口服草原兔尾鼠卵透明带3纳米乳剂DNA疫苗免疫效果研究

用免疫不育疫苗控制有害动物的数量成为动物种群数量控制的一个有效措施,对于大多数动物来说．口服饵料发送系统是最好的选择。但是口服疫苗容易产生耐受,且生物利用度低,利用多聚物包裹口服疫苗是一种打破口服耐受．提高其生物利用度的新途径。本文以纳米乳剂作为草原兔尾鼠卵透明带3（Lugurus zone pellucida 3,LZP3）DNA疫苗的发送载体,探讨通过口服途径增强小鼠的免疫效果和抗生育率。用纳米乳剂包裹lzp3 DNA疫苗后,采用强阴离子交换色谱法测定纳米乳剂的包封率．将制备好的质粒纳米乳剂lzp3 DNA疫苗通过口服饵料免疫小鼠,检测到免疫后小鼠的体内产生了特异性的抗LZP3的IgG和IgA。对免疫后小鼠进行抗生育实验,分析生育后免疫小鼠的卵巢病理切片。研究结果表明,用质粒纳米乳剂如p3DNA疫苗通过口服途径免疫．在小鼠的血清和粘液中检测到了特异性的抗LZP3的IgG和IgA,同时也产生了相应的抗生育作用．表明纳米乳剂作为口服不育疫苗的发送载体是可行的,为草原兔尾鼠鼠害的防治提供了理论基础．     

草原兔尾鼠和昆明白小鼠卵透明带3 DNA疫苗免疫不育效果的研究

为探讨不同种类小鼠卵透明带3（zp,）的免疫不育效果,并筛选高效且具有物种特异性的DNA抗生育疫苗,本研究选择草原兔尾鼠卵透明带3（Lzp3）和昆明白小鼠卵透明带3（Mzp3）构建不同的DNA抗生育疫苗表达载体,pcDNA3-mzp3（pcD-M）、pcDNA3-1zp3（pcD-L）、pcDNA3-aat-comp-mzp3（pcD-ACM）和pcDNA3-aat-comp-lzp3（pcD-ACL）分别免疫NIH小白鼠。研究中用水动力转染技术取代传统的Hela细胞真核转染检测小鼠体内真核表达情况．结果表明四种质粒均能在小鼠肝脏中进行表达;ELISA图示表明重组质粒均能使小鼠激发较高水平的特异性抗体;抗生育结果表明四种DNA疫苗均具有免疫不育的效果（P〈0．05）,其中pcDNA3-aat-comp-mzp3（pcD-ACM）的免疫效果最好（P〈0．01）;卵巢病理切片H．E染色结果显示pcD-M和pcD-L组卵巢结构与对照小鼠区别不大,而pcD-ACL和pcD-ACM组卵巢结构发生病理性变化。结果初步说明草原兔尾鼠和昆明白小鼠卵透明带3对NIH小白鼠均有抗生育效果,但不具有物种特异性。     

草原兔尾鼠卵透明带3基因原核表达条件的优化

目的：通过大肠杆菌原核表达系统制备草原兔尾鼠卵透明带3（LZP3）融合蛋白,作为草原兔尾鼠疫苗免疫抗生育研究的抗原物质。方法：将LZP3基因的核心片段构建到融合表达载体pGEX-4T-1K中GST的3’端,形成GST-LZP3融合基因,经本科切鉴定和序列分析证实基因序列的正确性。在不同温度,不同时间和不同IPTG浓度进行诱导后,用SDS-PAGE检测融合蛋白的表达,发现有一条分子量约63kD的新增蛋白条带。结果：研究表明在37℃,25℃的不同温度条件下均能诱导出LZP3蛋白,经SDS-PAGE和间接ELISA法检测,初步证明了LZP3基因能够在大肠杆菌中有效表达可溶性的融合蛋白。结论：获得了LZP3融合蛋白表达的最佳诱导条件,为大量诱导产生LZP3融合蛋白奠定了理论基础。     

