假单胞菌M18转录调节因子σs基因与无启动子lacZ基因融合突变株的构建和鉴定

通过菌落原位杂交和Southern杂交,从假单胞菌M18基因组文库中克隆了rpoS基因及相邻序列。为了深入研究影响rpoS基因表达的调控因素,运用同源重组技术,将无启动子β-半乳糖苷酶基因(-′lacZ)插入并融合于rpoS基因中,构建了假单胞菌M18rpoS基因突变株M18SZ。Miller法测定显示,突变株M18SZ的β-半乳糖苷酶可高达480U,而野生株检测不到β-半乳糖苷酶活性。表明,突变株中的rpoS基因与无启动子β-半乳糖苷酶基因已融合并且表达。在KMB培养基中生长量测定(OD600)的结果表明,突变株与野生株生长存在显著差异。     

以β-半乳糖苷酶为报告基因的原核启动子检测体系构建

目的:以β-半乳糖苷酶为报告基因构建原核启动子检测体系.方法:以由质粒 pDL 扩增获得的 bgaB 基因为报告基因,将其克隆到大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体 pBE2,构建成一个具有启动子活性检测功能的重组质粒pBEB.将组成型启动子P43和诱导型启动子Pcpac克隆入 pBEB,得到重组表达载体 pBEBP43 和 pBEBPapac,转化至大肠杆菌和枯草芽孢杆菌.结果:两种不同类型的启动子均能在大肠杆菌 BL21 和枯草芽孢杆菌 1A751 中启动 bgaB 基因的表达.结论:成功构建具有较为广泛适用性的原核启动子检测体系.     

毕赤酵母截短PGK1启动子与不同终止子组合调控外源基因表达

【目的】调控多基因表达对于优化代谢途径和合成生物学应用至关重要,构建不同的启动子和终止子组合,可作为毕赤酵母代谢途径改造和优化外源基因表达的有力分子调控工具。【方法】首先,将毕赤酵母组成型磷酸甘油酸激酶基因的启动子P_PGK1进行截短,构建截短启动子分别调控报告基因（绿色荧光蛋白基因egfp和β-半乳糖苷酶基因lac Z）表达的毕赤酵母重组菌。检测重组菌的报告基团转录水平、荧光强度和β-半乳糖苷酶产量。然后,构建了不同强度启动子和终止子组合（共27种组合）调控egfp表达的重组菌。最后,选取能调控基因高、中、低表达的6个启动子-终止子组合,调控β-呋喃果糖苷酶基因表达,构建β-呋喃果糖苷酶分泌表达的重组菌。【结果】构建的截短启动子(P_PP、P_PE、P_PG和P_PD)的强度是野生型启动子P_PGK1的70%–190%,最强的启动子为P_PD。分别与9个终止子组合时,P_PG、P_PE和P_PD     

β-半乳糖苷酶的筛选、克隆表达、酶学性质及其酶法合成低聚半乳糖

采用人工底物邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(o NPG)为筛选标记,从耐有机溶剂微生物菌库中,筛选出具有较高水解活性的β-半乳糖苷酶产生菌,再以乳糖为底物考察菌株低聚半乳糖的合成性能,筛选得到1株产β-半乳糖苷酶的Erwinia billingiae WX1。根据Gen Bank中相同属种的基因组序列推测β-半乳糖苷酶基因,克隆得到β-半乳糖苷酶基因gal,并在大肠杆菌中实现了来源于Erwinia billingiae菌β-半乳糖苷酶的克隆表达。该基因的开放阅读框(ORF)为1 428 bp,编码475个氨基酸,理论相对分子质量为5.2×104。镍柱法分离纯化得到电泳纯的β-半乳糖苷酶GAL,其酶学性质研究表明最适催化温度55℃,最适p H 7.0;Mg~(2+)、Mn~(2+)对该酶起较强促进作用,EDTA对该酶抑制作用较强。利用β-半乳糖苷酶GAL的转糖基作用,以乳糖为底物合成低聚半乳糖,初步优化的反应条件:底物乳糖质量浓度400 g/L,每克乳糖添加酶量1.0 U,在40℃反应16 h后,低聚半乳糖合成率达到34%(质量分数),显示了较好的开发前景。     

