霍乱毒素无毒B亚单位（CTB）黏膜免疫佐剂的研究进展

霍乱毒素（CT）具有很强的黏膜免疫佐剂活性,是当今研究热点之一,但CT的黏膜免疫佐剂效应机理尚未完全弄清。本文主要就霍乱毒素无毒B亚单位（CTB）的黏膜免疫佐剂作用进行综述。     

霍乱毒素佐剂的研究进展

霍乱毒素（CT）是霍乱弧菌分泌的一种不耐热肠毒素,具有很强的免疫原性和佐剂活性,是当今研究得最多且最深入的粘膜免疫佐剂之一,CT本身有很强的毒副作用,而一定的毒性又似乎是发挥佐剂作用所必须的。通过各种改造,使之具备优良的佐剂活性而没有显的毒副作用是当前研究的主要目标。本从CT作为佐剂的作用机理出发,概述当前对其进行改造的几种研究方向。     

霍乱毒素B亚基基因上游序列对B亚基表达水平的影响

本研究通过缺失突变和移码突变研究了ｃｔｘ Ｂ基因上游Ａ基因部分序列对ｃｔｘＢ表达水平的影响,结果表明：（１）将霍乱毒素操纵子ＸｂａＩ－ＥｃｏＲｉ片段克隆至ｐＵＣ１９,构建的质粒ｐＵＣ１９ＣＴＢ中Ａ亚基的部分序列不能翻译,该质粒转化大肠菌后的ＣＴＢ的表达产量为３０μｇ／μｌ;（２）在质粒ｐＵＣ１９ＣＴＢ的ＸｂａＩ位点引入移码突变,构建质粒ｐＭＣ０２Ｃ,使Ａ亚基基因部分序列能够翻译至自然的终止密码,Ｂ     

纯化重组霍乱毒素B亚单位与天然霍乱毒素B亚单位性质的对比研究

霍乱毒素Ｂ亚单位（ＢＳ）已用于新型口服霍乱疫苗、佐剂及蛋白质载体,但成本高,来源困难．用重组霍乱毒素Ｂ亚单位（ｒＢＳ）代替ＢＳ可克服上述缺点．ｒＢＳ用于上述目的前必须证实其在物理、化学及免疫学性质方面与天然同类产品的一致性．用亲和层析法从各批次大罐发酵所获工程菌Ｅ．ｃｏｌｉＭＭ２（ｐＭＭ－ＣＴＢ）培养物上清中制备得到了小批量ｒＢＳ纯品,在同等条件下与ＢＳ（Ｓｉｇ－ｍａ公司产品）进行理化、免疫学性质的对比研究,证实二者在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中电泳带位置一致、分子量相同,纯度达９９％;在反相ＨＰＬＣ中出峰行为一致,纯度达１００％;在半干式聚焦电泳分析中电泳带分布相同,等电点为７．９１．ｒＢＳＮ端起的２０个氨基酸序列为ＴＰＱＮＩＴＤＬＣＡＥＹＨＮＴＱＩＨＴＬ,与克隆基因来源株的毒素Ｂ亚单位同一段序列完全一致．氨基酸组成分析证实ｒＢＳ与ＢＳ相近．在免疫学性质分析中,ｒＢＳ与ＢＳ在免疫双扩散试验中与抗ＣＴ均出一条沉淀线且相互吻合;在免疫电泳试验中二者与抗ＣＴ在相应位置上产生一条沉淀弧;二者均能与神经节苷脂ＧＭ１结合且这种结合均可通过二者与抗ＣＴ的预保温处理而被阻断．对比研究结果揭示ｒＢＳ与ＢＳ性质完全一致,可代替ＢＳ用于     

碳源和IPTG诱导对工程菌MM2表达CTB的影响

研究了不同碳源如葡萄糖、乳酸和乙酸以及IPTG诱导对工程菌MM2表达霍乱毒素B亚单位(CTB)的影响。在YC培养基中分别加入0.048mol/L的葡萄糖、0.102mol/L的乳酸和0.167mol/L的乙酸,它们在完全氧化后可产生相同的能量。结果表明,加入葡萄糖会大幅度降低ctb基因的表达水平,其原因和培养过程中pH值下降有关;加入乳酸可提高ctb基因表达水平1.15倍,且不抑制菌体生长;加入乙酸可提高ctb基因的表达水平0.9倍,但对菌体生长有抑制作用。不同时间及不同浓度的IPTG诱导未能提高ctb基因的表达水平,说明lac启动子对ctb基因的表达没有影响或影响很小。     

