一种简易的啮齿动物切趾编码方法

提出一套改进的切趾标志编码系统。该编码系统具有趾号易于判读、切趾分布均匀的优点。本套编号系统具有一定的兼容性 ,可根据样地内动物个体的数量选择最小的切趾数 ,从而尽可能减少切趾对小哺乳动物行为与生存的影响     

实验小鼠标记识别系统的优化

传统的实验小鼠标记识别系统包括染色法、打孔剪口法、刺花法、耳标签法和剪趾法等。随着小鼠作为动物模型在实验中广泛应用,人们对实验标记识别系统提出了简捷、易辨、持久、大编码量的新需求。本优化系统利用简单的数学方法改进剪趾法,使编码量扩大到9999,针对不同实验需求提供不同选择,并且在遵循动物福利的理念下,提出了一些建议。     

ENU诱变获得一种多趾小鼠及其突变基因的鉴定

采用化学诱变剂乙酰基亚硝基脲(N-ethyl-N-nitrosourea,ENU)获得一种常染色体显性遗传多趾突变小鼠(Mus musculus),该突变小鼠在后趾内侧(即轴前部)多出一个脚趾,且严重程度不一,部分小鼠双侧后足都有多趾表型。阿尔新蓝-茜素红染色结果表明,多趾突变杂合子小鼠除多趾异常发育外,其余骨骼无明显异常。为定位该突变基因,利用微卫星标记对(C57BL/6J×DBA/2J)F1代多趾突变小鼠回交C57BL/6J得到的[(C57BL/6J×DBA/2J)F1×C57BL/6J]N2代多趾小鼠进行全基因组扫描,最终将本例多趾突变基因定位于小鼠第2号染色体微卫星D2mit45与D2mit184之间,并初步确定Alx4为该突变候选基因。在此基础上对Alx4进行测序分析,测序结果发现突变小鼠Alx4基因编码区第433位碱基处发生A到T的颠换,导致编码区第145位密码子AAA(编码赖氨酸)变为终止密码子TAA,引起蛋白编码提前终止,是引起多趾表型的原因。     

内含子编码蛋白与内含子的转移

具有自我剪接能力的Ⅰ型和Ⅱ型内含有编码蛋白质的功能,Ⅰ型内含子编码成熟酶和核酸内切酶,后者参与Ⅰ型与含子的归巢。Ⅱ型内含子编码的蛋白质呈现成熟酶核酸内切酶和逆转录酶活性,三种活性都在Ⅱ型内含子归巢中和用。     

内含子编码蛋白与内含子的转移

具有自我剪接能力的Ⅰ型和Ⅱ型内含子有编码蛋白质的功能。Ⅰ型内含子编码成熟酶和核酸内切酶,后者参与Ⅰ型内含子的归巢。Ⅱ型内含子编码的蛋白质呈现成熟酶核酸内切酶和逆转录酶活性,三种活性都在Ⅱ型内含子归巢中起作用。除归巢外,Ⅰ型和Ⅱ型内含子的转移还表现为转位和丢失。内含子作为可转移遗传因子,可能在进化中有一定的意义。     

大鼠脑α1型甲状腺激素受体基因cDNA克隆及序列分析

使用ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆了Ｗｉｓｔａｒ大鼠脑α１型甲状腺激素受体的ｃＤＮＡ,得到包含起始及终止密码子共１２３３ｂｐ、编码４０９个氨基酸的受体全长编码离列,酶切分析后,将此特异ＤＮＡ片段重组入质粒ｐＵＣ系统,得重组质料ｐＴＲＡ。双脱氧末端终止法测定了全部核苷酸顺序。     

防止发酵细菌受噬菌体污染

有些运载体携带着保护发酵细菌不受噬菌体污染的基因,这些基因编码诸如溶血嗜血菌(Haemophilus haemolyticus)Hhall系统之类的细菌限制——修饰性的序列。它们产生限制性内切酶在限制性位点上消化噬菌体的DNA。     