牛αS1-酪蛋白5′调控序列驱动人α-LA基因与LacZ基因在牛乳腺上皮细胞中的表达

将牛αS1-酪蛋白5′调控序列约1.2 kb的片段,连接到含SV40启动子调控下β-半乳糖苷酶基因(LacZ)的PSV载体上,做为启动子,在其后连接0.76 kb的人α-乳白蛋白基因(α-LA),构建真核表达载体 αS1-LA-psv．采用组织块接种法,培养奶牛乳腺上皮细胞,经传代纯化后,对细胞接种存活率、群体倍增时间、生长曲线、形态学等生物学性状进行检测,用免疫荧光细胞染色法对培养的奶牛乳腺上皮细胞进行角蛋白18鉴定,结果表明,成功建立奶牛乳腺上皮细胞系,细胞传至20代以上时仍保持旺盛的增殖活力．将构建的真核表达载体 αS1-LA-psv 转染奶牛乳腺上皮细胞,培养24～120 h均检测到了β-半乳糖苷酶的表达;培养72 h检测到细胞中人α-乳白蛋白的表达,表达量约为0.64 g/L．实验结果表明,建立的奶牛乳腺上皮细胞系具有外源基因表达活性,得到的牛αS1-酪蛋白5′调控序列能作为启动子指导外源基因的表达,构建的真核表达载体能在体外培养的牛乳腺上皮细胞中同时表达人α-乳白蛋白和β-半乳糖苷酶．     

不同异源启动子与MDVgB启动子及其复合启动子的活性比较

为了选择适宜的启动子调控外源基因的表达,以改善马立克氏病病毒为载体的重组病毒的免疫保护力。将hCMV立即早期启动子及增强子、SV40早晚期启动子及增强子或hCMV立即早期增强子的部分序列分别与马立克氏病病毒(MDV)自身的囊膜糖蛋白B基因(gB)启动子核心部分在体外杂合,分别构建复合启动子PhCMV-gB、PSV-gB或Pen-gB;将这些启动子与虫荧光素酶报告基因相连,构建表达载体。利用脂质体将以上质粒与内标质粒(pSV-β-LacZ)共转染鸡胚成纤维次代细胞,于转染后48h,将细胞刮下来,利用荧光素酶测定试剂盒和β-半乳糖苷酶测定试剂盒分别测定转染细胞的荧光素酶和β-半乳糖苷酶的活性,通过荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性的比值获得虫荧光素酶的相对活性,利用虫荧光素酶的相对活性进行启动子的活性比较。结果表明,复合启动子相对马立克氏病病毒自身的gB启动子,活性有不同程度的提高,其中复合启动子PhCMV-gB的活性最高,而复合启动子PSV-gB和Pen-gB的活性相当;但与商业强启动子相比,复合启动子活性要弱一些或相当。因此,从某种意义上讲,这些复合启动子既具有gB启动子的一些特性,又有商业强启动子的一些特性,为以马立克氏病毒为载体的新兴疫苗的开发奠定了基础。     

红球菌启动子识别及b-半乳糖苷酶报告基因表达

红球菌属在生物降解、生物修复、生物转化和生物表面活性剂等领域得到了日益广泛的应用。本研究以红球菌-大肠杆菌穿梭质粒pNV18.1为载体,以腈水合酶为模式酶,研究了大肠杆菌tac、lacZ启动子和红球菌酰胺酶启动子(ami-1/ami-2)在红球菌中的启动效率。结果表明,启动子Ptac、Pami-1(7bpSD-ATG间隔)、Pami-2(13bpSD-ATG间隔)和PlacZ在紫红红球菌ATCC33278中启动表达腈水合酶的比酶活分别是野生菌株的7.5、6.3、5.3和1.8倍,表明这些启动子都可以被红球菌的RNA聚合酶所成功识别。采用PlacZ启动子在红球菌宿主中启动β-半乳糖苷酶报告基因(lacZ),结果表明,lacZ能够在红球菌中高效表达,是优选的红球菌报告基因。     

