胰蛋白酶在尿素溶液中失活与复活的动力学

胰蛋白酶的尿素差示光谱在292、286和236mμ有三个负的差吸收峯,和在260mμ范围有一较为平坦的正峯。在变性过程和恢复过程中伴随着活力的丧失和恢复都有差吸收的变化。变性过程差吸收的变化略快于活力的变化,而恢复过程活力的变化又快于差吸收的变化。变性过程可以分解为两个一级反应,仅其中较慢的反应与活力的变化一致,另一反应则与活力无关。底物对甲苯磺酰精氨酸甲酯,对变性过程差吸收和活力变化都有保护作用。由以上结果看来,胰蛋白酶表现其活力并不要求整个酶分子具有完整的空间构型并且它们的活性中心部分的空间构型是较为稳定的。此外本文还研究和计算了变性与恢复过程的热力学常数,并且对它们进行了讨论。     

棉铃虫幼虫中肠主要蛋白酶活性的鉴定

根据棉铃虫Helicoverpa armigera(Hubner)中肠酶液对蛋白酶专性底物在不同pH下的水解作用,棉铃虫中肠的3种丝氨酸蛋白酶得到鉴定。它们是：强碱性类胰蛋白酶,水 解a-N-苯甲酰-DL-精氨酸-p-硝基苯胺的最适pH在10.50以上;弱碱性类胰蛋白酶,水解p-甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯的最适pH为8.50～9.00;类胰凝乳蛋白酶, 水解N一苯甲酰-L-酪氨酸乙酯的最适pH亦为8.50-9.00。中肠总蛋白酶活性用偶 氮酪蛋白测定,最适pH亦在10.50以上。Ca²⁺对昆虫蛋白酶无影响,Mg²⁺仅对弱碱性类胰蛋白酶有激活作用。对苯甲基磺酰氟和甲基磺酰-L-赖氨酸氯甲基酮对弱碱性类胰蛋白酶的抑制作用较强,而对强碱性类胰蛋白酶的抑制作用较弱。甲基磺酰-L苯丙氨酸氯甲基酮除能抑制类胰凝乳蛋白酶外,还能激活弱碱性类胰蛋白酶。对牛胰蛋白酶有强抑制作用的卵粘蛋白抑制剂对昆虫蛋白酶却无抑制作用。大豆胰蛋白酶抑制剂对该虫的3种丝氨酸蛋白酶均有强的抑制作用。     

胰蛋白酶活性的定量测定方法

对甲苯磺酰基精氨酸甲酯(TAME)是胰蛋白酶的专一性底物. TAME经胰蛋白酶水解释放出的对甲苯磺酰基精氨酸与活性测定混合物中的NaOH反应, 导致溶液pH值的下降. 以酚红为指示剂, 通过测定555nm处光吸收值的降低可以监测pH的变化. 在0.001～0.3μg的范围内, 胰蛋白酶含量与555nm处光吸收值的降低呈线性关系.     

脱卤酶化学修饰的研究

脱卤酶是催化α-卤酸转化为α-羟基酸的酶。本文用各种化学修饰剂对脱卤酶YL、109和H-2进行化学修饰。实验结果表明作用于丝氨酸、赖氨酸、色氨酸残基的试剂对酶活无明显影响,而作用于组氨酸、精氨酸和带羧基氨基酸残基的试剂使酶活降低。底物对化学修饰剂有保护作用。组氨酸、精氨酸和带羧基氨基酸(答氨酸或天冬氨酸)残基为脱卤酶活力所必需。     

