SA11株轮状病毒VP7基因的克隆及表达

采用RT PCR方法 ,从提取的SA1 1株轮状病毒总RNA中扩增出VP7基因片段 ,进行鉴定后 ,将该片段克隆于真核表达载体pEF1 HisC dhfr,构建成重组质粒pEF1 HisC dhfr VP7,然后用质脂体法转染COS 7细胞 ,进行真核系统的表达 .获得了长 981bp的PCR片段 ,序列分析结果与已知VP7序列相同 .表达后经细胞超声破碎 ,Westernblot检测表达产物 ,在相对分子质量 38× 1 0 3 处有表达条带 ,表达蛋白主要存在于上清中 .因此 ,获得了VP7基因 ,并在COS 7细胞中获得了表达 ,表达蛋白质免疫Balb c小鼠 ,获得了具有特异性结合活性的抗体     

人Nmi mRNA编码区存在变异形式

Ｎｍｉ基因编码一种可与Ｍｙｃ相互作用的蛋白质．在人红白血病细胞系ＴＦ－１细胞去细胞因子ＧＭ－ＣＳＦ后８ｈ,发现ＮｍｉＲＮＡ表达水平升高．利用ＰＣＲ方法从中扩增ＮｍｉｃＤＮＡ编码区,发现除正常大小的扩增片段外,还有一比公布核酸序列小约１００～２００ｂｐ的扩增片段．序列分析表明该片段为编码区第３３７～５０９位的碱基缺失,由ＧＴＴＣＣＡＴＴＧＣＧ１１个碱基取代,形成一个开放读码框架,编码２５４个氨基酸,比野生型Ｎｍｉ编码的３０７个氨基酸少５３个氨基酸．     

轮状病毒VP7基因的克隆与表达

应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增轮状病毒VP7基因,并将其克隆到pMD18-T simple载体上,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并测定DNA全序列。结果显示,克隆片段全长为981 bp。将轮状病毒VP7基因定向的克隆到原核表达载体pET-32a启动子下游,构建原核表达载体pET-32aVP7。将质粒pET-32aVP7转化Transetta表达菌株进行诱导表达,裂解菌体细胞抽提蛋白质进行SDS-PAGE。结果表明,轮状病毒壳蛋白VP7基因在Transetta表达菌株内得到成功表达。     

鹅源新城疫病毒拯救体系的建立

参照GenBank上公布的鹅源新城疫病毒ZJI株全序列,设计8对引物,经RT-PCR法从尿囊液中扩增目的片段后,分别克隆进pCR2.1载体,将Ⅰ～Ⅶ7对引物的扩增片段依次亚克隆到TVT7R转录载体中,构建了含NDV全基因组cDNA的转录载体(pNDVZJI),将Ⅴ、Ⅵ和Ⅷ3对引物的扩增片段分别克隆进pCR2.1载体,并亚克隆到表达质粒pCI-neo上,构建了L基因的真核表达载体(pCI-L),pNDVZJI、pCI-L与另外两个辅助表达质粒(pCI-NP和pCI-P)共转染BSR-T7/5细胞,成功拯救出了具有血凝性的鹅源新城疫病毒,ZJI株鹅源新城疫病毒的成功拯救为后续相关研究工作的开展打下了基础。     

日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白编码基因的克隆和表达

根据曼氏血吸虫抱雌沟蛋白SmGcp序列和日本血吸虫编码抱雌沟蛋白保守区的基因片段jGcp1分别设计三对引物,以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板 ,用RT－PCR法扩增出大小为1949bp的基因片段。经序列分析推断该基因片段含编码日本血吸虫抱雌沟蛋白基因的阅读框,与SmGcp碱基一致性为85％,其理论推测氨基酸组成与曼氏血吸虫抱雌沟蛋白的一致性为83．7％。将上述扩增的基因片段克隆到表达载体pET28c( )中,在大肠杆菌BL21中获得表达,融合表达产物分子量约为80kD。利用日本血吸虫成虫抗原免疫血清对该表达产物进行Western印迹检测,在预测位置出现了明显的识别条带,说明该编码日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白基因的表达产物具有抗原性。     