利用定点突变分析白念珠菌依赖铁基因FRP1启动子元件

通过对白念珠菌高铁还原酶基因FRP1启动子进行突变分析, 确认启动子中特殊调控元件。我们通过分析FRP1起始密码子上游1000 bp序列发现在-160 和-650处有2个推测的Rim101p结合位点, 对其分别进行定点突变, 然后构建启动子与报告基因LacZ融合质粒, 转化整合到白念珠菌rim101-/-株和野生株中, 检测不同缺铁条件下b-半乳糖苷酶活性。结果发现碱性条件, Rim101p能够正向调控FRP1的表达; 启动子-160处突变对启动子功能影响较弱, 而-650突变使启动子活性大大降低, 此结果和双突变的结果相同, 表明Rim101p主要通过与启动子-650处结合位点相互作用来调控FRP1的表达。     

组成型表达chi基因的Bt工程菌株构建及其特性

【目的】通过构建能够组成型高效表达几丁质酶的苏云金芽胞杆菌工程菌株,以提高其抑真菌活性。【方法】首先通过PCR扩增获得Bti75菌株chiB全长及系列缺失启动子片段,与本室构建的启动子探测型载体pCB连接,转化Bti75菌株,通过β-半乳糖苷酶活性检测及β-半乳糖苷酶mRNA的Real time-PCR检测,确定了一段长度为190 bp的组成型高效表达启动子。将这一启动子分别与Bti75自身几丁质酶基因chiA以及地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)的几丁质酶基因chiMY连接构建了组成型高效表达的工程菌株Bti75(pDA)和Bti75(pDM)。应用几丁质酶酶活检测、SDS-PAGE及酶谱分析检测了工程菌几丁质酶的表达情况。最后,通过检测工程菌发酵粗酶液对真菌孢子萌发和菌丝生长的影响,评估了工程菌对3种植物病原真菌的抗真菌活性。【结果】在没有诱导物存在的情况下,Bti75(pBPΔ7)菌株表达的β-半乳糖苷酶酶活和β-半乳糖苷酶mRNA的转录量分别是Bti75(pBP)菌株的7倍和2.5倍左右。在没有几丁质诱导的情况下,与野生株Bti75相比,工程菌株Bti75(pDA)和Bti75(pDM)的几丁质酶活性均提高了3.5倍左右。SDS-PAGE及酶谱分析证明目的几丁质酶在非诱导条件下达到组成型高效表达,抑真菌实验显示工程菌Bti75(pDA)和Bti75(pDM)抑制3种植物病原真菌的活性明显提高。【结论】发现190 bp的缺失启动子能够组成型高效表达不同来源的几丁质酶,无需诱导物的诱导,工程菌株就能展现良好的抗真菌能力。     

假单胞菌M18转录调节因子σS基因与无启动子lacZ 基因融合突变株的构建和鉴定

通过菌落原位杂交和Southern 杂交,从假单胞菌M18基因组文库中克隆了rpoS基因及相邻序列。为了深入研究影响rpoS基因表达的调控因素,运用同源重组技术,将无启动子β半乳糖苷酶基因（′lacZ）插入并融合于rpoS基因中,构建了假单胞菌M18 rpoS基因突变株M18SZ。 Miller法测定显示,突变株M18SZ的β-半乳糖苷酶可高达480U,而野生株检测不到β半乳糖苷酶活性。表明,突变株中的rpoS基因与无启动子β-半乳糖苷酶基因已融合并且表达。在KMB培养基中生长量测定（OD600）的结果表明,突变株与野生株生长存在显著差异。     