猪血纤维蛋白溶酶原的纯化及性质研究

 用偶联有L-赖氨酸的Sepharose 4B亲和柱对猪血纤维蛋白溶酶原进行分离纯化,所得酶原在酸性及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示单一蛋白质区带,在碱性条件下电泳及等电聚焦电泳表现出较明显的不均一性。还原及非还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得酶原分子量为88kD,经尿激酶激活后,进行还原SDS-凝胶电泳,出现两条新的蛋白质区带,分子量分别为63kD和26kD。酶原含中性糖1.35％,N-末端为异亮氨酸。尿激酶激活后产生的血纤维蛋白溶酶以对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯为底物,测得Km为4.2m mol/L,V_(max)为13.5 IU。6-氨基已酸对酶活性有双重影响。此外,还观察了胰蛋白酶对猪血纤维蛋白溶酶原的激活。     

蛋白质功能基团的改变与其生物活力的关系 Ⅱ.胰蛋白酶的必需硫硫键数目

在防止硫硫鍵交換的条件下,用亚硫酸鈉作用于胰蛋白酶的硫硫鍵,于测定硫硫鍵破坏数目的同时,以血紅蛋白、苯甲酰精氨酰胺,对甲苯磺酰精氨酰甲酯測定剩余酶活力的結果用前文提出的判断方法作图表明胰蛋白酶六个硫硫鍵中的三个是必需的。     

甘露聚糖酶Man23的化学修饰及活性必需基团测定

用化学修饰剂NEM、二甲基溴化锍、EDC、DEPC、TNM、对硝基苯乙二醛、PMSF、TNBS对芽孢杆菌B23产生的甘露聚糖酶M an23进行化学修饰,并测定修饰反应的动力学参数关系。结果显示半胱氨酸、色氨酸(1个)和谷氨酸(或天冬氨酸)残基(2个)是酶活性的必需基团;组氨酸、酪氨酸、精氨酸、丝氨酸和赖氨酸残基均为非必需基团。双向电泳结果显示酶蛋白分子具有一个链内二硫键(Cys90-Cys110)。荧光光谱测定结果显示该酶最大吸收峰为336 nm。底物作用导致酶的发射光谱发生蓝移,说明色氨酸残基位于酶蛋白分子内部的疏水区。     

乙酰辅酶A合成酶家族中保守的色氨酸残基的生化功能（英文）

甲烷菌与甲烷八叠球菌是仅有的两种已知利用乙酸盐进行甲烷生成的菌属。稻田以及厌氧的废物分解物是甲烷生物生成的主要来源。甲烷菌在自然界广泛分布,相比甲烷八叠球菌,在低乙酸盐的环境中对乙酸盐仍有高亲和力。在甲烷生成第一步即将乙酸盐转化为乙酰辅酶A的过程中,与甲烷八叠球菌利用乙酸激酶与磷酸转乙酰酶激活途径不同,甲烷菌通过腺嘌呤形成乙酰辅酶A合成酶进行催化。在甲烷菌一属(Methanosaeta concilii)中,共发现5个乙酰辅酶A合成酶的编码基因,其中3种乙酰辅酶A合成酶的生化及酶活特性已被确定。该3种乙酰辅酶A合成酶均以乙酸盐为其最优底物。尽管在短链乙酰辅酶A合成酶家族中,发现酰基底物结合位点高度保守,但乙酰辅酶A合成酶家族的酰基底物范围极为广泛。本研究对甲烷菌中不同种乙酰辅酶A合成酶的酰基底物结合位点的关键氨基酸进行识别与比较,从而对乙酰辅酶A合成酶家族的酶活特性有更全面深入的了解。首先,我们对甲烷菌一属中乙酰辅酶A合成酶4进行生化性质测定。结果表明,该酶无催化一系列酰基底物为酰基辅酶A或其中间产物酰基腺苷酸的活性。通过序列对比发现,嗜热自养甲烷杆菌的乙酰辅酶A合成酶1中高度保守的416位色氨酸残基在甲烷菌一属的乙酰辅酶A合成酶4中被替换成528位苯丙氨酸残基。将甲烷菌一属的乙酰辅酶A合成酶4中的528位苯丙氨酸残基点突变为色氨酸残基后,进行酶学性质测定,未检测到该突变体具有乙酰辅酶A/乙酰腺苷酸合成活性。我们进一步对嗜热自养甲烷杆菌的乙酰辅酶A合成酶1中的416位色氨酸残基点突变为苯丙氨酸残基,酶活性质结果显示,突变酶对于乙酸盐以及丙酸盐作为底物时的活性未有明显差异。然而,以丙酸盐为底物时,释放丙酰腺苷酸中间产物。该结果表明,热自养甲烷杆菌的乙酰辅酶A合成酶1对于底物乙酸盐或丙酸盐的催化作用不甚相同,苯丙氨酸中的苯甲酰环降低该酶保留中间产物丙酰腺苷酸,从而转化为丙酰辅酶A的能力。     

