含Dsred类似生色团的红色荧光蛋白的发展及应用

自从绿色荧光蛋白(GFP)被发现以来,荧光蛋白在生物医学领域已经成为一种重要的荧光成像工具．随着红色荧光蛋白DsRed的出现,各种优化的DsRed突变体和远红荧光蛋白也不断涌现．其中荧光蛋白生色团的形成机制对改建更优的荧光蛋白变种影响很大,对于红色荧光蛋白而言,大多数的红色荧光蛋白的生色团类型为DsRed类似生色团,在此基础上又出现了Far-red DsRed类似生色团．目前,含DsRed类似生色团的荧光蛋白主要有单体红色荧光蛋白、光转换荧光蛋白、斯托克斯红移蛋白、荧光计时器等．这些优化的荧光蛋白作为分子探针可以实现对活细胞、细胞器或胞内分子的时空标记和追踪,已经在生物工程学、细胞生物学、基础医学领域得到广泛应用．本文综述了含DsRed类似生色团的荧光蛋白的研究进展及其应用,以及由此发展起来的远红荧光蛋白在活体显微成像技术中的应用,并展望了荧光探针技术研究的新方向．     

不同固定液对体外细胞系荧光蛋白淬灭及对胞内蛋白荧光染色的影响

目的:比较不同细胞固定液对荧光蛋白淬灭情况以及核内、胞浆蛋白免疫荧光染色的影响。方法:分别对融合了RFP和GFP基因的鼻咽癌HK1细胞采用95%乙醇、75%乙醇、甲醇、丙酮:甲醇=1:1、5%冰乙酸、Carnoy固定液进行固定,然后采用免疫荧光法对细胞进行免疫染色。结果:六种固定液均能使荧光蛋白猝灭。免疫荧光染色方面,对于核蛋白染色,75%乙醇、95%乙醇、丙酮:甲醇=1:1、Carnoy固定液固定后核区获得明显的荧光染色,而采用甲醇、5%冰乙酸固定后荧光染色不明显。对于胞质蛋白染色,按荧光染色的清晰程度分为固定于Carnoy固定液丙酮:甲醇=1:1甲醇5%冰乙酸75%乙醇95%乙醇,前四者固定可见分布于胞质,75%乙醇或95%乙醇固定的目标蛋白定位不清。结论:六种不同的固定液在有效失活荧光蛋白的情况下对核蛋白及胞浆蛋白抗原性的影响略有不同,可根据研究目的蛋白表达的部位及特点来选用合适的固定液。     

荧光偏振技术在生命科学中的研究进展

荧光偏振技术(FP)作为一种新的检测技术已经广泛应用于生命科学的各个方面.本文对荧光偏振技术在生命科学中的研究进展做了详细的评述.介绍了荧光偏振技术的原理,评述了荧光偏振技术在生命科学中的研究热点方向.     

绿色荧光蛋白及其应用

随着对绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)研究的不断深入,人们对其结构、荧光产生机理等已有较为全面的认识。近年来利用GFP及其它荧光蛋白(FPs)发展了诸如荧光互补技术(FC)、荧光共振能量转移技术(FRET)和超分辨成像(super-resolution imaging)等一系列新技术,极大地促进了生物学、医药科学的研究。主要介绍了荧光蛋白的结构,荧光产生的机理,不同类型的荧光蛋白和基于荧光蛋白产生的新技术等方面的最新研究进展。     

水稻减数分裂染色体分析方法

减数分裂粗线期染色体研究技术的发展, 很大程度上克服了水稻(Oryza sativa)细胞遗传研究中较小染色体所带来的研究困难。减数分裂染色体的制备与观察已经成为水稻细胞遗传学研究中的常规方法。该文详细描述了水稻中常用的减数分裂染色体制备、荧光原位杂交和免疫荧光染色的实验方法。     

水稻减数分裂染色体分析方法

减数分裂粗线期染色体研究技术的发展, 很大程度上克服了水稻(Oryza sativa)细胞遗传研究中较小染色体所带来的研究困难。减数分裂染色体的制备与观察已经成为水稻细胞遗传学研究中的常规方法。该文详细描述了水稻中常用的减数分裂染色体制备、荧光原位杂交和免疫荧光染色的实验方法。     

