Cetus等公司开发TNF作为肥胖抑制剂

美国Cetus公司和Chiron公司着手进行肿瘤坏死因子(TNF)用于肥胖抑制药的研究。 最早,TNF是由杀癌细胞作用中被发现的蛋白。     

转基因枸杞表达HIV-1壳体蛋白病毒样颗粒疫苗表达载体的构建

利用PCR技术扩增出人免疫缺陷病毒HIV-1MA₄-CA融合基因,将其克隆到pGEM-T载体中,测定其核苷酸序列,并推导其氨基酸序列。该基因全长为450bp,与已发表的HIV-1的全序列基因(AF324493)完全同源,编码一个含150个氨基酸残基的蛋白质。将该基因与分泌型表达载体pCAMBIA1305.2连接,同时将水稻中富含甘氨酸蛋白的信号肽序列(GRP)引入MA₄-CA融合基因,构建了含MA₄-CA基因的植物分泌表达载体pCAMBIA1305.2-MA₄-CA。     

杀菌/通透性增加蛋白基因的克隆及在CH0细胞中的表达

从一名健康中国人外周血白细胞中克隆出杀菌/通透性增加蛋白(BPI)基因,全长1452bp,编码27个氨基酸的信号肽和456个氨基酸成熟蛋白.序列比较发现,此序列与国外发表的序列有6个核苷酸的差异,编码蛋白有4个氨基酸的差异.构建真核表达质粒,在CHO细胞中实现BPI基因的稳定表达.对重组蛋白初步纯化后进行杀菌实验,结果表明重组蛋白具有与天然蛋白同样的生物活性.     

新城疫病毒V_4株NP基因的克隆、序列测定及真核表达载体的构建

研究新城疫病毒 ( NDV)核衣壳蛋白基因的生物学作用 ,以提纯的 NDV V4 株基因组 RNA为模板 ,化学合成 NP基因的特异核苷酸引物 ,RT- PCR扩增 NP基因 c DNA,得到一条 1 .5kb的DNA带 ,与 NDV NP基因大小一致 ,平端连接克隆到 p UC1 1 9质粒中 .阳性克隆经酶切鉴定及序列分析表明已获得新城疫病毒 V4 株 NP基因克隆 .将 NDV V4 株 NP基因碱基序列与已发表的NDV Beaudettec C株、La Sota株、D2 6株的 NP基因的碱基序列比较 ,同源性分别为 90 .64%、90 .1 7%、98.0 3% ,氨基酸序列差异率是 4.50 %、5.93%、2 .45% .NDV V4 株 NP基因与已发表的NDV Beaudettec C株、La Sota株、D2 6株的 NP基因有所不同 ,但具有高度同源性 .将 NDV V4 株NP基因 c DNA克隆到 pc DNA3 真核表达载体中 ,构建表达 NP蛋白真核质粒     

光滑鳖甲热休克蛋白70基因的克隆及表达

根据GenBank中发表的昆虫热休克蛋白70 (heat shock protein 70, HSP70) 基因的保守序列设计引物,利用PCR结合RACE扩增的方法,获得新疆荒漠昆虫光滑鳖甲Anatolica polita borealis热休克蛋白70基因,命名为APhsp70 (GenBank注册号为EF569673)。测序结果表明,序列长为2 092 bp,由核酸序列推演出的蛋白质分子量为70 kD,含653个氨基酸残基。基因结构分析表明APhsp70不含内含子序列。通过Northern blotting和半定量RT-PCR技术研究昆虫在受到不同温度胁迫时该基因的表达规律,结果表明：在45℃处理时,昆虫体内该基因的表达水平显著上升。并且,当机体受到-5℃低温胁迫并在室温恢复15 min后APhsp70的表达量也显著升高;但是4℃和-10℃低温处理组APhsp70的表达未见明显变化。     