真菌线粒体cob中Ⅱ型LAGLIDADG归巢内切酶进化分析

以已公布的114种真菌线粒体基因组数据为依据,对cob内含子及其编码的Ⅱ型LAGLIDADG归巢内切酶进行全面分析,以揭示其进化规律。在cob内含子中共发现27个Ⅱ型LAGLIDADG归巢内切酶基因,其中18个位于S433内含子插入位点,其余9个散布在另外8个插入位点。结合Pfam数据,将Ⅱ型LAGLIDADG归巢内切酶分成10个主要类群,其中4个类群存在不同生物界物种间的水平迁移。S433位点的18个归巢内切酶均属于类群1,它们与宿主内含子可能从共同祖先垂直遗传而来,并在传递过程中伴有水平迁移;其他归巢内切酶及宿主内含子则应是水平迁移的结果。类群1中的归巢内切酶可分为两个亚类,两亚类识别的靶序列存在明显差异;保守模体氨基酸序列分析显示它们大多数具有潜在内切酶活性。全面呈现了真菌线粒体cob内含子及其编码的Ⅱ型LAGLIDADG归巢内切酶的存在状态和进化模式,为归巢内切酶的改造和设计提供了新素材。     

人巨细胞病毒糖蛋白52kD抗原编码区段在大肠杆菌中高效表达

采用聚合酶链反应,从人巨细胞病毒重组质粒克隆pBH中扩增并分离了含糖蛋白52kD抗原编码区段;扩增产物经纯化和EcoR Ⅰ酶切后,与相同酶切的高效表达质粒pBV-220重组,构成含人巨细胞病毒糖蛋白52kD抗原编码区段的高效表达质粒pHcMV 52;用此重组表达质粒转化大肠杆菌JM101,经增殖和42℃温度诱导以及筛选。阳性克隆经12.5％SDS-PAGE表明,外源基因表达蛋白质量占菌体溶解液中蛋白质总量20％。蛋白质印迹(western blot)杂交证实该表达产物具有免疫原性。     

人肠道病毒D68型微复制子的建立

建立人肠道病毒D68型(EV-D68)微复制子体系。利用增强绿色荧光蛋白(EGFP)或萤火虫荧光素酶(FLuc)报告基因替换病毒编码区,通过酶切连接,构建EV-D68 T7和PolⅠ系统微复制子体系,获得重组质粒pT7-miniEGFP、pT7-miniFLuc、pHH21-miniEGFP、pHH21-miniFLuc和pHH21-miniFLuc_(ΔpolyC)。微复制子转染RD细胞,48h后荧光显微镜观察EGFP表达情况或用双报告系统检测荧光素酶表达水平。T7和PolⅠ系统微复制子均可表达报告基因,但PolⅠ系统荧光素酶表达水平是T7系统的5倍。并且病毒非编码区的PolyC区域对于病毒蛋白的表达起着重要的作用。本研究成功构建了EV-D68微复制子体系,为EV-D68非编码区功能研究提供工具。     

水稻基因组上一个Ds切离及其双位点插入行为的分子鉴定

玉米转座元件Ac/Ds是hAT转座子家族的成员, 导入水稻基因组后具有转座活性, 尽管转座机制还不完全清楚, 但它们通常经保守的非复制型“剪切-粘贴”过程转座。研究表明, 在Ac编码的转座酶作用下, Ds从原位点切离后常优先重新插入到连锁位点。文章利用TAIL-PCR技术从水稻一个Ds插入突变体及其回复突变体中分离Ds侧翼序列, 结合生物信息学分析方法, 对Ds在突变体上插入位点、回复突变体内切离足迹和重新插入位点进行了分子鉴定。结果显示, 突变体中Ds从3号染色体切离后, 在原插入位点残留了8 bp足迹序列(CATCATGA), 引起Ds标记基因外显子和内含子数目增加, 从而影响基因结构。切离后的Ds重新插入回复突变体第2和第6号染色体上, 分别编码烟草胺氨基转移酶和衰老相关蛋白的2个基因的编码区。因此, 典型的“剪切-粘贴”机制不能完全解释Ds的转座行为, Ds转座存在“剪切-复制-粘贴”的特点。     