乙酰辅酶A合成酶家族中保守的色氨酸残基的生化功能（英文）北大核心CSCD

甲烷菌与甲烷八叠球菌是仅有的两种已知利用乙酸盐进行甲烷生成的菌属。稻田以及厌氧的废物分解物是甲烷生物生成的主要来源。甲烷菌在自然界广泛分布,相比甲烷八叠球菌,在低乙酸盐的环境中对乙酸盐仍有高亲和力。在甲烷生成第一步即将乙酸盐转化为乙酰辅酶A的过程中,与甲烷八叠球菌利用乙酸激酶与磷酸转乙酰酶激活途径不同,甲烷菌通过腺嘌呤形成乙酰辅酶A合成酶进行催化。在甲烷菌一属(Methanosaeta concilii)中,共发现5个乙酰辅酶A合成酶的编码基因,其中3种乙酰辅酶A合成酶的生化及酶活特性已被确定。该3种乙酰辅酶A合成酶均以乙酸盐为其最优底物。尽管在短链乙酰辅酶A合成酶家族中,发现酰基底物结合位点高度保守,但乙酰辅酶A合成酶家族的酰基底物范围极为广泛。本研究对甲烷菌中不同种乙酰辅酶A合成酶的酰基底物结合位点的关键氨基酸进行识别与比较,从而对乙酰辅酶A合成酶家族的酶活特性有更全面深入的了解。首先,我们对甲烷菌一属中乙酰辅酶A合成酶4进行生化性质测定。结果表明,该酶无催化一系列酰基底物为酰基辅酶A或其中间产物酰基腺苷酸的活性。通过序列对比发现,嗜热自养甲烷杆菌的乙酰辅酶A合成酶1中高度保守的416位色氨酸残基在甲烷菌一属的乙酰辅酶A合成酶4中被替换成528位苯丙氨酸残基。将甲烷菌一属的乙酰辅酶A合成酶4中的528位苯丙氨酸残基点突变为色氨酸残基后,进行酶学性质测定,未检测到该突变体具有乙酰辅酶A/乙酰腺苷酸合成活性。我们进一步对嗜热自养甲烷杆菌的乙酰辅酶A合成酶1中的416位色氨酸残基点突变为苯丙氨酸残基,酶活性质结果显示,突变酶对于乙酸盐以及丙酸盐作为底物时的活性未有明显差异。然而,以丙酸盐为底物时,释放丙酰腺苷酸中间产物。该结果表明,热自养甲烷杆菌的乙酰辅酶A合成酶1对于底物乙酸盐或丙酸盐的催化作用不甚相同,苯丙氨酸中的苯甲酰环降低该酶保留中间产物丙酰腺苷酸,从而转化为丙酰辅酶A的能力。     

一种高相对活力的固相胰蛋白酶

胰蛋白酶与正丁胺混和后再偶联于p-氨基苯磺酰乙基纤维素上得到一种高相对活力的固相胰蛋白酶,它以N-苯甲酰DL-精氨酰β-萘胺盐酸盐及酪蛋白为底物时的相对活力分别达到95～100%及45～50%。此固相酶80%的活性位置能与绿豆胰蛋白酶抑制剂结合形成失活的络合物。此固相酶对热及尿素的稳定性有明显的提高,活力也较稳定,载体价廉易得,因而有实际应用的前景。     