烟草BRANCHED1-Like基因的克隆及表达分析

TCP基因家族CYC/TB1簇中成员BRC1在调控植物侧枝发育的过程中发挥重要作用。本研究利用电子克隆的策略结合RT-PCR方法从普通烟草（Nicotiana tabacum）中克隆到4个NtBRC1-Like基因,分别命名为NtBRC1-Like1、2、3和4。4条基因的CDS序列长度分别为1140、1062、987和1041bp,分别编码由379、353、328和346个氨基酸组成的蛋白,这4个蛋白与CYC/TB1簇中其它成员具有较高同源性。蛋白质保守结构域分析表明,4个NtBRC1-Like基因编码蛋白除具有TCP核心结构域外,还具有CYC/TB1簇蛋白特有的R结构域。系统进化树分析表明,NtBRC1-Like蛋白都是TCP家族CYC/TB1簇中的成员,且4个NtBRC1-Like蛋白可以被分成两组,NtBRC1-Like1和4为一组,NtBRC1-Like2和3为另一组。荧光定量PCR分析发现,4条烟草NtBRC1-Like基因的表达呈现明显的组织特异性,且其表达模式可分为两种：NtBRC1-Like1和4的表达模式相似,在腋芽中有极高的表达;NtBRC1-Like2和3的表达模式十分相像,在叶和腋芽中的表达量都显著高于其它组织。推测烟草BRC1基因可能存在类似番茄BRC1基因在功能上保守与进化的情况。     

日本进行SOD的第二阶段临床试验

武田药品公司从美国Chiron公司引进人的重组过氧化物岐化酶(SOD),从去年10月开始在日本以关节炎患者为对象进行临床试验.该公司1990年2月与Chiron公司签订正式合同,从5月开始第二阶段临床试验. 人的重组过氧化物岐化酶是去除由巨噬细胞(因体内炎症反应而活化的)和淋巴细胞产生的活性氧的酶.活性氧也有杀菌作用.但是,其过量生产会给细胞膜和结合组织等各种各样的活体组织带来障碍.由于日光的照射和体内化学反应等产生的活性氧,被认为是炎     

流感病毒ns1基因的克隆及其原核表达载体的构建

为了解H5N1亚型流感病毒株的ns1基因特性及其规模制备NS1蛋白,首先将病毒在鸡胚中传代,从收获的尿囊液中提取RNA,采用RT-PCR技术扩增流感病毒全长ns基因.测序显示H5N1亚型流感病毒NS1 cDNA全长678bp,编码225个氨基酸.BLAST分析表明,Qa/ST/852/01(H5N1)病毒株ns1基因与近年来从华南地区分离的禽H5N1毒株的ns1基因有很高的同源性.之后采用PCR方法扩增ns1基因的cDNA片段,将其克隆到pGEX-4T-3载体中,与谷胱甘肽巯基转移酶(GST)基因融合,构建重组质粒pGEX-4T-3/NS1 cDNA,转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行诱导表达.SDS-PAGE和凝胶扫描分析,GST-NS1融合蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,并且以可溶形式存在,重组融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的28.5%,表达产物经亲和层析纯化后蛋白质纯度达96%以上.经免疫印记证实重组融合蛋白可以被GST特异性抗体所识别.该表达载体的构建为获得大量NS1蛋白进行功能研究及抗体制备提供了基础.     

美国Chiron公司创立开发眼科用重组DNA制品的分公司

美国Chiron公司(加利福尼亚州Emeryville)设立了名为Chiron Ophthahnics的分公司,开发在眼科上应用重组DNA制品的方法。Chiron Ophthalmics公司的负责人是William Link。Link在设立名为Techno Ophthalmies的姐妹公司中也作出了贡献。两公司相互协作,已能供应用于屈光眼手术的制品。屈光眼手术作为矫正近视和远视的方法,最近已受到人们重视。Link在眼科领域已积累了丰富的经验,他不久前辞去了American Medical Optics公司经理的职务,这个公司是Link1977年创办的,是American Hospital Supply公司(伊利诺州Evanston)的分公司,已发展为拥有5500万美元资金的企业。     