牛αS1-酪蛋白5'调控序列驱动人α-LA基因与LacZ基因在牛乳腺上皮细胞中的表达

将牛αS1-酪蛋白5′调控序列约1.2 kb的片段,连接到含SV40启动子调控下β-半乳糖苷酶基因(LaeZ)的PSV载体上,做为肩动子,在其后连接0.76kb的人仅α-乳白蛋白基凼(α-LA),构建真核表达载体αS1-LA-psv.采用组织块接种法,培养奶牛乳腺上皮细胞,经传代纯化后,对细胞接种存活率、群体倍增时间、生长曲线、形态学等生物学性状进行检测,用免疫荧光细胞染色法对培养的奶牛乳腺上皮细胞进行角蛋白18鉴定,结果表明,成功建立奶牛乳腺上皮细胞系,细胞传至20代以上时仍保持旺盛的增殖活力.将构建的真核表达载体αS1-LA-psv转染奶牛乳腺上皮细胞,培养24～120h均检测到了β-半乳糖苷酶的表达;培养72 h检测到细胞中人α-乳白蛋白的表达,表达量约为0.64 g/L.实验结果表明,建它的奶牛乳腺上皮细胞系具有外源基因表达活性,得到的牛αS1-酪蛋白5′调控序列能作为启动子指导外源基因的表达,构建的真核表达载体能在体外培养的牛乳腺上皮细胞中同时表达人α-乳白蛋白和β-半乳糖苷酶.     

滇金丝猴粪便微生物来源的β-半乳糖苷酶基因的表达及酶学性质

【目的】对滇金丝猴粪便微生物来源的β-半乳糖苷酶进行异源表达和纯化,并研究其酶学性质。【方法】从滇金丝猴粪便微生物的宏基因组中克隆出一个β-半乳糖苷酶基因galRBM20_1,对该基因进行异源表达和酶学性质分析。构建含有T7强启动子的pEASY-E2-galRBM20_1质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行酶学性质研究。【结果】滇金丝猴粪便来源的β-半乳糖苷酶(galRBM20_1)最适pH为5.0,在pH 4–7之间能保留70%及其以上的活性。最适温度为45°C,在37°C和45°C下耐受1 h,酶活不变。特别的是,该酶具有良好的Na Cl稳定性,经1–5 mol/L的Na Cl作用1 h后,相对酶活均能超过初始酶活:当NaCl的作用浓度为4 mol/L时,β-半乳糖苷酶相对酶活最高(146%);当NaCl的作用浓度为5mol/L时,β-半乳糖苷酶的相对酶活仍达到135%。【结论】本研究从滇金丝猴粪便微生物的宏基因库中克隆得到β-半乳糖苷酶基因galRBM20_1,并成功在大肠杆菌BL21(DE3)表达,首次从动物胃肠道宏基因组中获得具有耐盐和转糖基产Galactooligosaccharides(GOS)性能的β-半乳糖苷酶。该酶具有良好的耐盐性,和较广的pH作用范围,使其在食品、生物技术领域和环保方面的发展具有良好的应用价值。     

牛αS1-酪蛋白5＇调控序列驱动人α-LA基因与LacZ基因在牛乳腺上皮细胞中的表达

将牛αS1-酪蛋白5＇调控序列约1．2kb的片段,连接到含SV40启动子调控下β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的PSV载体上,做为启动子,在其后连接0．76kb的人α-乳白蛋白基因（α-LA）,构建真核表达载体αS1-LA-psv．采用组织块接种法,培养奶牛乳腺上皮细胞,经传代纯化后,对细胞接种存活率、群体倍增时间、生长曲线、形态学等生物学性状进行检测,用免疫荧光细胞染色法对培养的奶牛乳腺上皮细胞进行角蛋白18鉴定,结果表明,成功建立奶牛乳腺上皮细胞系,细胞传至20代以上时仍保持旺盛的增殖活力．将构建的真核表达载体αS1-LA-psv转染奶牛乳腺上皮细胞,培养24～120h均检测到了β-半乳糖苷酶的表达;培养72h检测到细胞中人α-乳白蛋白的表达,表达量约为0．64g／L．实验结果表明,建立的奶牛乳腺上皮细胞系具有外源基因表达活性,得到的牛αS1-酪蛋白5＇调控序列能作为启动子指导外源基因的表达,构建的真核表达载体能在体外培养的牛乳腺上皮细胞中同时表达人α-乳白蛋白和β-半乳糖苷酶．     