壳聚糖介导增强DNA疫苗皮肤免疫效果的研究

目的:探讨壳聚糖(chitosan)包裹DNA疫苗皮肤免疫效果。方法:以chitosan包裹不同的草原兔尾鼠卵透明带3(LZP3)基因DNA疫苗pcDNA3-Lzp3(pLzp3)和pLC,通过皮肤擦拭免疫小鼠,以ELISA方法检测抗体水平,对卵巢做病理切片检测。结果:ELISA结果显示用chitosan包裹的pLC组在皮肤免疫中显示出优势,卵巢病理切片结果正常。结论:Chitosan包裹质粒皮肤免疫小鼠较纯质粒免疫效果更为显著。     

靶向鼻腔树突细胞的F1t3配体作佐剂激发抗致死性肺炎球菌性肺炎保护

作者以往的研究证明以肺炎球菌表面蛋白A（PspA）为基础的疫苗含有编码Flt3配体（FL）基因的DNA质粒（pFL）,这种DNA质粒可作为一种鼻腔佐剂,该疫苗能够预防肺炎链球菌在鼻腔的定植。在本项研究中,作者进一步研究了这种鼻腔投递疫苗在小鼠模型中诱导抗肺炎链球菌肺部感染的PspA特异性抗体应答的有效性及安全性,C57BL／6小鼠鼻腔免疫重组PspA／Rxl（rPspA）加pFL,免疫3次,间隔1周。     

梅毒螺旋体外膜蛋白Gpd基因的克隆、表达及其免疫活性研究

利用PCR技术从Tp Nichols株基因组模板中扩增梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)外膜蛋白Gpd基因,定向克隆构建真核表达重组体pcDNA3.1( )-Gpd,免疫印迹和免疫组化技术检测pcDNA3.1( )-Gpd在HeLa细胞中的表达;同时将真核表达重组体pcDNA3.1( )-Gpd免疫新西兰兔,检测其在兔体内的免疫应答效果。免疫印迹和免疫组化鉴定均显示重组体在HeLa细胞中能有效表达一个41kD的Gpd融合蛋白。新西兰兔接种核酸疫苗后,能产生特异性抗体,第3次免疫后2周抗体最高滴度可达1∶1024,免疫后兔脾细胞受Gpd蛋白刺激有明显增殖反应。所诱导的抗体水平和脾淋巴细胞增殖情况均显著高于空质粒对照组和空白对照组(p<0.05)。Tp真核表达重组体pcDNA3.1( )-Gpd的成功构建及能刺激新西兰兔产生较强特异的免疫应答,为Gpd蛋白生物学功能及梅毒DNA疫苗的深入研究奠定了一定的实验基础。     

C3d-M28增强伪狂犬病毒gC基因体液免疫

研究补体C3d的受体结合功能区(M28)对伪狂犬病毒gC基因DNA疫苗免疫增强作用。将4拷贝的M28基因与伪狂犬病毒gC基因串联后,克隆到载体pcDNA3.1中,构建融合表达的重组质粒(sgC-M284)。BALB/c小鼠免疫试验表明,sgC-M284免疫组比单独表达伪狂犬病毒gC蛋白的重组质粒(sgC)免疫组产生的ELISA抗体高17倍,对致死剂量(316LD50)伪狂犬病毒攻毒的保护率提高了63%。gC基因与M28基因融合表达诱导产生的IL-4水平接近了伪狂犬灭活疫苗免疫组的产生的IL-4水平,显著增强了基于Th2途径的体液免疫反应。     

糖基化与HCVE2诱导的体液免疫应答相关性的研究

检测丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)包膜蛋白E2糖基化位点对体液免疫功能的影响。野生型E2基因和糖基化突变体型E2基因的真核表达质粒DNA分别肌肉注射BALB/C小鼠,免疫3次,末次免疫后第10 d,眼眶摘眼球取血清,断椎处死小鼠,同时设阴性对照和空载质粒对照。血清标本用ELISA检测特异性IgG及其亚类IgG1I、gG2α表达水平,观测特异性体液免疫反应和脾细胞分泌细胞因子水平。与阴性对照和空载组对比,E2和N-糖基化突变体质粒DNA免疫小鼠都能诱导产生强烈的特异性免疫反应(P<0.01),并且N-糖基化突变体(560、576位糖基化突变体)质粒DNA与野生型E2相比,其特异性IgG效价明显降低(P<0.05),IL-4分泌水平明显降低(P<0.05)。E2糖蛋白的560、576位N-糖基化位点是诱导体液免疫反应所需要的,除去560、576位N-糖基化会降低E2诱导的体液免疫应答。     