猪轮状病毒vp4基因在大肠杆菌中的表达

以猪轮状病毒JL94株核酸为模板扩增该病毒vp4全基因,对扩增产物进行测序及序列比较;根据VP4的5’端(1bp-750bp)特异片段主要决定其活性的观点,再设计一对引物扩增该主要抗原位点基因,将此主要抗原位点基因同pGEX-6P-1载体连接并转化入E．coli．BL2l(DE3)plays,经IPTG诱导表达出蛋白质;对表达的蛋白进行Westernblot分析、纯化和血清中和抗体试验。结果表明：JL94株与国外分离株CRW．8株、BEN．307株vp4全基因片段氨基酸同源性分别为96．98％和98．05％,说明JL94株与CRW．8株、BEN．307株属于同-vP4血清型;经IPTG诱导VP4主要抗原位点基因获得了高效表达,表达量占菌体蛋白的26％;Westernblot结果和所表达的融合蛋白免疫小鼠产生的中和抗体能阻断JL94在MAl04细胞上引起的细胞病变,说明所表达蛋白有良好的生物学活性。     

耐热DNA聚合酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

用PCR法从水生栖热菌菌株YT－1中扩增耐热DNA聚合酶基因,得到2．5kb的DNA片段t扩增片段重组到pUCl8中测序证实为Taq DNA聚合酶基因,将该片段重组到pBV221温控表达质粒中,在大肠杆菌中表达出94kDa的重组蛋白,100ml培养物的细胞产酶为1．5×10⁵u,表达的蛋白能催化PCR反应的进行。     

牛脑液泡型质子泵70kD和33kD亚基基因的表达

已分离了编码牛脑液泡型质子泵的70kD亚基的cDNA,利用聚合酶链反应(PCR)扩增了70kD亚基的编码片段,同时直接从牛脑cDNA库中得到了33kD亚基的编码片段.分别将相应片段连接到PET载体上完成70kD和33kD亚基基因在大肠杆菌中的表达.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹分析表明70kD和33kD亚基基因均得到明显表达.     

乙肝病毒突变核心蛋白基因的克隆及序列分析

目的克隆发生长片段缺失的乙肝病毒核心蛋白基因（HBV-C）,并对其进行DNA序列和蛋白质结构分析。方法通过PCR从1株乙型肝炎病毒中扩增得到发生长片段缺失的HBV-C基因,利用TA克隆将PCR产物克隆人pUCm—T载体并进行测序、同源性比较和蛋白质结构分析。结果PCR扩增出的HBV-C基因经序列分析表明长度为454bp,其核苷酸序列缺失了220—317bp之间的98个碱基,造成从74个氨基酸起发生移码突变。结论成功克隆发生长片段缺失的HBV-C基因,为表达及功能研究奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒orf7和orf5双基因的原核表达研究

根据PRRSV已知序列设计两对引物,采用RT-PCR方法分别扩增orf7和orf5基因片段。利用EcoRI、SpeI和HindIIl位点将orf7和orf5基因片段依次克隆到pMD-18T载体,构建成重组质粒pMDl8NE,并比较所克隆基因序列的同源性。将串联的orf7和orf5基因亚克隆到原核表达载体pGEX．KG,构建重组原核融合表达质粒pGEX．KGNE,并转化BL21,SDS．PAGE和Western．blot分析表明：orf7和orf5基因与GST获得了融合表达,并且表达的融合蛋白GST-NE具有免疫学反应活性,这为猪繁殖与呼吸综合征血清学诊断方法的建立及疫苗研究打下基础。     

利用温控载体构建碱性果胶酯裂解酶工程菌

从筛选出的Bacillus subtilisWSHB04-02菌株中扩增出编码碱性果胶酯裂解酶的结构基因PL,将其插入载体pET22b( )多克隆位点,得到带有前导序列PelB重组质粒pET22b( )PL。以pET22b( )PL为模板扩增出带前导序列的碱性果胶酯裂解酶的结构基因PL,将其插入温控载体pHsh,重组载体在大肠杆菌JM109中得到表达。其表达量与以T7为启动子的重组菌BL21DE3[(pET22b( )PL]相比,表达量相近。SDS-PAGE分析显示表达产物的分子量均为43kDa,同核酸序列测定所推导的值相符。研究表明利用pHsh构建的JM109(pHsh PL)诱导表达好,诱导方式简单廉价,这对该酶的大规模发酵具有重要意义。     

