双碳源流加对重组毕赤酵母高效表达葡萄糖氧化酶的影响

葡萄糖氧化酶(GOD)是一种具有广泛应用前景的工业酶.为了实现葡萄糖氧化酶的高效生产,提高重组毕赤酵母生产GOD的产量和增强生产强度,对重组毕赤酵母诱导阶段的初始菌体浓度和甲醇浓度进行了优化.在此基础上,诱导期采用了双碳源(甘油、山梨醇和甘露醇)与甲醇混合流加的模式.研究发现,最佳诱导前初始菌体浓度和甲醇浓度分别为100 g/L和18 g/L,此时GOD产量为427.6 U/mL.在诱导阶段采用甘油、山梨醇和甘露醇与甲醇的混合添加均可以提高GOD产量,其中甘露醇与甲醇的混合流加效果最为显著.当甲醇与甘露醇混合流加的比例为20∶1(W/W)时,诱导156h GOD产量和生产强度分别可达711.3 U/mL和4.60 U/(mL·h),比甲醇单一流加策略结果分别提高了66.3％和67.9％.此外采用合适的甘露醇混合流加策略不但不会抑制AOX1启动子的表达,甚至有一定促进作用,AOX酶活性为8.8 U/g(对照为5.2 U/g).双碳源流加方式还能推广到毕赤酵母其他表型中,为该系统高效表达外源蛋白提供一种新策略.     

超耐热酸性α-淀粉酶基因在多型汉逊酵母中表达及与在毕赤酵母中表达的比较研究

利用毕赤酵母的质粒载体pPIC9K将极端耐热古菌Pyrococcusfuriosus的超耐热酸性α-淀粉酶(Amy)基因转化到多型汉逊酵母HP-6中,获得重组汉逊酵母。经过甲醇进行诱导,表达产物的酶活性检测和SDS-PAGE电泳,证明α-淀粉酶(Amy)在多型汉逊酵母中利用AOX1启动子和α-因子信号肽有效表达并分泌到胞外。该酶的最适反应温度为90～100℃,最适作用pH为4.0～5.0,较之重组毕赤酵母的最适作用pH还低0.5。此外与毕赤酵母的重组蛋白相比,重组汉逊酵母α-淀粉酶不仅菌株筛选简便、周期短,而且具有更容易筛选到高拷贝转化子以及适用于大规模工业发酵等优点。     

重组巴斯德毕赤酵母发酵生产内切几丁质酶的培养条件优化

探讨重组巴斯德毕赤酵母发酵生产内切几丁质酶的最适培养条件,以期获得最佳的内切几丁质酶活力。以内切几丁质酶活力为指标,通过部分因子试验设计以及响应面法优化确定重组巴斯德毕赤酵母高产内切几丁质酶的最适培养条件。部分因子试验设计筛选的影响重组巴斯德毕赤酵母高产内切几丁质酶的3个关键因子为甲醇、油酸和吐温-80。响应面法优化的上述3个关键因子的最佳浓度分别为0.71%、0.086%和0.31%。重组巴斯德毕赤酵母发酵生产内切几丁质酶的最适培养条件为：酵母膏1%、酵母氮碱（YNB）1.34%、蛋白胨2%、甲醇0.71%、油酸0.086%、吐温-80 0.31%、PTM₁ 0.8%、pH 6.0。在上述培养条件下,重组巴斯德毕赤酵母产内切几丁质酶的活力高达30.92U/mL。与未优化前相比,酶活力提高了1.44倍。研究结果为内切几丁质酶的产业化生产和应用奠定了良好基础。     

平菇漆酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及酶学性质研究

采用RTPCR技术克隆到一个平菇(Pleurotusostreatus)漆酶基因的全长cDNA,命名为lccPo1,其序列提交GenBank,登录号为AY450404。将其ORF克隆到毕赤酵母表达载体pHBM906,转化3株毕赤酵母GS115、KM71和SMD1168,该漆酶基因在3种毕赤酵母菌株中均实现了分泌表达。3种摇瓶培养条件①25℃,1.0%(VV)甲醇;②20℃,1.0%(VV)甲醇;③20℃,0.5%(VV)甲醇,进行比较研究后发现适当提高甲醇浓度有利于漆酶在低温条件下表达,而降低培养温度到20℃则可以提高漆酶的产量2～6倍。3株重组毕赤酵母在其最适反应条件下测得三者粗酶液最高漆酶酶活分别为3.19UmL[GS115(pHBM565)]、2.56UmL[KM71(pHBM565)]和2.49UmL[SMD1168(pHBM565)]。对重组酶进行相关的酶学性质分析表明,三者的最适反应pH值约为4.2,最适反应温度约为60℃。重组毕赤酵母GS115(pHBM565)所产酶的热稳定性稍好,在pH稳定性方面三者没有太大差异。     