霍乱弧菌肠毒素基因在大肠杆菌的表达

霍乱毒素基因在大肠杆菌获得了表达,在大肠杆菌中产生的毒素,具有霍乱毒素同样的生物活性、抗原性和免疫原性。但它产生的霍乱毒索,90％是保持在胞内的,其毒性可被胰酶激活。     

产生霍乱毒素B亚单位(CT—B)工程菌的发酵条件

高效表达霍乱毒索B亚单位的工程菌MM2菌株．在玉米浆培养基中能高效合成B亚单位,观察了吸光度(OD)、pH及B亚单位产生的动态变化。玉米浆培养基不仅成本低、制备工艺简易,而且B亚单位产量高,在50L发酵罐中培养,B亚单位产量可达40μg／mL。     

粘膜耐受在预防和治疗自身免疫病中的作用

粘膜应用自身抗原诱导外周免疫耐受状态 ,依赖应用抗原剂量 ,诱导产生两种粘膜耐受机制 :高剂量偏向产生T细胞克隆无能 /排除 ,低剂量偏向产生分泌抑制性细胞因子(TGF β ,IL 4,IL 10 )的T细胞克隆扩增。大量研究表明鼻内或口服应用抗原诱导粘膜耐受可有效预防几种实验性自身免疫病 (EAE ,EAMG ,EAN ,EAU ,IDDM和CIA) ,在同等剂量鼻内应用比口服诱导粘膜耐受更有效。基于动物实验结果 ,对人类自身免疫病MS、RA和葡萄膜炎的临床试验正在进行。耐受原与CTB偶联可拓宽粘膜耐受的有效性 ,加强对临床疾病的抑制。然而 ,粘膜免疫与抗原应用途径、种类和疾病发病时间有关 ,可能表现为双重作用 ,尤其在发展中的自身免疫病 ,粘膜应用抗原可能加重病情。     

重组霍乱毒素B亚基与疟原虫多表位融合蛋白的免疫保护作用研究

对以霍乱毒素B亚基为载体蛋白的重组疟疾多价抗原在小鼠及恒河猴中的免疫原性及对相应疟原虫感染的免疫保护作用进行了研究。结果表明：该抗原免疫小鼠后,对约氏疟子孢子攻击的保护率在50%左右;恒河猴免疫后用1×10⁸食蟹疟裂殖子攻击,对照组2只动物在攻击后4d感染,感染持续30d以上;免疫组2只动物中,两只动物在感染6～7d后完全恢复,且1只推迟3d感染,说明该抗原具有免疫保护作用。     

利用ctxb的自身启动子表达CTB

霍乱毒素B亚单位（CTB）在大肠杆菌表达体系中不能实现良好的分泌性表达。本文拟利用ctxb的自身启动子来实现CTB的高效分泌性表达。PCR方法扩增ctxb的调控序列和结构基因,克隆至pGEM－T载体,并在其下游链上肠杆菌核糖体基因的转录终止信号rmBT1T2,构建的表达质粒pGEM－T48和霍乱弧菌IEM101都实现了CTB的分泌性表达。但在pGEM－T48＊TEM101）中CTB的分泌性表达量明显高于pGEM－T48（JM109）中的量,两者比较为50：1。因此,pGEM-T48(IEM101)表达体系较为理想的CTB分泌性表达体系。     

霍乱毒素B亚基基因具有自己的启动子

本研究发现并证实霍乱毒素Ｂ亚基基因上游ＸｂａＩ～ＣｌａＩ限制性片段内存在具有启动子活性的序列;在该启动子作用下,霍乱毒素Ｂ亚基表达水平可达２００ｍｇ／Ｌ,氯霉素乙酰基转移酶基因表达水平随培养条件不同在０．３～１０ｍｇ／Ｌ之间,大肠杆菌β－半乳糖苷酶基因的表达量达４１００单位／ｍｌ。在该启动子的控制下霍乱毒素Ｂ亚基基因可以高效表达,该启动子的存在可能是霍乱毒素操纵子中霍乱毒素Ｂ亚基表达量是Ａ亚基的６倍的原因。     

霍乱毒素B亚基基因具有自己的启动子

本研究发现并证实霍乱毒素B亚基基因上游Xba Ⅰ～Cla Ⅰ限制性片段内存在具有启动子活性的序列;在该启动子作用下,霍乱毒素B亚基表达水平可达200mg/L,氯霉素乙酰基转移酶基因表达水平随培养条件不同在0.3～10mg/L之间,大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因的表达量达4100U/ml。在该启动子的控制下霍乱毒素B亚基基因可以高效表达,该启动子的存在可能是由于霍乱毒素操纵子中霍乱毒素B亚基表达量是A亚基的6倍。     