Asia1型口蹄疫病毒分离株结构蛋白基因的克隆与表达

口蹄疫病毒结构蛋白氨基酸的变化是病毒抗原性变异的分子基础,大部分抗原表位位于主要的免疫原蛋白VP1上,部分非线性抗原表位位于VP2和VP3上。本研究首次成功测定了 Asia1 型口蹄疫病毒(YNBS/58)四种结构蛋白基因( p1 区)的核苷酸序列,全长 2199 个碱基,编码 733 个氨基酸,该基因与 Ind63/72、Pka3/54、Israel、China/99、C1/Germany、A22、ZIM7/83/2 毒株的 p1 基因核苷酸序列同源性分别为 88. 4%、86. 0%、89. 3%、68.6%、67.6%、66.8%、50.3%,推导的氨基酸序列同源性分别为 94.1%、93.2%、95.1%、79.9%、77.0%、76.5%、58.1%;将YNBS/58株与 Ind63/72、Pka3/54、Israel株的 vp1、vp2、vp3、vp4 基因和编码蛋白分别进行同源性比较,发现VP1的序列变异最大,VP2、VP3、VP4次之,且VP1的氨基酸变异主要集中在 42-50 位和 137-156 位。实现了YNBS/58株结构蛋白基因在大肠杆菌中的高效表达,其表达的融合蛋白以包涵体形式存在,分子量约为88kDa,占菌体总蛋白的16%左右,并利用镍柱对目的蛋白进行了纯化,纯度达 90%以上,本实验为进一步研究 A sia1型口蹄疫病毒的分子流行病学、p1基因及其编码蛋白的生物学功能奠定了基础。     

霍乱弧菌CTB基因的克隆、表达及重组蛋白活性分析

霍乱弧菌CTB蛋白具有免疫佐剂活性。本研究根据已发表CTB基因的序列设计一对引物,从一株霍乱弧菌中扩增出CTB基因,测序后发现该基因全长375 bp,与国内分离的六株CTB基因的同源性达96.0%～99.2%。将该基因与pTWIN1连接构建了原核表达载体pTWIN1-CTB,重组表达载体转化BL21（DE3）表达菌株,0.8 mmol/L IPTG诱导4 h后,收获的细菌总蛋白SDS-PAGE电泳显示CTB在原核表达系统中得到表达,融合蛋白大小与理论值符合,蛋白产量占细菌总蛋白的20%左右,主要以包涵体形式存在,western杂交和GM1-ELISA结果表明重组蛋白具有免疫原性和粘膜佐剂活性。     

转基因水稻cry1Ab/Ac基因及蛋白在肉鸡肠道中的残留检测

旨在研究转基因水稻对饲喂肉鸡的影响,以含有转cry1Ab/Ac基因水稻的饲料饲喂肉鸡,分析了肉鸡空肠、回肠、盲肠、直肠中cry1Ab/Ac基因和蛋白残留情况,并用体外实验验证了外源基因的降解情况。结果表明,饲喂转cry1Ab/Ac基因水稻21 d和42 d的肉鸡肠道4个部位中没有检测到cry1Ab/Ac基因残留,体外消化外源基因的实验发现外源基因在肉鸡肠道中约4 h后开始逐步降解。对上述4个部位内容物进行ELISA和Western blot分析,均未检测到Cry1Ab/Ac蛋白残留。综合分析表明,转基因水稻中的外源基因和蛋白在肉鸡肠道中易被消化和降解。     

用重组大肠杆菌生产的Bt杀虫蛋白

住友化学工业公司宝塚综合研究所使用基因重组大肠杆菌,经24小时培养生产20 g/1的苏云金杆菌杀虫蛋白.该小组曾开发了用大肠杆菌JM103株的基因重组大量生产IP的方法.这次以繁殖速度快而菌体产率高的大肠杆菌K12株为寄主,确立了高效率的TP制造法.这项成果于4月1日在京都召开的日本农艺化学会上发表. 这次生产的是对粉蛾的杀虫效果强但对蚕无毒性的IP(130 kD).如使用基因重组技术,能生产出不含对蚕有害的135kD的IP.但是比医药品附加价值低的农药,应用基因重组     