金黄色葡萄球菌肠毒素B基因的克隆和在大肠杆菌中高效表达

利用PCR方法从金黄色葡萄球菌TSTw基因组DNA中扩增出约700bp的DNA片段,将之克隆到pGEM7Zf(+)载体上并转化大肠杆菌 DH5α菌株。重组质粒的测序结果表明克隆到了seb基因,它含有717bp（不包括N端81bp的信号肽编码区）,其核苷酸序列与文献报道完全一致。将其连接于表达载体7ZTS上,转化到大肠杆菌JM109（DE3）内。表达的SEB占总蛋白33.5%。      

大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶基因的克隆与真核表达载体的构建

根据Ｇｅｎｂａｎｋ中大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶（ＰＮＰ）基因的核苷酸序列,设计并合成了一对引物,以大肠杆菌基因组ＤＮＡ为模板,进行ＰＣＲ扩增,并将扩增产物定向连接到克隆、测序及真核表达载体ＰＣＤＮＡ３中,进行酶切鉴定、测序及序列分析。结果表明ＰＣＲ扩增出７４１ｂｐ大小的片段,通过酶切和序列分析证明含完整的ＰＮＰ基因序列且基因插入方向正确,此序列与文献报道的ＰＮＰ基因的同源性为９９．７％。说明克隆的ＰＮＰ基因与文献报道的基本一致,ｐｃＤＮＡ３－ＰＮＰ的构建成功为今后用其进行基因转染来研究ＰＮＰ／Ｍｅｐ－ｄＲ自杀基因系统在肿瘤基因治疗中的应用打下了基础。     

大肠杆菌 LT B亚基基因表达载体对犬细小病毒VP2 DNA疫苗免疫应答的增强作用

【目的】通过融合基因表达载体和共免疫基因表达载体研究大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)B亚基基因对犬细小病毒VP2DNA疫苗免疫应答的影响。【方法】提取大肠杆菌44815菌株基因组DNA,通过PCR方法从基因组DNA中扩增LTB基因,同时采用PCR方法从含有犬细小病毒VP2基因的质粒中扩增VP2的主要抗原表位基因(VP2-70,编码70个氨基酸)。将上述基因分别连接到含有人CD5信号肽序列的载体pcDNA-CD5sp上,分别构建成它们的分泌型真核表达载体,pcDNA-CD5sp-LTB和pcDNA-CD5sp-VP2-70。再利用酶切连接的方法构建LTB与VP2-70融合的真核表达载体pcDNACD5sp-LTB-VP2-70。然后用pcDNACD5sp-VP2-70(VP2-70组)、pcDNACD5sp-LTB-VP2-70(VP2-LTB融合组)、pcDNA-CD5sp-LTB/pcDNACD5sp-VP2-70(VP2-LTB共免疫组)和pcDNA3.1A(空载体对照组)分别免疫小鼠。免疫后用间接ELISA检测不同时间小鼠血清的抗体水平,用MTT方法检测小鼠免疫5周后脾脏淋巴细胞的增殖活性。【结果】经过测序表明本研究扩增的LTB和VP2基因序列和构建的相关表达载体结构正确。通过Western-blot检测证明构建的表达载体均能介导相应基因在真核细胞进行分泌表达。ELISA检测结果表明,3组实验组小鼠接受VP2DNA疫苗免疫后均能产生特异的体液免疫应答反应,特别是VP2-LTB基因融合组小鼠的抗体水平在第5周时高达1:5120,明显高于其它两组(P<0.01)。3组免疫小鼠抗体的亚型均表现IgG1抗体水平明显高于IgG2a抗体水平(P<0.01)。淋巴细胞增殖实验结果表明,在ConA的刺激下,3组免疫小鼠的淋巴细胞刺激指数均明显高于对照组(P<0.01),说明VP2DNA疫苗能够引起淋巴细胞的增殖。但3组免疫小鼠之间的刺激指数没有明显差异(P>0.05)。【结论】在小鼠体内,LTB基因表达载体可明显提高CPVVP2DNA疫苗的体液免疫应答水平。     

Molecular cloning, expression and characterization of a novel feruloyl esterase enzyme from the symbionts of termite(Coptotermes formosanus) gut