霍乱毒素(CT)基因探针的构建及其对霍乱弧菌的检测

用体外DNA重组技术构建了CT基因重组质粒pMM-CTII。应用XbaI/EcoRl双酶解,琼质糖凝胶制备电泳回收含C2基因的片段,以DNA缺口转译技术用a-32P标记的CT基因探针与01群霍乱弧菌经典型及埃尔托生物型产毒株杂交为阳性,与01群霍乱弧菌非产毒株及非01群无毒株杂交为阴性。对从临床及外环境分离的埃尔托霍乱弧菌进行了检测,流行株52株,检出率为92％;抗性株50株,检出率16％。显示利用CT基因分析较噬菌体分类更确切可靠。     

海水养殖真鲷最小弧菌外毒素的免疫学特性初步研究

按常规方法免疫健康家兔进行外毒素抗体的制备。将制备的兔抗血清与等体积的外毒素混合,37℃下作用1h后,观察毒素的溶血性及细胞毒性,取免疫前家兔血清(零号血清)作阴性对照,用毒素作阳性对照。结果表明,兔抗毒素血清能中和毒素,抑制毒素对人血细胞的溶血性及对Vero细胞的细胞毒性,中和毒素的兔抗毒素血清最高稀释度为1∶256,毒素对照显示出溶血性及细胞毒性。毒素与一定浓度的嗜水气单胞菌HEC毒素抗血清、霍乱肠毒素抗血清在37℃下分别作用1 h后,观察其溶血性及细胞毒性。结果表明,这2种抗血清都不能中和毒素,毒素与这2种抗血清作用后,仍然保持其溶血性及细胞毒性。用浓度为0.2%的福尔马林对浓度为5mg/mL的外毒素进行灭活处理,得到的灭活疫苗为毒素苗。一定稀释度的毒素苗,在初次免疫真鲷2周后利用病原菌对免疫组及对照组的实验鱼进行人工攻毒感染,毒素苗的免疫保护率可达80%,强化免疫后,免疫保护率有所提高。注射免疫的免疫保护率比浸泡免疫的高。     

AB5肠毒素A、B亚基比例表达调控机理的研究

霍乱毒素（ＣＴ）及大肠杆菌势不稳定甩的毒素（ＬＴ）的Ｂ亚基基因的表达水平是Ａ亚基的５￣７倍,研究发现Ａ基因内部存在着１个８０ｂｐ长的翻译控区,含有３个翻译起始序列（ＴＩＲ）,其第２个翻译起始序列的终止密码与第３个翻译起始序列的起始序列的起始密码重叠,因而形成翻译偶联,继续翻译至Ａ基因的终止密码。将ＴＩＲ３的超始密码ＡＴＧ突变为ＡＴＣ后ＴＩＲ２及ＴＩＲ３失去功能,这时下游报告基因（类似于ｃｔｘＡ、Ｂ     

视神经远端切断后再生视网膜节细胞Bcl-2的表达

目的　成年金黄地鼠视神经远端切断后再生视网膜节细胞 (RGCs)Bcl 2的表达与再生的关系。方法　远端切断视神经并对接一段自体坐骨神经 ,玻璃体内注射CTx及 /或植入小段坐骨神经分支 (SN)。动物随机分为AG +CTx组 ;AG +SN组 ;AG +SN +CTx组 ,各组动物分别存活 4W ,用粒蓝 (GB)逆行标记和Bcl 2免疫荧光组织化学双标法观察再生的RGCs和Bcl 2表达。结果　再生RGCs胞质内有Bcl 2蛋白表达 ,玻璃体内给予CTx或植入SN组表达Bcl 2的再生RGCs分别为 32 2± 4 71和 2 9 4± 3 75个 ,约占其再生总数的 82 5 0 %及 80 96 % ,两组相比无显著性差异 (P >0 0 5 ) ;CTx与SN联用组Bcl 2阳性再生的RGCs为 15 1 8± 35 6 9个 ,占再生总数的 91 2 2 % ,与前两组相比 ,均有显著性差异 (P <0 0 5 )。结论　视神经远端切断后约 80 %的再生RGCs有Bcl 2表达 ,提示Bcl 2表达可能与节细胞再生有密切关系。