重组人胱抑素C的原核表达及鉴定

目的构建重组人胱抑素C（cystatinC,CysC）的原核高效表达质粒,诱导表达并纯化获得CysC重组蛋白。方法根据大肠埃希菌编码蛋白的特性设计CysC编码基因序列,人工合成目的基因克隆至pET-22b（＋）表达载体中,测序及酶切鉴定正确后诱导其在大肠埃希菌BL21中表达,所获得的包涵体蛋白经亲和层析纯化后采用SDS—PAGE及Western印迹鉴定。结果酶切结果证实构建的表达质粒结构正确;测序结果显示克隆的基因序列所编码的蛋白与GenBank中的CysC氨基酸序列相符;SDS-PAGE及Western印迹结果证实获得的重组CysC融合蛋白分子量约为16kD,经NP亲和层析纯化获得纯度大于90％的目的蛋白。结论建立了重组人CysC的原核高效表达系统并获得了CysC重组蛋白。     

RT-PCR和酶切方法区分猪瘟疫苗毒与野毒的研究*

建立了套式RT-PCR与限制性内切酶酶切相结合的区别猪瘟兔化弱毒疫苗株与猪瘟病毒田间分离株的诊断方法。通过对猪瘟兔化弱毒疫苗株与猪瘟石门株E2基因主要抗原编码区序列进行限制性内切酶酶切位点分析,分别找出猪瘟兔化弱毒疫苗株与猪瘟石门株各自独有的限制性内切酶酶切位点,结果二者分别有10和16个独有的限制性内切酶的酶切位点;分别对17株猪瘟病毒E2基因主要抗原编码区序列进行这26个限制性内切酶酶切位点分析,结果表明有3个限制性内切酶(HgaI、Hin8I及Hsp92I)     

RT-PCR和酶切方法区分猪瘟疫苗毒与野毒的研究

建立了套式RT-PCR与限制性内切酶酶切相结合的区别猪瘟兔化弱毒疫苗株与猪瘟病毒田间分离株的诊断方法。通过对猪瘟兔化弱毒疫苗株与猪瘟石门株E2基因主要抗原编码区序列进行限制性内切酶酶切位点分析,分别找出猪瘟兔化弱毒疫苗株与猪瘟石门株各自独有的限制性内切酶酶切位点,结果二者分别有10和16个独有的限制性内切酶的酶切位点;分别对17株猪瘟病毒E2基因主要抗原编码区序列进行这26个限制性内切酶酶切位点分析,结果表明有3个限制性内切酶（HgaI、Hin8I及Hsp92I）的酶切位点在HCLV株序列是独有的;利用HgaI限制性内切酶分别对HCLV、HCVSM及5株不同基因群的猪瘟病毒田间分离株进行酶切鉴定,结果只有HCLV株能够被HgaI酶切成2个片段,而其它的毒株则不能被切开。同时测定了套式RT-PCR方法的敏感性及特异性,结果其敏感性可达到0．2MLD,而对BDV以及BVDV均不能特异扩增。本方法的建立无疑对猪瘟在我国的控制和消灭具有重要的意义。     

叶绿体DNA的限制性内切酶谱分析在植物系统分类学中的应用

业已证明,叶绿体DNA为一共轭闭合环状分子。绝大多数植物叶绿体DNA均含有一对反向重复序列。对于所有已检测过的植物,叶绿体基因组所编码的基因数量、基因组成和基因排列是基本一致的。这表明叶绿体DNA具有进化上的保守性。由于其进化上的保守性,叶绿体DNA常为研究层次较高的分类单位间(属间、科间、目间、纲间等)进化关系和进化历史提供较准确的信息。1976年,Vedel等首先建立了叶绿体DNA的内切酶谱分析方法,并将其应用于植物系统分类学中。Vedel等用限制酶ECoRI酶切从豌豆     

新疆雪莲新的内切几丁质酶类冷诱导基因的分离、克隆和测序

通过RT-PCR技术,从经低温驯化的新疆雪莲的叶片中分离克隆了1个新的基因.实验证明,此基因的转录是由低温诱导激活,且随着雪莲低温驯化时间的推移,转录本的量明显增加.测序结果显示,此基因全长643 bp,编码200个氨基酸.序列分析发现,此基因属于Ⅱ类内切几丁质酶基因.初步预测此基因的编码产物可能具有抗冻活性.     