幽门螺杆菌Lpp20-IL2核酸疫苗免疫活性

【目的】观察pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2免疫C57BL/6小鼠后所产生的体液免疫和细胞免疫应答水平,为研制高效、新型的幽门螺杆菌核酸疫苗提供实验依据。【方法】构建pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2重组载体,并转染HeLa细胞,用Western-blot观察鉴定其在真核细胞得到表达后免疫C57BL/6小鼠,ELISA间接法测定小鼠血清中抗Lpp20IgG抗体水平,ELISA双抗体夹心法检测脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ、IL4水平,MTT比色法检测脾淋巴细胞增殖反应,免疫荧光组化法检测Lpp20蛋白在小鼠肌肉组织中的表达情况。【结果】成功构建了pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2真核表达载体,且重组质粒能在HeLa细胞内有效表达目的蛋白;小鼠接种pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2核酸疫苗后能产生特异性IgG抗体,8w后ELISA测定血清抗体A450值明显升高。核酸疫苗pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2免疫组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,培养上清中IFN-γ、IL4含量明显升高。pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2和pcDNA3.1(+)/Lpp20核酸疫苗组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,刺激指数明显高于空质粒组和PBS组。Lpp20蛋白在小鼠肌肉组织中能够有效表达。【结论】幽门螺杆菌Lpp20-IL2融合基因核酸疫苗和Lpp20单基因核酸疫苗均能刺激机体产生较强细胞免疫应答和体液免疫应答,且前者能诱导更强的细胞免疫应答。     

C3d3通过促进脾脏B细胞高表达CXCR4增强hCGβ DNA免疫体液免疫效应

本文旨在探讨分子佐剂C3d3与hCGβ融合在基因免疫中增强抗hCGβ体液免疫效应的机制。分别用质粒pCMV4-hCGB-C3d3、pCMV4-hCGβ和pCMV4免疫BALB/c小鼠,间接ELISA法检测免疫小鼠外周血IgG/IgA类抗hCGβ抗体水平;ELISPOT分析免疫鼠脾脏组织IgG/IgA类抗体分泌细胞水平(ASC);RT-PCR分析免疫鼠脾脏B细胞趋化因子受体表达,RT-PCR和FCM分析CXCR4表达水平;RT-PCR和ELISA检测脾脏组织CXCL12表达水平。结果显示,pCMV4- hCGβ-C3d3免疫组外周血IgG类抗hCGβ抗体水平明显高于pCMV4-hCGβ免疫组;而IgA类抗hCGβ抗体水平在两组间无明显差异。pCMV4-hCGβ-C3d3免疫组脾脏组织IgG类ASCs水平明显高于pCMV4-hCGβ组;两组间IgA类ASCs水平无明显差异。经pCMV4-hCGB、pCMV4-hCGβ- C3d3免疫鼠脾脏B细胞CXCR4表达明显高于对照组;且pCMV4-hCGβ-C3d3组明显高于pCMV4-hCGβ免疫组。CXCR4~ 细胞与ASCs呈正相关,r=0.966,(P<0.05)。pCMV4-hCGβ-C3d3和pCMV4-hCGβ组脾脏组织CXC L12表达均显著高于对照组。结果表明,分子佐剂C3d3与hCGβ基因融合,在基因免疫小鼠后能够显著升调节脾脏ASCs CXCR4表达,从而可能增强抗hcGβ基因疫苗的体液免疫效应。     

封闭群草原兔尾鼠肝脏和胰腺的组织学观察

首次对封闭群草原兔尾鼠的肝脏、胰腺进行了组织学观察,结果表明：1．草原兔尾鼠的肝脏纤维组织极少,肝小叶间界限不明显;部分中央静脉周围可见少量毛细胆管;门管区较少,分布不均匀,其静脉形状不规则、腔大,胆管及动脉则较小。2．胰腺分叶清晰,腺泡细胞较大,胞浆多呈嗜酸染色;小叶中部腺泡着色较深,外侧腺泡着色较浅;胰岛大小不等,细胞排列呈不规则索状,光镜下未见特殊改变。     