用GAP启动子在Pichia pastoris GS115中组成型表达鼠灰链霉菌腺苷酸脱氨酶

【目的】构建产AMP脱氨酶的重组毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)菌株,并初步优化其发酵条件。【方法】以鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)基因组为模板PCR扩增获得腺苷酸脱氨酶基因AMPD,以pGAP9K为载体构建重组表达质粒pGAP9K-AMPD并通过电转化法转入Pichia pastoris GS115,筛选转化子对其酶活进行测定,并初步优化其发酵条件。【结果】构建了毕赤酵母重组菌,通过分光光度法测定,显示重组菌有明显的酶活;初步优化发酵条件为:该重组菌最适发酵培养基为:甘油2%,蛋白胨2%,酵母膏1%,KH2PO40.5%,MgSO4·7H2O0.05%,pH 6.0;发酵条件为:接种龄24 h,转接量3%,30°C﹑200 r/min培养96 h,取发酵上清液测定酶活,重组菌腺苷酸脱氨酶酶活达到2 230±60 U/mL。【结论】构建了一株产AMP脱氨酶活性较高的重组毕赤酵母菌株,并通过优化发酵条件使其酶活达到2 230±60 U/mL。为AMP脱氨酶工业化生产奠定了一定的基础。     

枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达

目的:研制高效分泌表达枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶的毕赤酵母基因工程菌株。方法与结果:将优化设计的枯草芽孢杆菌MA139β-甘露聚糖酶基因用EcoRⅠ/XbaⅠ双酶切,克隆到诱导型表达载体pPICzαA中α因子信号肽编码序列的下游,转化大肠杆菌筛选重组质粒,转化毕赤酵母X-33感受态细胞,经Zeocin筛选,获得重组表达菌株X-33/mann。将重组菌株在10L全自动发酵罐中进行高密度发酵培养,甲醇诱导72h发酵活力达到2100U/mL。重组甘露聚糖酶的最适催化温度为40℃,最适催化pH值为6.0。结论:枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中获得了高效分泌表达,具有开发作为饲料添加剂的潜能。     

嗜热棉毛菌木糖苷酶Xyl43基因优化及其在毕赤酵母中高效表达

【目的】通过外源表达手段构建重组毕赤酵母实现木糖苷酶的高效表达。【方法】基于毕赤酵母密码子偏好性优化嗜热棉毛菌β-木糖苷酶(Xyl43)基因密码子,将其导入毕赤酵母GS115中实现分泌表达,并对重组木糖苷酶酶学性质进行分析。通过单因素实验优化高产菌株的摇瓶发酵条件,并在5 L发酵罐中进行扩大培养。【结果】Xyl43基因优化后的序列中222个碱基发生改变,G+C含量由52.8%降低到44.6%,序列一致性为78.17%;将构建的表达载体p PIC9K-Opt Xyl43电击转入毕赤酵母中,利用平板初筛和摇瓶复筛获得一株高效表达重组菌(命名为P.pastoris GS115-Xyl43);其所产重组木糖苷酶大小为51.5 k D,动力学参数Km为2.93 mmol/L、Vmax为157.9μmol/(min·mg),最适反应温度55°C,最适p H 7.0,在p H 6.0-9.5条件下具有良好的稳定性;摇瓶优化结果表明:培养基初始p H 6.0、甲醇补加浓度1.0%、培养温度28°C、摇床转速250 r/min为最佳产酶条件,在此条件下发酵144 h胞外酶活达到42 U/m L(蛋白含量0.54 g/L);5 L发酵罐放大培养,发酵156 h(甲醇诱导96 h),木糖苷酶酶活为222.2 U/m L,蛋白含量2.36 g/L,较摇瓶提高了4.3倍。【结论】木糖苷酶在毕赤酵母中实现了高效表达,具有较好的工业化应用前景。     