甘薯和花生胰蛋白酶抑制剂的初步研究

许多植物蛋白制成品均含有抑制动物消化的蛋白酶抑制剂。目前已从某些豆类及蔬菜种子中分离出多种对胰蛋白酶具有抑制作用的活性物质。该实验以花生、甘薯等为原料,通过DEAE-Sepharose4BFF阴离子交换柱层析分离胰蛋白酶抑制剂,以N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)为底物测定其对胰蛋白酶的抑制活性;将具有抑制活性的组分通过SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量(Mr);以聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定蛋白质等电点(pI)。结果显示,甘薯中至少有4种胰蛋白酶抑制剂组分,相对分子质量为20～25kD、等电点在pH5.0～6.6之间;花生中至少有三种胰蛋白酶抑制剂组分,相对分子质量为30～70kD、等电点在pH5.0～5.8之间。     

重组猪胰蛋白酶及其R122位点突变体在毕赤酵母中的高效表达及其性质研究

目的:研究R122位点突变重组猪胰蛋白酶,与野生型酶相比较,该位点对重组猪胰蛋白酶(RPT)性质的影响。方法:以毕赤酵母GS115作为表达宿主,对RPT、突变体mRPT(R122H)和 mRPT(R122H/R73G/R130T)进行表达及纯化。并对其性质和稳定进行对比研究。结果:重组胰蛋白酶及其突变体在毕赤酵母中均获得了高效表达。相对于RPT,突变体mRPT(R122H)和 mRPT(R122H/R73G/R130T)在以N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯 (BAEE)为底物时,具有更强底物结合力,三者的米氏常数分别为18.8μmol/L、9.0μmol/L和11.0μmol/L;两突变体耐高温耐碱能力增强;在Ca ²⁺存在及去除的条件下,突变体具有更强的抗自降解能力。 结论:可以利用毕赤酵母高效表达重组胰蛋白酶及其突变体。mRPT(R122H)和mRPT(R122H/R73G/R130T) 相对于野生型RPT,对高pH条件和高温的耐受性增强,该稳定性的提高主要归因于R122位点的突变。     

棉铃虫可溶型海藻糖酶的化学修饰

【目的】本研究旨在通过分析化学修饰剂对棉铃虫Helicoverpa armigera可溶型海藻糖酶活性的影响,以明确海藻糖酶活性中心的结构特点和氨基酸构成。【方法】采用化学修饰方法,测定不同修饰剂处理后棉铃虫5龄幼虫海藻糖酶催化活性的变化,进而通过化学修饰反应失活常数来推测酶活性中心的特定氨基酸残基数量。【结果】采用8 mmol/L水溶性碳二亚胺(carbodiimide,EDC)溶液和25 mmol/L苯甲酰甲醛(phenylglyoxal,PG)溶液分别对棉铃虫5龄幼虫海藻糖酶羧酸基团和精氨酸残基进行修饰后,其活性分别减少81.58%和54.14%,这表明对羧酸基团和精氨酸残基的修饰可有效抑制海藻糖酶活性。底物海藻糖可保护海藻糖酶不受修饰剂的影响。修饰动力学结果显示,海藻糖酶活性中心可能包含1个羧酸基团和2个精氨酸残基。【结论】结果表明,含有羧基的谷氨酸和天冬氨酸是海藻糖酶活性中心的催化残基,精氨酸是维持海藻糖酶活性的必要残基。本研究结果可为开发新型农药提供理论支持。     