三种显微技术对人毛囊蠕形螨的观察和研究

目的 采用荧光显微镜、扫描电镜和激光共聚焦显微镜对人体毛囊形蠕形螨进行形态学观察.方法 选用5 μg/mL碘化丙啶(propidine iodide,PI)对虫体进行荧光染色,避光染色15 min,分别置于荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察;2.5%戊二醛固定虫体标本,梯度酒精和叔丁醇脱水,金喷镀后扫描电镜观察.结果 荧光显微镜下碘化丙啶对虫体有很强的结合力,虫体荧光信号均匀展示于细胞表面,充分展现虫体形态,扫描电镜更加清楚、细致地展示人体毛囊型蠕形螨的超微结构,激光共聚焦显微镜将虫体分层扫描图片进行三维重建,真实、完全、直观地展露了虫体.结论 三种显微技术均可展示蠕形螨超微形态.PI对虫体有很好的荧光染色作用,使激光扫描共聚焦显微镜能够获得更加精准的超微形态结构,结合三维重建技术有着广泛的应用价值.     

灰葡萄孢菌过氧化物酶体及细胞核的荧光蛋白标记

【目的】对灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)的细胞核和过氧化物酶体进行荧光蛋白标记,为研究其生长发育和侵染过程中细胞结构和细胞器动态提供基础。【方法】以绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(DsRED、mCherry)为报告基因,利用根癌农杆菌介导转化(Agrobacterium tumefaciens mediated transformation,AtMT)将3种荧光蛋白标记载体分别导入灰葡萄孢菌标准菌株B05.10;通过PCR检测及荧光观察筛选和验证转化子,并进行单孢纯化;利用共聚焦显微镜记录细胞器荧光定位情况。【结果】获得了过氧化物酶体或细胞核稳定表达红、绿色荧光的重组单孢菌株,PCR验证表明标记基因成功整合入转化子基因组。在标记细胞核的菌株中,菌丝和孢子中可见多个明亮、圆形的荧光点,与DAPI染色共定位。标记过氧化物酶体的菌株中,菌丝和孢子中可见小点状绿色或红色荧光,在脂类物质诱导下荧光点数量明显增加,符合过氧化物酶体分布及动态特征。细胞壁染色结果显示,细胞壁染色产生的蓝色荧光与红、绿荧光蛋白的荧光互不干扰,标记效果良好。【结论】获得了理想的过氧化物酶体或细胞核荧光标记的灰葡萄孢菌菌株,为研究其细胞器动态以及生长发育与致病分子机制提供了参考和材料。     

利用荧光蛋白标记西瓜枯萎病菌的过氧化物酶体及细胞核

西瓜枯萎病是一种世界范围的西瓜毁灭性病害,其病原菌为尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum,FON)。研究病原菌生长发育和侵染的机制是解决病害的根本途径。利用荧光蛋白对细胞或细胞器进行标记,是病原菌研究中的重要方法。该研究利用绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白对FON的细胞核和过氧化物酶体进行了荧光标记。通过农杆菌介导转化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,AtMT),该文将3种不同的荧光定位载体分别导入FON,获得了细胞核红色荧光标记的转化子(潮霉素抗性,含mCherry-H2B融合蛋白),以及过氧化物酶体绿色(潮霉素抗性,含GFP-PTS1融合蛋白)和红色(潮霉素抗性,含DsRED-PTS1融合蛋白)荧光标记的转化子各1种。在标记细胞核的菌株中,菌丝、孢子都可见明亮、圆形的红色荧光点,荧光点与DAPI染色标记的细胞核区域完全重合。在过氧化物酶体标记的菌株中,菌丝、孢子中可见明亮的红色或绿色荧光成小点状分布,符合过氧化物酶体的分布特征,而且在脂类物质诱导的条件下,荧光点的数量明显增加。此外,该文还利用细胞壁荧光染色剂卡氏白对3种荧光蛋白标记菌株进行染色。结果显示,卡氏白染色产生的蓝色荧光与红、绿荧光蛋白的荧光在FON中互不干扰。转化子继代培养和初步分析表明,其表型与野生型无差异,菌株继代后荧光表达稳定、定位明显。该结果为进一步研究FON细胞器动态、生长发育与致病分子机制提供了方法和工具。     

荧光蛋白研究进展

荧光蛋白在生物学众多研究领域中有着广泛的应用,基于荧光蛋白的分子探针和标记方法已成为活细胞或活体内动态成像研究生物大分子或细胞功能的重要工具。本文对现有荧光蛋白的种类和理化特性,及其在生物学研究中的应用进行了综述介绍。重点介绍了近年来荧光蛋白在亮度、Stokes位移、光谱改变等方面的研究进展,介绍了光转换与光活化荧光蛋白及其在超分辨荧光成像技术中的应用。最后对荧光蛋白未来的发展方向进行了展望。     

