达和对肝癌细胞生长、转移的影响。方法:利用免疫组织化学染色法,分析65例HCC组织中CRY2分子的表达;利用233例HCC公共数据验证CRY2分子在HCC组织中的表达变化;实时定量PCR和Western blot检测肝癌细胞中CRY2的表达。MTS法和Transwell法,分别检测CRY2对肝癌细胞生长和转移的影响。结果:对照组CRY2阳性率为87.7%(57/65),而在肝癌组织中49.2%(32/65)CRY2阳性,CRY2在HCC组织中的表达显著低于对照组,差异有统计学意义(t=10.61,P0.0001)。233例HCC公共数据(GSE14520)中,癌组织CRY2表达显著下调,差异具有统计学意义(6.663 vs 6.160,P0.0001)。4株肝癌细胞株中CRY2表达与正常肝细胞株相比,CRY2表达同样显著下调。在肝癌SMMC-7721和Hep 3B细胞中,与对照组比,过表达CRY2组细胞生长能力显著降低,差异有统计学意义(SMMC-7721:0.899 vs 0.473,P0.0001;Hep 3B:0.785 vs 0.435,P0.0001)。在肝癌SMMC-7721和Hep 3B细胞中,过表达CRY2组细胞侵袭能力显著降低(SMMC-7721:侵袭细胞数216.33 vs 62.33,P=0.001;Hep 3B:侵袭细胞数169.67 vs 52.33,P=0.015);结论:CRY2分子在HCC中表达下调,同时高表达CRY2会抑制肝癌细胞生长和转移。     

DLC-1 基因在MCF-7 人乳腺癌细胞系中低表达的机制探究

目的:探究DLC-1基因在MCF-7人乳腺癌细胞系中低表达的机制。方法:应用甲基化特异性PCR(MSP)检测人乳腺癌细胞MCF-7的DLC-1基因甲基化状态,不同浓度的5-氮杂-2’-脱氧胞嘧啶(5-Aza-CdR)处理人乳腺癌细胞MCF-7,RT-PCR及Real-time PCR定量检测用药前后细胞中DLC-1基因mRNA表达水平变化。结果:DLC-1基因启动子区CpG岛呈甲基化状态,经过5-Aza-CdR处理后,DLC-1基因启动子区呈去甲基化状态,并且其mRNA恢复表达。结论:抑癌基因DLC-1 CpG岛甲基化是导致该基因低表达的原因之一,5-Aza-CdR能逆转DLC-1基因甲基化状态。     

人肝癌细胞LASP1 启动子的克隆及其核心调控区域的初步鉴定

目的:克隆人肝癌细胞的LASP1基因的启动子区域并找出该基因启动子的核心调控区域。方法:提取肝癌Hep G2细胞总DNA,PCR扩增不同长度的LASP1启动子片段,克隆至PGL3-Basic载体中构建重组表达载体PGL3-P1(2059 bp)、PGL3-P2(1123bp)、PGL3-P3(909 bp)、PGL3-P4(574 bp)和PGL3-P5(159 bp),转化入大肠埃希菌(E.coli)DH5α中,提取质粒经双酶切、PCR及测序鉴定阳性克隆并测序。将构建的重组表达载体、PGL3-Basic载体分别与内参质粒PRL-Tk共转染Hep G2细胞,48 h后经双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测其活性。结果:PCR结果、双酶切结果以及DNA测序结果表明成功构建了LASP1启动子荧光素酶报告基因载体;双荧光素酶报告基因检测结果显示,与PGL3-Basic组相比,重组载体PGL3-P1、PGL3-P2、PGL3-P3、PGL3-P4均具有较强的启动子活性(P0.01),其中,PGL3-P4的活性最强。结论:成功构建了人肝癌细胞不同截断长度的LASP1基因启动子荧光素酶报告基因载体,确定了LASP-1基因启动子的核心区域(-581 bp~-8 bp),为进一步研究LASP1基因在肝癌细胞中表达的关键调节因素及分子机制奠定了基础。     

Fibulin3基因在非小细胞肺癌中的蛋白表达及甲基化检测

目的:检测Fibulin3基因在非小细胞肺癌患者(non-small cell hung cancer,NSCLC)组织中的表达和甲基化状态,并分析其临床病理意义.方法:收集59例NSCLC患者术后病理蜡块,进行免疫组化染色;提取癌组织及相应癌旁组织DNA,甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测Fibulin3基因启动子区甲基化情况.结果:59例NSCLC标本中,25例(42.4%)Fibulin3表达水平比相应癌旁组织下调(P＜0.05);癌组织和相应癌旁组织甲基化22例和5例检出Fibulin3基因启动子区高甲基化,其阳性率分别为37.3%和8.5%,差异具有统计学意义(P＜0.001);Fibulin3启动子甲基化导致蛋白表达下调或缺失(P＜0.001),并与临床分期(P=0.035)及淋巴结转移(P=0.011)相关.结论:启动子甲基化引起的Fibulin3基因失活在NSCLC发生发展中起重要作用,Fibulin3启动子甲基化可能成为NSCLC早期诊断和预后评估的潜在标记物.     

HepG2细胞中TNFα通过NF-κB信号通路下调GSTA1/GSTA4表达（英文）

谷胱甘肽巯基转移酶α1/α4(GSTA1/A4)是体内重要的解毒酶,可降低多种内、外源性毒性化合物的毒性.然而,胆汁淤积病人肝细胞内G STA1/A4的表达是下调的,下调机制尚不清楚.本研究通过肿瘤坏死因子α(TNFα)处理人肝癌细胞Hep G2细胞,利用实时荧光定量聚合酶链式反应(q PCR)和蛋白质印迹(Western blot)检测GSTA1/A4、核因子κB(NF-κB)和核因子E2相关因子2(Nrf2)的表达.发现TNFα在m RNA水平和蛋白质水平均抑制GSTA1/A4表达,且呈剂量与时间依赖关系.干扰NF-κB信号通路,可减弱T NFα对G STA1/A4表达的抑制作用.以上结果表明,在Hep G2细胞中,TNFα可通过激活N F-κB信号通路抑制G STA1/A4表达.     

DLC-1基因在MCF-7人乳腺癌细胞系中低表达的机制探究

目的：探究DLC-1基因在MCF-7人乳腺癌细胞系中低表达的机制。方法：应用甲基化特异性PCR（MSP）检测人乳腺癌细胞MCF-7的DLC-1基因甲基化状态,不同浓度的5-氮杂-2＇-脱氧胞嘧啶（5-Aza-CdR）处理人乳腺癌细胞MCF-7,RT-PCR及Real-time PCR定量检测用药前后细胞中DLC-1基因mRNA表达水平变化。结果：DLC-1基因启动子区CpG岛呈甲基化状态,经过5-Aza-CdR处理后,DLC-1基因启动子区呈去甲基化状态,并且其mRNA恢复表达。结论：抑癌基因DLC-1 CpG岛甲基化是导致该基因低表达的原因之一,5-Aza-CdR能逆转DLC-1基因甲基化状态。