小鼠白细胞介素-33基因的克隆及序列分析

目的:克隆小鼠IL-33基因全长编码区cDNA,并对其进行序列分析。方法:从BALB/c小鼠的脊髓组织中提取总RNA,逆转录为cDNA,用热启动PCR技术,扩增小鼠IL-33基因全长编码区cDNA,经双酶切后,克隆入pcDNA3.1( )载体中,构建真核表达载体pcDNA3.1-mIL-33,然后进行酶切鉴定与序列分析。结果:小鼠IL-33基因的PCR产物和重组载体经凝胶电泳和酶切鉴定、测序分析证实,其序列与GenBank中数据一致。小鼠IL-33基因的全长编码序列为801 bp,编码266个氨基酸。结论:小鼠IL-33基因成功的克隆并构建了其真核表达载体,为进一步进行IL-33的表达与功能研究奠定了基础。     

人前胰岛素原双链cDNA克隆的分离和鉴定

我们从人胰岛肿瘤组织eDNA基因库中分离到一个编码人前胰岛素原的双链eDNA克隆。限制性内切酶片段分析和DNA顺序分析均证明这是一个编码人前胰岛素原的cDNA克隆。该克隆中前胰岛素原编码顺序与β－内酰胺酶基因方向相同。     

福寿螺（Ampullaria crossean）内源性多功能纤维素酶基因的克隆

迄今为止已克隆的动物纤维素酶基因都是编码内切—β—1,4—葡聚糖酶或β—葡萄糖苷酶的,还没有有关动物外切—β—1,4—葡聚糖酶基因的报道。并且,动物是否对植物细胞壁的另一主要成分木聚糖具有水解能力也依然是个疑问。已经由草食性软体动物福寿螺的胃液中纯化得到一种纤维素酶,该酶同时具有外切β—1,4—葡聚糖酶、内切β—1,4—葡聚糖酶和内切β—1,4—木聚糖酶等三种活性,是一种多功能纤维素酶(命名为EGX)。在此基础上,从福寿螺胃组织中克隆得到的EGX cDNA开放阅读框全长为1185bp,共编码395个氨基酸。由氨基酸顺序同源和活性部位的保守顺序的比较分析,EGX可归属于糖苷水解酶第10家族。该多功能纤维素酶cDNA在毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达的产物具有水解外切β—1,4—葡聚糖酶底物(pNPC),羧甲基纤维素(内切β—1,4—葡聚糖酶的底物)和木聚糖(木聚糖酶的底物)的活力。另外也从福寿螺卵巢组织中获得编码福寿螺多功能纤维素酶．EGX基因,长度为4892bp,含有9个外显子和8个内含子。8个内含子分别位于开放阅读框的74bp、122bp、280bp、336bp、473bp、646bp、753bp和972bp处。以上结果证明了多功能纤维素酶EGX是福寿螺自身产生的,同时也证明了福寿螺具有与微生物相似的纤维素酶系,即也含有内源性的外切β—1,4—葡聚糖酶活力组分。     

藏鸡线粒体全基因组序列的测定和分析

通过PCR扩增,测序,拼接,获得藏鸡（Tibetan Chicken）线粒体全基因组序列并进行数据分析处理。藏鸡线粒体全基因组序列全长16783bp,共有13个蛋白质编码基因、2个rRNA基因、22个tRNA基因和1个D-loop区。模拟电子酶切结果显示,藏鸡DraI酶的酶切结果和先前报道的原鸡,茶花鸡,尼西鸡和大理漾濞黄鸡的酶切结果都不相同,为藏鸡特有。基于D-loop区全序列和13个蛋白质编码基因序列,采用N-J算法与原鸡属4个种,3个亚种和3个家鸡品系构建系统进化树：初步确定藏鸡起源于红原鸡,与家鸡中的来航鸡、白洛克鸡亲缘关系最近,但是藏鸡的进化与来航鸡、白洛克鸡这两个家鸡品系又显得相对独立。推测可能原因是藏鸡的祖先在进入高原以后处于相对封闭的环境,从而形成了独特群体遗传特性。