极端嗜盐古菌质粒pSCM201衍生穿梭表达载体的构建及应用

摘要：【目的】利用有自主知识产权的嗜盐古菌θ型复制质粒和启动子,构建在极端嗜盐古菌模式菌株西班牙盐盒菌（Haloarcula hispanica）中方便使用、功能完善的基因表达载体。【方法】以pSCM201的最小复制子为基础,通过引入莫维诺林抗性基因,大肠杆菌质粒复制子以及氨苄抗性基因,构建了一个新的嗜盐古菌-大肠杆菌穿梭载体。利用定点突变和末端补平法依次将其中多余的酶切位点去除后,再添加hsp5启动子核心序列、人工合成的多克隆位点以及蛋白纯化标签His?Tag等重要元件成功构建了嗜盐古菌表达载体pSCM307。将报告基因bgaH插入到该载体的多克隆位点中并转化H. hispanica AS2049,通过X-gal平板筛选和β-半乳糖苷酶酶活实验检测pSCM307的表达能力。【结果】pSCM307具有独立的自主复制能力,其多克隆位点方便实用,报告基因bgaH在hsp5启动子控制下实现了高效表达。【结论】成功构建了嗜盐古菌领域中第一个方便使用的基因表达载体。     

天山1号冰川底部沉积层产β-半乳糖苷酶低温菌株的系统发育分析及生理多样性

[目的]通过对天山1号冰川底部沉积层冻土中细菌的分离和产β-半乳糖苷酶低温菌株的筛选,了解天山冻土微生物的物种多样性,并对产β-半乳糖苷酶低温菌株的系统发育和生理多样性进行分析.[方法]以乳糖为主要碳源,X-Gal为显色剂,分离筛选出产低温β-半乳糖苷酶菌株.对细菌常规生理生化实验、最适生长温度、耐盐性、药物敏感性进行测定.根据16S rRNA基因序列初步确定产β-半乳糖苷酶低温菌种的系统进化地位,并采用BOX-PCR指纹图谱技术对16S rRNA基因高度同源性的菌株进一步区分.[结果]分离到90株可培养低温菌中25株可产β-半乳糖苷酶,其中76％为革兰氏阳性菌.依据生长温度,产酶菌株80％为嗜冷菌,20％为耐冷菌.在系统发育上,产酶菌株隶属于4个类群,其中肠球菌属(Enterococcus)占26％,短波单胞菌属(Brevundimonas)占22％,假单胞菌属(Pseudomonas)占13％.[结论]天山1号冰川底部沉积层冻土中产β-半乳糖苷酶的低温细菌具有比较丰富的物种和生理多样性.     

嗜酸氧化亚铁硫杆菌启动子探针载体的构建

目的：为了研究嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans）启动子结构与功能。方法：以pSV-β-galactosidase质粒为骨架,通过定点突变的方法引入一个新的BstBⅠ单酶切位点,构建能在大肠杆菌（Escherichia coli）中正常复制的启动子探针载体。利用PCR的方法将A.ferrooxidans菌cycA2基因上游5＇段上游DNA片段克隆到探针载体β-半乳糖苷酶基因上游以替代其原有启动子（gpt启动子）,并将重组的质粒转化E.coliDH5α菌株。通过检测宿主细胞的β-半乳糖苷酶活性,来鉴定启动子片段,并分析了启动子探针质粒载体的功能及启动子的强度。结果：pSV-β-galactosidase质粒被正确突变,成功构建了启动子探针载体pSVB。来源于A. ferrooxidans菌的启动子片段可驱动β-半乳糖苷酶基因在E.coli细胞中表达,转化子酶活性约为gpt 启动子驱动下活性的70 %。结论：启动子探针载体（pSVB）可用于A. ferrooxidans菌或者其它原核生物启动子的分离及进一步的分析研究。酶活性分析结果表明,来源于A. ferrooxidans菌cycA2基因上游5＇段上游DNA片段具有显著启动子活性。     