α-氨基酸酯酰基转移酶表达纯化、酶学性质及其催化应用

α-氨基酸酯酰基转移酶(α-amino acid ester acyltransferase,AET)能够催化底物L-丙氨酸甲酯盐酸盐、L-谷氨酰胺合成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-alanyl-L-glutamine,丙谷二肽)。利用重组大肠杆菌saet-QC01表达α-氨基酸酯酰基转移酶,对其表达条件进行了优化,通过Ni-NTA亲和层析法分离纯化重组蛋白,并对其酶学性质、催化应用进行了研究。适合酶表达的诱导条件:温度20℃,诱导阶段(OD_(600)=2.0-2.5),IPTG浓度0.6 mmol/L,诱导时间12 h。α-氨基酸酯酰基转移酶的最适反应温度27℃,最适pH 8.5,在pH 7.0-8.0很稳定,在酸性条件下相对稳定,低浓度的Co~(2+)、低浓度的EDTA对酶活有促进作用。在底物浓度丙氨酸甲酯盐酸盐600 mmol/L、谷氨酰胺480 mmol/L,丙谷二肽的产量达到78.2 g/L,生产速率达到1.955 g/(L·min),转化率达到75.0%。α-氨基酸酯酰基转移酶具有良好的酸碱耐受性,催化效率高的优良特性,在工业生产中具有较好的应用潜力。     

酪氨酰蛋白磺基转移酶与植物蛋白质硫酸化修饰

蛋白质硫酸化是一种翻译后修饰,该修饰使分泌蛋白或膜蛋白具有成熟的生物学功能,在植物的生长发育中发挥重要的作用。催化这一修饰的酶是酪氨酰蛋白磺基转移酶（tyrosylprotein sulfotransferase, TPST）,它将底物3′-磷酸腺苷-5′磷酰硫酸（PAPS）的磺酸基团转移到蛋白质的酪氨酸残基上。近年来,随着植物中TPST的克隆,已有3个家族的植物多肽被发现存在硫酸化修饰。本文综述了植物TPST的生化特性与功能,介绍了植物TPST的3个底物多肽家族及其参与的分子信号途径。     

浙江蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒激肽释放酶Ⅰ的分离纯化及其性质的研究

浙江产蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒中含有激肽释放酶,不需活化即可水解激肽原,释放激肽,并具有较弱的精氨酸酯酶的活力。粗毒经DEAE纤维素(DE-22,DE-52)和Sephadex G-75分离纯化后,可得到两个激肽释放酶的组分:Ⅰ与Ⅱ,二者电泳行为与酶活力有所不同,激肽释放酶Ⅰ在聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈一条带,而组分Ⅱ中还杂有少量组分Ⅰ。激肽释放酶Ⅰ为一糖蛋白,含糖量20.3%,约由221个氨基酸残基组成,凝胶过滤和SDS电泳测定其分子量分别为31,000和30,000。此酶具有严格的底物专一性,能作用于激肽释放肽的专一底物Z-Phe-Arg-MCA及Bz-Pro-Phe-Arg-PA,不作用于一般蛋白质底物酪蛋白,对TAME的水解速度仅是对BAEE的14%。以BAEE为底物时,其最适pH为8～9,K_m值为2.85×10~(-4)M。本文测定了不同pH和不同温度下酶的稳定性,pH低于5或大于9,温度在40℃以上,酶活力迅速下降。其精氨酸酯酶及激肽释放酶的活力均能被丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF和DFP所抑制,两者呈平行关系,但都不被胰蛋白酶的专一抑制剂TLCK所抑制,慈菇抑制剂与大豆(Kunitz)抑制剂对此酶有部分抑制作用。经磷酸纤维素等阳离子交换树脂层析或交联的慈菇抑制剂Sepharose-4B亲合层析也能提纯激肽释放酶Ⅰ,但提纯后精氨酸酯酶活力下降,激肽释放活力几乎全部丧失。经圆二色光谱测定表明,酶的构象已发生改变。     