酸性木聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的分泌表达

运用“鸟枪法”克隆构建了环境微生物的基因组文库,并从中筛选得到一个酸性木聚糖酶基因,命名为xyl3,其在GenBank中的登录号为gb：AY300805。BLAST分析表明,该基因的序列同源性很低,其中仅存在很短的木聚糖酶基因的同源片段,其编码的木聚糖酶属于Glycosyl hydrolases family 10,与来源于Geobacillus stearothermophilus的intra—cellular xylanase在氨基酸水平具77％同源性。该基因经T4 DNA polymerase处理后,克隆至经限制性内切酶CpoⅠ和NotⅠ双酶切后的毕赤酵母表达载体pHBM905,获得重组质粒pHBM706。此重组质粒转化毕赤酵母GS115,经含有交联木聚糖的选择性培养平板和PCR扩增鉴定筛选得到重组毕赤酵母GS115（pHBM706）。以0．5％甲醇于28℃诱导产酶,测得重组毕赤酵母GS115（pHBM706）在诱导的第36h产酶达最高值,所产粗酶液酶活为0．177IU／mL。该酶的最适反应pH为5．5,最适反应温度为50℃。     

黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶基因在甲醇毕赤酵母中的表达

将编码黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶(lip)的cDNA克隆到酵母整合型质粒pMETA上,电转化Ade缺陷型甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)PMAD16,通过MD平板及PCR方法筛选和鉴定重组子。重组子发酵液经SDSPAGE分析和木质素过氧化物酶活力测定等方法鉴定,表明带自身信号肽的黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶基因(lip)在甲醇毕赤酵母中得到表达。优化其发酵培养条件,以藜芦醇为底物进行酶活测定,其酶活可达932U/L。相应发酵指数为12.94U/h·L。比出发菌株提高了24.18%。     

短小芽孢杆菌木聚糖酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及酶学性质研究

将短小芽孢杆菌HB030的内切-1,4-木聚糖酶基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9k上,得到重组质粒pHBM220,将pHBM220经酶切后分别转化三株毕赤酵母KM71、GS115、SMD1168,该木聚糖酶基因在三株毕赤酵母中均实现了分泌表达。将重组毕赤酵母KM71(pHBM220)、GS115(pHBM220)、SMD1168(pHBM220)分别诱导产酶,对重组酶进行相关的酶学性质分析表明,三者的最适反应pH值约为5.5,最适反应温度约为60℃。在其最适反应条件下测得三者粗酶液酶活分别为10.80IU/mL,11.63IU/mL,9.68IU/mL。重组毕赤酵母KM71(pHBM220)所产酶的热稳定性较好,而在pH稳定性方面三者没有太大的差异。     

商陆抗病毒蛋白重组子筛选及发酵条件初探

目的：筛选体外高表达商陆抗病毒蛋白的毕赤酵母重组菌株,并摸索其适合的发酵条件。方法：通过电击转化将含有商陆抗病毒蛋白（pokeweed antiviral proteins,PAP）基因的分泌型表达载体PIC9K-P导入到毕赤酵母（Pachia pastoris）GS115菌株中。利用免疫印迹法筛选表达量较高的转化子。在摇瓶发酵水平对重组菌株产PAP条件进行初步研究。结果：高表达PAP的重组菌株在发酵时间为96h,10g/L的甲醇浓度,培养基pH值为6.0～6.4时PAP的表达量较高。结论：免疫印迹法适合用于毕赤酵母高表达重组菌株的筛选,重组毕赤酵母的PAP表达量可高达30mg/L。     

短小芽孢杆菌木聚糖酶基因在毕赤酶母中的分泌表达及酶学性质研究

将短小芽孢杆菌HB030的内切-1,4-木聚糖酶基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K,得到重组质粒pH-BM220,将pHBM220经酶切后分别转化三株毕赤酵母KM71、GS115、SMD1168,该木聚糖酶基因在三株毕赤酵母中均实现了分泌表达,将重组毕赤酵母KM71（pHBM220）,GS115（pHBM220),GS115(pHBM220),SMD1168（pHBM220）分别诱导产酶,对重组酶进行相关的酶学性质分析表明,三的最适反应pH值约为5.5,最适反应温度约为60℃,在其最适反应条件下测得三粗酶液酶活分别为10.80IU/mL,11.63IU/mL,9.68IU/mL,重组毕赤酵母KM71（pHBM220）所产酶的热稳定性较好,而在pH稳定性方面三没有太大的差异。     

疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶在毕赤酵母中的表面展示及酶学性质

【目的】构建疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase,TLL)在毕赤酵母GS115中的细胞表面展示体系,筛选展示成功且酶活力及展示率较高的重组子作为全细胞催化剂,并研究其酶学性质。【方法】克隆TLL基因tll,以酿酒酵母细胞壁蛋白Sed1p为锚定蛋白,构建表面展示载体pPICZαA-TLS。重组载体经SacⅠ线性化后转入毕赤酵母GS115中,经三丁酸甘油酯平板检测及摇甁发酵筛选获得高酶活力的毕赤酵母重组子,采用抗FLAG标签一抗和R-PE荧光素标记的二抗处理细胞后,进行荧光显微镜检测和流式细胞仪分析,并考察全细胞催化剂的最适反应温度和pH、金属离子耐受性等酶学性质。【结果】成功构建TLL毕赤酵母细胞表面展示体系,筛选到1株具有三丁酸甘油酯和橄榄油水解活力的克隆子,经1%的甲醇诱导发酵120 h后,水解橄榄油酶活力达257.8 U/g干细胞。经抗体处理后的重组菌发酵细胞在荧光显微镜下呈现强烈的红色荧光,流式细胞仪分析结果也证实脂肪酶被成功展示在酵母细胞表面,展示率达98.36%。展示的TLL作为全细胞催化剂水解对硝基苯酚丁酸酯(pNPB)的最适温度为30℃,最适pH为8.0,且具备良好的热稳定性和有机溶剂耐受性;K+、Ca2+、Mg2+对其有微弱的激活作用,Mn2+、Ni2+则有微弱的抑制作用,Cu2+的抑制作用较强,而EDTA、SDS、Tween 20对酶活力影响不明显。【结论】首次将TLL脂肪酶成功展示在毕赤酵母细胞表面,获得具有较高水解活力和良好酶学特性的全细胞催化剂,为表面展示TLL脂肪酶的规模化应用奠定了技术基础。     

碱性果胶酶在重组毕赤酵母中高效表达的关键因素研究

为提高重组毕赤酵母生产碱性果胶酶的产量和生产强度,在摇瓶条件下优化了重组毕赤酵母生产碱性果胶酶的关键因素。结果表明,以下条件：初始甘油浓度40g／L、初始甲醇浓度3.1g甲醇／gDCW、每24h添加0.51g甲醇／gDCW、诱导表达周期72h、250mL三角瓶诱导培养基装液量30mL、初始pH6,0,最适于菌体生长与产物表达。在此基础上,7L罐上通过恒速流加甘油进一步提高细胞密度,诱导阶段甲醇采取前期恒速流加和后期DO-stat,发酵结束菌体干重达80g／L,酶活为217U／mL,比摇瓶结果提高了66.2％。     

里氏木霉Cel5A基因优化及其在毕赤酵母中的高效表达

内切纤维素酶Cel5A缺乏是限制纤维素酶制剂高效酶解天然纤维素的关键因素。本文尝试构建高效表达里氏木霉Cel5A的毕赤酵母重组菌株以弥补目前Cel5A的天然分泌不足,通过基因密码子偏好性优化里氏木霉Cel5A基因和构建表达载体p PIC9K-eg2,并将其电转入毕赤酵母GS115以构建重组子,利用浓度梯度平板和摇瓶发酵筛选获得一株高产毕赤酵母Pichia pastoris菌株GS115-EGⅡ。重组酶的酶学性质分析显示,该酶分子量50 k Da、最适p H(p H 4.5)略有降低及最适反应温度为60℃,专一性地作用于非结晶纤维素,与天然里氏木霉Cel5A并无明显区别。通过摇瓶发酵的初步优化,该菌摇瓶培养条件:培养温度28℃、起始p H 5.0、接种量2%、每24 h添加甲醇1.5%(V/V)、每24 h添加山梨醇4 g/L及吐温80添加4 g/L,发酵192 h重组酶酶活达到24.0 U/m L。进一步上罐(5 L)发酵180 h,该重组酶Cel5A酶活高达270.9 U/m L,蛋白含量达到4.16 g/L。重组毕赤酵母P.pastoris GS115-EGⅡ是一株适合于外源表达Cel5A的工程菌,该重组酶可替代天然分泌Cel5A适用于当前酶基生物炼制模式下木质纤维素基质高效水解中。     

碱性果胶酶在重组毕赤酵母中高效表达的关键因素研究

为提高重组毕赤酵母生产碱性果胶酶的产量和生产强度, 在摇瓶条件下优化了重组毕赤酵母生产碱性果胶酶的关键因素。结果表明, 以下条件：初始甘油浓度40 g/L、初始甲醇浓度3.1 g甲醇/g DCW、每24 h添加0.51 g甲醇/g DCW、诱导表达周期72 h、250 mL三角瓶诱导培养基装液量30 mL、初始pH 6.0, 最适于菌体生长与产物表达。在此基础上, 7 L罐上通过恒速流加甘油进一步提高细胞密度, 诱导阶段甲醇采取前期恒速流加和后期DO-stat, 发酵结束菌体干重达80 g/L, 酶活为217 U/mL, 比摇瓶结果提高了66.2%。     