马铃薯Y病毒衣壳蛋白基因片段长度对RNA介导抗病性的影响

在已证明转化马铃薯Y病毒(PVY)全长衣壳蛋白基因可获得高度抗病的转基因烟草、且这种抗病性为RNA介导抗病性的基础上, 克隆了马铃薯Y病毒坏死株系衣壳蛋白基因(PVY^N-CP) 3′端202 (1/4 CP), 417 (1/2 CP)和603 bp (3/4 CP)的部分基因片段(CP202, CP417和CP603), 并分别构建植物表达载体pROKⅡ-CP202, pROKⅡ-CP417和pROKⅡ-CP603. 利用农杆菌介导方法转化烟草NC89. 抗病性鉴定表明, 转化1/2 CP和3/4 CP基因片段的转基因烟草均可获得抗病程度达到免疫的植株, 而转化1/4 CP的基因片段没有获得抗病植株. 分子分析结果表明这种抗病性为RNA介导的抗病性, 是转录后基因沉默的结果. 研究表明, 能够诱发RNA介导抗病性所需的PVY-CP基因的最短有效片段长度可能介于202和417 bp之间. 这一研究结果对改进利用转录后基因沉默策略来防治植物病毒病害以及研究转录后基因沉默机制具有意义.     

猪链球菌2型次黄嘌呤核苷酸脱氢酶单克隆抗体的制备及其识别表位分析

用纯化的硫氧还蛋白-IMPDH融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,对杂交瘤细胞及时筛选,阳性孔经4次有限稀释法克隆,成功获得1A8、1F2、2D2和2D12共4株能稳定传代并分泌抗IMPDH的单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株.4株腹水型单克隆抗体间接ELISA效价分别为100x211、100x211、100x210和100x28,经Western-blot分析表明,4株单抗与硫氧还蛋白-IMPDH融合蛋白均具有特异性反应,并且通过4种IMPDH全基因分片段缺失表达的融合蛋白,分析了4株单抗所识别抗原决定簇的差异性,发现1A8、1F2,2D2识别表位的编码基因集中在IMPDH基因片段的627 bp～790 bp之间,2D12识别表位的编码基因则集中在IMPDH基因片段的411 bp～790 bp之间.猪链球菌2型中IMPDH单克隆抗体的获得及相应表位分析为研究IMPDH蛋白的生物学活性及免疫学活性奠定了基础.     

滇龙胆甲羟戊酸激酶基因的克隆与表达分析

甲羟戊酸激酶是甲羟戊酸途径的关键酶。根据滇龙胆转录组甲羟戊酸激酶基因Gr MK序列,设计一对基因特异性引物克隆该基因,并进行序列分析;构建原核表达载体p GEX-4T-1-Gr MK,转入大肠杆菌Rosetta(DE3),重组蛋白在37℃、1.0 mmol/L IPTG诱导下成功表达。生物信息学分析结果表明,Gr MK蛋白为甲羟戊酸激酶家族成员,具有MK蛋白保守结构域:乳糖激酶/高丝氨酸激酶/甲羟戊酸激酶/磷酸甲羟戊酸激酶(GHMP kinase)N端结构域、C端结构域和ATP结合结构域;Gr MK与长春花Cr MK亲缘关系最近.原核表达结果表明,融合蛋白相对分子质量与推断大小一致。组织特异性表达分析结果表明Gr MK基因主要在根中表达.这些结果为Gr MK蛋白结构和功能的研究奠定基础。     

利用双杂交系统对SeNPV泛素与抗细胞凋亡蛋白相互作用的研究

本文报道利用酵母双杂交系统研究甜菜夜蛾核多角体病毒(SeNPV)的泛素(Ubiqutin)与抗细胞凋亡蛋白(IAP2, IAP3)相互作用的结果.使用Clontech 公司的MACHMAKER GAL4 Two-hybrid system 3,以病毒ubiquitin基因与酵母GAL4的DNA结合域重组表达"诱饵"蛋白,以病毒iap2或iap3基因与DNA活化域重组表达"猎物"蛋白,在低严谨型筛选培养基上均得到阳性克隆.这一结果表明,甜菜夜蛾核多角体病毒泛素与IAP2或IAP3在体外能进行相互作用,这种作用利用了酵母内源性E1和E2.SeNPV的抗细胞凋亡蛋白(IAPs)可能是泛素-蛋白酶水解途径(UPP)中的泛素连接酶(E3),或者是泛素依赖性蛋白水解酶的靶底物.     