荧光标记技术在肿瘤模型研究中的应用

目的利用绿色荧光小鼠和红色荧光蛋白标记肿瘤细胞,建立荧光标记的小鼠肿瘤模型,并建立活体荧光成像和荧光显微镜成像在整体和细胞水平直接观察肿瘤的技术。方法将小鼠B16黑色素瘤细胞接种到绿色荧光蛋白转基因小鼠皮下,建立GFP小鼠肿瘤模型。以红色荧光蛋白作为标记基因导入小鼠黑色素瘤细胞B16细胞,建立稳定表达红色荧光蛋白的细胞株。将表达红色荧光蛋白B16细胞接种到绿色荧光转基因小鼠皮下,建立双荧光小鼠肿瘤模型。用荧光显微镜和活体荧光成像系统检测小鼠肿瘤的发生发展。结果分别建立了GFP小鼠肿瘤模型和双色荧光小鼠肿瘤模型。利用活体荧光影像仪可以观察双色荧光小鼠模型中受体绿色荧光组织和红色荧光移植肿瘤相互融合。利用荧光显微镜,可以观察到肿瘤内绿色荧光标记的来源于受体小鼠的血管和免疫细胞。经香菇多糖刺激的GFP小鼠肿瘤模型的移植瘤组织中,来源于受体小鼠绿色荧光标记的免疫细胞明显多于经生理盐水刺激的对照小鼠。结论利用绿色荧光小鼠和红色荧光RFP标记肿瘤细胞建立荧光标记的小鼠肿瘤模型,采用活体荧光成像仪和荧光显微镜可在整体和细胞水平直接观察肿瘤的生长以及肿瘤与宿主的相互作用。     

VBNC细菌荧光观察技术问题分析及对策

以SYTO-9和PI两种荧光染料对细菌进行核染,以市售的黑色钢笔墨水替代伊拉克黑,利用手动压片方式对标本进行固定,自建一种"活的非可培养状态"(VBNC)细菌荧光显微镜观察技术。通过总结分析该项技术方法在应用过程中所出现的问题,如存在背景荧光、菌体聚集、荧光图像模糊、滤膜吸附能力差、菌体形态不鲜明、菌体荧光减淡等,并提出相应的解决策略,旨在给予相关研究者以帮助和启迪。     

"活的非可培养状态"细菌荧光观察方法

目的：建立一套稳定、简便、快捷,可靠的细菌活的非可培养状态（VBNC）荧光显微镜观察方法。利用市售的黑色钢笔墨水着染微孔滤膜,然后采用手动压片方式,将经LIVE/DEAD BacLightTM Bacterial Viability Kit（13152）染色的细菌样本固定在滤膜上,用落射荧光显微镜直接观察。结果：该法所得的荧光图像背景无光亮且黑暗,菌体荧光、形态、排列等均清晰可见,而且呈现绿色荧光的活菌与呈现红色荧光的死菌较易分辨。与现行技术相比,还能缩短染色时间近12～16h。结论：建立的VBNC细菌荧光观察方法能有效地克服现有技术存在的适用范围狭窄、取材困难、观察结果不准确、操作时间长等缺点,可为细菌VBNC研究提供值得借鉴的方法。     

荧光膜片钳新技术的应用及进展

荧光膜片钳(patch-clamp fluorometry,PCF)是将离子通道蛋白局部的构象变化和门控紧密结合,实时记录同一膜片上离子通道的荧光和电流信号的创新型生物物理学技术,其特点是将经典的膜片钳和现代光学记录结合起来,实时同步完美呈现离子通道执行其功能时的蛋白质构象信息.与研究结构的X射线和冰冻电镜不同,荧光膜片钳提供离子通道处于真实细胞膜生理环境并执行功能的实时动态结构信息.随着新的光学技术、显微成像技术、图像分析技术等的进步,大大地扩展了荧光膜片钳技术的记录范围、分辨精度及敏感度,使研究者以前所未有的时空分辨率来实时观察和记录离子通道蛋白的结构变化.     