马铃薯α-淀粉酶在毕赤酵母中的表达、纯化及其酶学性质的研究

采用RT-PCR法扩增马铃薯夏波蒂的α-淀粉酶成熟肽基因,将其亚克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9k上,SacII线性化重组表达载体,电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,构建重组酵母GS115/pPIC9k-amy,利用锥虫蓝法筛选获得高活性转化子(GSamyA5),以终浓度为0.5%甲醇诱导该重组菌表达α-淀粉酶,通过Ni~(2+)-NTA agarose亲和层析纯化,并对其酶学性质进行研究。结果表明:该酶的最适反应温度为45℃,40~50℃酶活较稳定,保温50 min,残留相对活力达92.6%;最适反应pH值为6.0,并在pH 6.0~7.0范围内酶活保持稳定。Ca~(2+)、K~+可促进酶反应,以Ca~(2+)影响为最,相对酶活力提高到125%;Cu~(2+),Fe~(2+),Fe~(2+),Zn~(2+)对该酶有显著抑制作用;Mn~(2+),Mg~(2+)对酶有微弱抑制作用,Li~+、Na~+对酶活影响不大。     

来源于软化芽孢杆菌的环糊精葡萄糖基转移酶在毕赤酵母和枯草杆菌中的表达

通过PCR扩增软化芽孢杆菌α-CGT酶基因,将基因片段分别克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K和大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pMA5中,分别转化毕赤酵母KM71和枯草杆菌WB600。结果表明,重组毕赤酵母发酵上清液中α-CGT酶活性仅0.2U/mL,重组枯草杆菌产酶达到1.9U/mL。对重组枯草杆菌发酵条件进行了优化,当以TB为出发培养基,初始pH6.5,温度为37oC时,摇瓶培养24h后α-CGT酶环化活性达到4.5U/mL(水解活性为3200IU/mL),是野生菌株软化芽孢杆菌表达量的9.8倍。     

多拷贝毕赤酵母重组菌表达GCL摇瓶优化和高密度发酵

目的:构建高效表达白地霉脂肪酶的毕赤酵母重组菌株,并对筛选得到的菌株进行摇瓶发酵条件优化和分批补料高密度发酵工艺研究。方法:将诱导型表达载体pPIC9K-gcl电转化至毕赤酵母GS115。通过橄榄油-罗丹明B平板和摇瓶发酵筛选高脂肪酶活力的重组菌株,运用基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR 法确定其拷贝数,并对菌株进行摇瓶发酵条件优化。在此基础上,研究重组菌在3L 发酵罐中的高密度发酵工艺。结果:筛选得到一株具有3 个白地霉脂肪酶基因拷贝的菌株GS115/pPIC9K-gcl 78#,初始酶活力为220 U/ml。当摇瓶发酵条件为甲醇诱导96 h,每24 h甲醇添加量1 %,接种量2 %,培养基初始pH 7.0,500 ml摇瓶装液量50 ml,甲醇诱导温度25℃ 时酶活力达735 U/ml。3L 发酵罐高密度发酵176.5 h,酶活力达到3360 U/ml,总蛋白含量达到4.30 g/L,且发酵过程中细胞活性一直保持在96 % 以上。结论:基因拷贝数与重组菌株的产酶水平呈正相关,摇瓶优化可显著提高重组菌株的产酶能力,为白地霉脂肪酶的工业化生产奠定了技术基础。     

金针菇漆酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达研究

综合运用cDNA末端快速扩增 (RapidAmplificationofcDNAEnds ,RACE )和基因组步行等技术克隆到一个金针菇 (Flammulinavelutipes)的漆酶结构基因和其对应的全长cDNA ,经测序和BLAST比对分析表明该基因属于多铜氧化酶基因家族 ,与已发表的漆酶基因 (AF176 2 30 )的同源性最高 ,在氨基酸水平为 72 %。该结构基因命名为gl ccFv,cDNA命名为lccFv ,其序列提交GenBank ,登录号分别为AY4 85 82 6和AY4 5 0 4 0 6。将lccFv的开放阅读框克隆到毕赤酵母表达载体pHBM90 6 ,转化毕赤酵母GS115且实现了分泌表达。将重组毕赤酵母GS115 (pHBM5 6 5 )诱导产酶 ,在培养温度 2 0℃、甲醇流加量为 1 0 % (V V)的情况下 ,其分泌表达的LCCFv的最高酶活为 0 10 70U mL ,最适反应温度为 4 5℃ ,最适反应pH值为 3 9,在最适反应条件下其热稳定性和pH值稳定性均较好