Termites play an important role in the degradation of dead plant materials and have acquired endogenous and symbiotic cellulose digestion capabilities. The feruloyl esterase enzyme (FAE) gene amplified from the metagenomic DNA of Coptotermes formosanus gut was cloned in the TA cloning vector and subcloned into a pET32a expression vector. The Ft3-7 gene has 84% sequence identity with Clostridium saccharolyticum and shows amino acid sequence identity with predicted xylanase/chitin deacetylase and endo-1,4-beta-xylanase. The sequence analysis reveals that probably Ft3-7 could be a new gene and that its molecular mass was 18.5 kDa. The activity of the recombinant enzyme (Ft3-7) produced in Escherichia coli (E.coli) was 21.4 U with substrate ethyl ferulate and its specific activity was 24.6 U/mg protein. The optimum pH and temperature for enzyme activity were 7.0 and 37oC, respectively. The substrate utilization preferences and sequence similarity of the Ft3-7 place it in the type-D sub-class of FAE.     

人MCM7 N-端融合蛋白的原核表达、纯化及其与AR蛋白相互作用的研究

目的：制备人MCM7 N-端的GST融合蛋白（GST-MCM7N）,研究其是否和雄激素受体（AR）蛋白存在直接的相互作用。方法：利用RT-PCR获得长度为744 bp的人mcm7 基因N-端cDNA碱基片段,把该片段构建到原核表达载体pGEX-5x-3中,转化大肠杆菌BL-21菌株。经IPTG诱导菌株基因表达产生了GST-MCM7N融合蛋白;使用Glutathione Sepharose 4B球珠分离纯化。利用GST pull-down 技术把纯化的融合蛋白分别和前列腺癌细胞LNCaP细胞裂解液及基因工程获得的AR蛋白孵育,检测MCM7蛋白的 N-端是否和AR蛋白直接相互作用。结果：酶切鉴定及基因测序表明,mcm7 基因cDNA的 N-端片段被构建到表达载体pGEX-5x-3中;SDS-PAGE及Western blotting结果分别显示,本研究获得了GST和GST-MCM7N融合蛋白;GST pull-down 结果证实GST-MCM7N和AR蛋白存在相互作用。结论：MCM7蛋白的N-端和AR蛋白至少在体外可以发生直接的相互作用。     

大肠杆菌RNaseⅢ基因的克隆与表达

目的：克隆并在原核表达系统中表达RNaseⅢ基因。方法：提取大肠杆菌JM109株的基因组DNA,以之为模板扩增得到RNaseⅢ基因全序列,将该编码序列克隆到原核表达载体pET-22b（＋）中,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导重组RNaseⅢ表达。结果与结论：在大肠杆菌中克隆到了RNaseⅢ的全基因,经测序证明与数据库中报道的序列一致;表达的重组RNaseⅢ主要以包涵体形式存在。     

大肠杆菌ubiA基因的克隆及序列测定

以E.coli JM83染色体DNA为模板PCR扩增ubiA的结构基因,将PCR产物克隆于pUCm-T Vector,对PCR产物进行测序鉴定。与已发表的大肠杆菌ubiA基因序列比较,同源性达99％。     

中华眼镜蛇短链神经毒素cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用RT－PCR技术从中华眼镜蛇毒腺组织中成功地克隆了短链神经毒素CDNA。测序结果表明,该基因开放阅读框架编码83个氨基酸残基,其中对个为信号肽,成熟肽为62个氨基酸残基。该基因与GenBank报道的相同物种的神经毒素基因有相当的同源性,不同物种之间的信号肽序列十分保守。将短链神经毒素CDNA再经PCR扩增除去信号肽序列,克隆到pT7ZZ表达质粒中,转化E.coliBL21（DE3）后,经IPTG诱导可高效表达分子量为23kDa②左右的融合蛋白。表达产物占菌体总蛋白的25％左右。     

山梨醇脱氢酶的克隆、表达及活性检测

目的:从氧化葡糖杆菌H24中克隆山梨醇脱氢酶基因进行表达并检测其活性。方法:以氧化葡糖杆菌H24基因组DNA为模板,PCR扩增包括启动子、结构基因及其后的终止序列在内的山梨醇脱氢酶基因;将PCR产物插入pMD18T载体,转化大肠杆菌DH5α;通过活性电泳检测山梨醇脱氢酶在大肠杆菌中的表达及活性。结果:从氧化葡糖杆菌H24中扩增得到山梨醇脱氢酶基因并在大肠杆菌中实现表达,重组菌株经活性电泳检测具有醇糖转化活性。结论:原核表达的山梨醇脱氢酶具有很强的醇糖转化活性。