一种新型的DNA荧光染料—DAPI的光学特性及其应用

近年来,由于荧光显微镜的改进,荧光染料的不断增多以及免疫荧光技术的发展,荧光显微术已在细胞生物学的研究中广泛应用。荧光显微术用于研究细胞核和染色体已有较长的历史,不过目前除了哺乳类染色体分带荧光技术和孚尔根型荧光染色有所发展外,曾经使用过的一些核的荧光染色方法已应用不多。     

荧光单分子检测技术在生命科学中的应用

荧光单分子检测技术是用荧光标记来显示和追踪单个分子的构象变化、动力学,单分子之间的相互作用以及单分子操纵的研究。过去对于生命科学分子机制的研究,都是对分子群体进行研究,然后平均化来进行单分子估测。因此,单个分子的动态性和独立性也被平均化掉而无法表现出来。荧光单分子检测技术真正实现了对单个分子的实时观测,将过去被平均化并隐藏在群体测量中不能获得的信息显示出来。近几年来,荧光单分子检测技术的飞速发展,为生命科学的发展,开辟了全新的研究领域。现就荧光单分子检测技术在研究动力蛋白、DNA转录、酶反应、蛋白质动态性和细胞信号转导方面的应用进展作一综述。     

珊瑚和海葵来源红荧光蛋白的研究和应用

绿色荧光蛋白作为标记蛋白和报告蛋白在生物学研究中应用越来越广。但在荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)等技术中存在一些缺陷,需要更大波长范围的荧光蛋白。最近研究发现了多种来源于珊瑚和海葵的红荧光蛋白,这些长波长的荧光蛋白对绿色荧光蛋白是一种很好的代替和补充,可以实现细胞内多荧光标记,提供更理想的FRET荧光对。经随机突变和定点突变等方法改建获得的红荧光蛋白变种显示出更高的荧光强度,成熟时间也更短。目前应用较多的是来源于香菇珊瑚(Discosomasp.)的红荧光蛋白DsRed。     

绿色荧光蛋白与人肾脏NaDC3融合基因的构建及其在肾小管上皮细胞中的定位

本采用RT-PCR方法从人的正常肾组织中扩增出hNaDC3基因全长cDNA序列,采用基因重组技术将hNaDC3基因和绿色荧光蛋白基因融合,通过真核表达质粒—脂质体介导,导入LLC-PKl细胞系,激光共聚焦显微镜动态观察GFP—hNaDC3的定位情况。结果显示PKGFP-C3空白质粒转染的LLC—PKl细胞表达了GFP,GFP在胞内分布以核浆为主,呈均匀致密的细颗粒荧光,胞核染色强,核仁荧光稀少,界线清楚。而pKGFP-C3-hNaDC3转染细胞株的绿色荧光蛋白,转染后第1天混合分布于细胞浆和细胞膜,以粗颗粒荧光为主,两界限不清楚,胞浆中可见未染色的圆形空洞,未见胞核染色;第3天主要聚集于细胞膜,核周的胞浆中可见粗颗粒荧光物质,胞浆和胞膜界线清楚,胞核亦未见绿色荧光蛋白;第5天清晰聚集于细胞膜,细胞膜连接至网状。因此hNaDC3蛋白在细胞质中生成后,定位于细胞膜并稳定表达。     

基于荧光强度快速判断蛋白可溶性方法的建立

目的:建立一种通过观察荧光强度,快速、直观地判断蛋白可溶性的方法。方法:选择抗辐射蛋白CBL502-AA及其突变体CBL502-ΔAA′作为目的蛋白,增强型绿色荧光蛋白作为报告分子,分别构建融合蛋白表达载体;通过SDS-PAGE和荧光观察两种手段检测和比较融合蛋白的可溶性。结果:荧光观察融合蛋白的可溶性与SDS-PAGE检测结果一致。结论:建立了一种基于荧光强度,快速、简单、直观的比较蛋白可溶性的方法。     

应用重组表达钙离子敏感蛋白YC2.1研究粟酒裂殖酵母细胞内钙离子浓度的分布

把重组表达钙离子敏感蛋白的YC2．1基因（yellow cameleon 2．1）导入了粟酒裂殖酵母中,观察了粟酒裂殖酵母细胞内钙离子浓度的分布。结果发现,钙离子敏感蛋白所指示的钙离子呈细胞周缘胞质较高浓度分布,而在细胞胞质中部的钙离子浓度相对低一些。通过DAPI染色实验证实这是由于胞质中部细胞核的填充而形成。fluo-3染色的裂殖酵母细胞,由于fluo-3进入到细胞器（房室化现象）,所以出现胞质的内部区域高的荧光信号,而在周缘的胞质区相对弱,不能真实反应胞质钙离子的分布。因此重组表达钙离子敏感蛋白测定钙离子的方法优于fluo-3荧光探针的方法,对于裂殖酵母细胞胞内钙离子的研究具有良好的应用前景。