纤维素酶在二甲基亚砜微扰条件下的动力学行为和光谱学变化

为了探索二甲基亚砜对纤维素酶催化活性的影响,以羧甲基纤维素钠(CMC)为底物来研究纤维素酶纯酶在二甲基亚砜中的动力学变化、紫外吸收光谱、紫外差示光谱和荧光发射光谱。实验表明:在3%的二甲基亚砜中,纤维素酶的催化活性下降了46.78%;其Km值从缓冲液中的2.500 mg/mL上升到二甲基亚砜中的3.922 mg/mL;在二甲基亚砜中,酶分子的肽键紫外吸收稍有改变,但其氨基酸基团的紫外吸收没有改变;其紫外差示光谱出现明显的正峰和负峰;其荧光发射光谱没有改变。研究结果证明:二甲基亚砜通过轻微改变酶分子的肽链结构,使分子构象改变,导致酶分子对底物的亲和力下降,从而降低其催化活性。     

米曲霉LY-128广谱有机磷农药水解酶的纯化和鉴定

米曲霉LY-128的培养物经硫酸铵分级沉淀,Sephadex G-100凝胶过滤,DEAE-Sephrose CL-6B和Sephadex G-100层析手段,获得了电泳纯的广谱有机磷农药水解酶。通过SDS-PAGE和IEF电泳测得其分子量为62kDa,等电点为pH5．2。该酶的最适反应温度为45℃,最适pH6．8,在50℃以下及pH6．0～9．5范围内活性稳定。Hg^2 、Fe^3 、对氯高汞苯甲酸、碘乙酸和N-乙基马来酰亚胺对该酶有强烈的抑制作用,而Cu^2 、巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、谷光甘肽和去污剂对酶有不同程度的激活作用。底物的专一性实验表明,该酶不仅可以作用于含P-O键的有机磷农药;而且也能水解含P-S键的有机磷农药。以甲基对硫磷和内吸磷为底物的Km值分别为52μmol、236μmol;Vmax分别为317μmol min^-1mg^-1、179μmol min^-1mg^-1;Kcat分别为1152s^-1、650s^-1。     

米曲霉LY-128 广谱有机磷农药水解酶的纯化和鉴定

米曲霉LY-128的培养物经硫酸铵分级沉淀,Sephadex G-100凝胶过滤,DEAE-Sephrose CL-6B和Sephadex G-100层析手段,获得了电泳纯的广谱有机磷农药水解酶.通过SDS-PAGE和IEF电泳测得其分子量为62 kDa,等电点为pH 5.2.该酶的最适反应温度为45℃,最适pH 6.8,在50℃以下及pH6.0～9.5范围内活性稳定.Hg2+、Fe3+、对氯高汞苯甲酸、碘乙酸和N-乙基马来酰亚胺对该酶有强烈的抑制作用,而Cu2+、巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、谷光甘肽和去污剂对酶有不同程度的激活作用.底物的专一性实验表明,该酶不仅可以作用于含P-O键的有机磷农药;而且也能水解含P-S键的有机磷农药.以甲基对硫磷和内吸磷为底物的Km值分别为52μmol、236μmol;Vmax分别为317μmol min-1 mg-1、179 μmol min-1 mg-1;Kcat分别为1152 s-1、650 s-1.     

嗜碱细菌环状糊精葡糖基转移酶的纯化和性质

嗜碱细菌52—2除去菌体的培养液经硫酸铵沉淀和DEAE－纤维素离子交换柱层析,得到凝胶电泳均一的环状糊精葡糖基转移酶,纯化了11.5倍,酶活力回收为5.7％。用浓度梯度PAGE测分子量为151700。酶反应最适温度为65℃,50℃以下比较稳定。酶反应最适pH为7．0,在6．0～9.0范围内稳定。Zn²⁺、Hg²⁺、Pb²⁺、Al³⁺、Cu²⁺、Ag⁺和Fe²⁺强烈抑制酶活力。紫外光谱在270nm和244nm处分别有最大和最小吸收。荧光光谱的最大激发波长和发射波长分别为283nm和335nm。用NBS、NEM、NAI、DEP和EDC对酶进行了化学修饰,初步推测组氨酸和色氨酸残基可能为酶活力必需基因,羧基与酶活力有一定关系。