ut-PA抗PAI-1突变体的构建及在sf-9细胞中的表达

为使嵌合分子 ut- PA获得抗 PAI- 1抑制作用的性质 ,将删除了编码 u- PA中 R1 78- R1 79-H1 80 - R1 81的 1 2个核苷酸的 u- PA c DNA[u- PA( 1 ) ]的 Bam H - Eco R 部分酶切片段 ,克隆到含嵌合蛋白 ut- PA基因的转移载体 p VL 1 392 - ut- PA的相应位点中 ,构建了一个含有新的嵌合蛋白基因 ut- PA( 1 )的转移表达载体 p VL1 392 - ut- PA( 1 ) .在昆虫病毒表达系统 sf- 9细胞中表达该嵌合蛋白基因 ,表达上清具有纤溶性 ,用血纤维蛋白平板法和 S2 4 44 显色底物法分别测得活力为 2 4 8IU/ml和 380 IU/ml     

豌豆蚜基因组P450基因家族的分析

细胞色素P450在各种内源和外源物质代谢中起着非常重要的作用。利用豌豆蚜Acyrthosiphon pisum基因组mRNA和氨基酸数据库研究P450基因功能的进化规律。通过生物信息学方法对豌豆蚜全基因组P450进行分析, 结果显示: 在豌豆蚜基因组中发现69个P450基因, 它们分别属于13个P450家族和18个亚家族, 是一个典型的多基因家族。进一步将这些基因与豌豆蚜ESTs数据库进行了比对分析, 其中39个候选基因有EST证据, 证明了这些P450基因在转录水平的真实性。以氨基酸相似度大于60%为标准对豌豆蚜基因组中P450基因进行分组, 69个P450基因中, 除18个基因序列因差异太大, 不能被归入任何一组, 其余51个可归入10个组, 其中8个组(包含47条序列)适合于正选择和基因转换分析。正选择和基因转换分析结果表明: 仅有1个组(含9个基因)显著受到正选择压力作用, 正选择概率大于95%的氨基酸位点分别是20T和27N, 20T位于底物识别位点SRS1, 27N位于D. helix; 有3个组(包含8个基因）显示显著的基因转换事件。 参与基因转换的基因均为CYP4家族成员, 分别是CYP4C, CYP4G和CYP4V亚家族。 参与基因转换的成员之间的蛋白相似度较高（70％~95％）, 且XM_001944991与XM_001951794同存在于SCAFFOLD12542上, XM_001945510与XM_001944057同存在于SCAFFOLD7010上。这可能暗示豌豆蚜P450基因通过基因复制, 然后通过基因转换使P450获得新的功能, 以适应多变的生存环境。此外, 鉴定出20个不同的基序, 其中有5条基序在90％以上的基因中出现。      

Asia1型口蹄疫病毒分离株结构蛋白基因的克隆与表达

口蹄疫病毒结构蛋白氨基酸的变化是病毒抗原性变异的分子基础,大部分抗原表位位于主要的免疫原蛋白VP1上,部分非线性抗原表位位于VP2和VP3上.本研究首次成功测定了Asia1型口蹄疫病毒(YNBS/58)四种结构蛋白基因(p1区)的核苷酸序列,全长2199个碱基,编码733个氨基酸,该基因与Ind63/72、Pka3/54、Israel、China/99、C1/Germany、A22、ZIM7/83/2毒株的p1基因核苷酸序列同源性分别为88.4%、86.0%、89.3%、68.6%、67.6%、66.8%、50.3%,推导的氨基酸序列同源性分别为94.1%、93.2%、95.1%、79.9%、77.0%、76.5%、58.1%;将YNBS/58株与Ind63/72、Pka3/54、Israel株的vp1、vp2、vp3、vp4基因和编码蛋白分别进行同源性比较,发现VP1的序列变异最大,VP2、VP3、VP4次之,且VP1的氨基酸变异主要集中在42-50位和137-156位.实现了YNBS/58株结构蛋白基因在大肠杆菌中的高效表达,其表达的融合蛋白以包涵体形式存在,分子量约为88kDa,占菌体总蛋白的16%左右,并利用镍柱对目的蛋白进行了纯化,纯度达90%以上,本实验为进一步研究A-sia1型口蹄疫病毒的分子流行病学、p1基因及其编码蛋白的生物学功能奠定了基础.