β-半乳糖苷酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

为检测本课题组构建的枯草芽孢杆菌分泌表达载体pGPST中启动子和信号肽的活性,将β-半乳糖苷酶基因插入表达载体的多克隆位点,构建含有β-半乳糖苷酶基因的重组质粒pGPST-lacZ,重组质粒转化枯草芽孢杆菌,分别测定液体培养基中上清液和菌体沉淀中β-半乳糖苷酶的活性。培养上清液中的酶活在22h达到峰值,约为26mU/mL,之后开始下降;菌体沉淀中的酶活在14h最高,达6mU/mL,而阴性对照pGPST没有检测到酶活性。结果表明分泌型表达载体中的启动子和信号肽具有较好的活性,能实现异源基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达。本试验为该表达载体的进一步研究和应用提供重要的数据资料,也为外源基因在枯草芽孢杆菌中的表达提供参考资料。该载体将在研究外源基因在枯草芽孢杆菌中表达发挥重要作用。     

GH42家族保守氨基酸位点累积突变对Geobacillus stearothermophilus来源β-半乳糖苷酶BgaB催化活性的影响

【背景】β-半乳糖苷酶转糖苷活性弱,产物低聚半乳糖(galactooligosaccharides, GOS)易被水解,致其催化得率普遍较低。【目的】以GH42家族Geobacillus stearothermophilus来源β-半乳糖苷酶BgaB为对象,探讨家族保守氨基酸位点突变对β-半乳糖苷酶BgaB催化活性的影响。【方法】在单点突变体功能研究基础上,采用定点突变与化学修饰相结合的方法,对保守氨基酸位点E303与F341进行累积突变。【结果】与野生型酶相比,所构建双点突变体Ox-E303C/F341S水解活性降低为30%;GOS最大得率由0.75%提高到19.50%。【结论】家族保守氨基酸位点累积突变能够使单点突变体功能得到共同进化,降低β-半乳糖苷酶水解活性和底物抑制作用,能够提高其转糖苷催化活性。     

报告基因及其应用研究进展

报告基因是现代分子生物学研究领域中用于分析结构基因旁侧区域潜在的顺式元件(如启动子、增强子和沉默子等)和反式作用因子相互作用关系的一种重要工具,在解析基因时空表达调控的内在规律中发挥着重要作用,它具有便捷、可靠、灵敏度高和适用于大规模检测等优点.对目前已发展的多种报告基因(氯霉素转乙酰酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶以及荧光蛋白等)在动物、植物、微生物以及医学等领域的应用情况进行综述,为该技术的进一步拓展应用提供新线索和新思路.     

新型海洋源β-半乳糖苷酶在毕赤酵母中的表达与酶学性质

从海洋环境β-半乳糖苷酶基因出发,采用毕赤酵母表达体系,构建产β-半乳糖苷酶的基因工程菌,并对重组酶酶学性质进行表征。结果发现:海洋源β-半乳糖苷酶具有优良的乳制品用酶特性,该重组酶的最适pH为7.0~8.0,最适温度为45℃,在50℃以下孵育1 h可保持55%以上的活力,能耐受Fe~(2+)、Na~(2+)、K~(2+)、Ca~(2+)等多种金属离子。宽广的pH、温度、金属离子稳定性,以及低温活性赋予该酶良好的乳制品用酶特性。