Gene conjugation of molecular adjuvant C3d3 to hCGbeta increased the anti-hCGbeta Th2 and humoral immune response in DNA immunization

Human chorionic gonadotropin (hCG) has been used as an anti-fertility vaccine and as a target for cancer immunotherapy. We have explored the use of three copies of C3d in DNA vaccine as molecular adjuvant to improve the immunogenicity of this hormone in previous work and found that the immune response induced by pcDNA3-hCGbeta-C3d3 has been enhanced 243-fold compared with pcDNA3-hCGbeta following DNA immunization in BALB/c mice. In the present study, a new functionally active DNA vaccine of hCGbeta-C3d3 chimera based on pCMV4 vector has been described. We compared the expression efficiency of pCMV4 and pcDNA3 eukaryotic vectors for hCGbeta and hCGbeta-C3d3 fusion protein and the immune response of mice immunized with pcDNA3-hCGbeta, pCMV4-hCGbeta, pcDNA3-hCGbeta-C3d3 and pCMV4-hCGbeta-C3d3, respectively, at 25, 50 and 100 pmol dose, and further analyzed the levels of Th1 and Th2 cytokines produced by spleen lymphocytes of the immunized mice upon hCG restimulation in vitro. It was found that pCMV4 vector achieved 1.3-1.5-fold higher protein expression and raised 1.1-1.2 (primary) and 1.2-1.3 (booster) logs higher titer of anti-hCGbeta IgG than pcDNA3. Mice vaccinated with 50 pmol of hCGbeta-C3d3-DNAs elicited the highest titer of hCGbeta-specific antibody among the serial doses and the immune response induced by pCMV4-hCGbeta-C3d3 were, respectively, 1.3, 1.3 and 1.2 logs higher than that of pcDNA3-hCGbeta-C3d3 and 2.2, 2.9 and 2.4 logs higher than that of pCMV4-hCGbeta at week 2 following the booster immunization. Moreover, we observed that the production of IL-4 and IL-10 increased in mice vaccinated with hCGbeta-C3d3-DNAs and the ratio of IL-4/IFN-(gamma) showed a Th2 bias of immune response in the mice immunized with hCGbeta-C3d3-DNAs. These findings indicated that gene fusion of C3d3 to hCGbeta, as a means of harnessing the adjuvant potential of the innate immune system, may improve the antigen-specific Th2 humoral immune response of the hCGbeta DNA vaccine and the pCMV4 vector is a more ideal eukaryotic vector for DNA vaccine than pcDNA3.     

MAGE-3 DNA疫苗的构建及其免疫效果的观察

通过RT PCR方法扩增MAGE 3cDNA ,以pcDNA3 1+为载体 ,构建重组表达质粒pcDNA3 1 MAGE 3。重组质粒用脂质体转染鼠B16细胞 ,经RT PCR、细胞免疫染色及免疫印迹法鉴定转化细胞中MAGE 3的表达。以 10 0 μg质粒剂量肌肉注射接种小鼠 ,间隔 10天 ,共 3次 ,以空载体和PBS为对照。结果 ,重组质粒免疫的小鼠 ,其脾淋巴细胞对MAGE 3阳性靶细胞的杀伤活性为 51 0 8± 7 41% ,与空载体组 (8 44± 1 89% )及PBS组 (5 76± 1 75% )相比 ,差异有显著性 (P <0 0 1) ,而对MAGE 3阴性靶细胞的杀伤活性分别为 8 2 1± 1 65% ,7 68± 1 56%和 5 13±1 42 % ,其差异无显著性 ;MAGE 3DNA疫苗组免疫血清 1∶15稀释时能检测到抗MAGE 3抗体 ,脾细胞培养上清中Th1类细胞因子IFN γ、IL 2水平明显升高 ,外周血中CD4+、CD8+T细胞也提高 ,小鼠肿瘤的生长速度明显减慢 ,与对照组相比 ,差异显著 (P <0 0 1)。说明MAGE 3重组质粒免疫小鼠可以诱导小鼠产生特异性的体液和细胞免疫应答     

编码山羊补体C3d与口蹄疫病毒VP1融合蛋白重组质粒的构建及表达

旨在构建含分子佐剂山羊补体C3d基因的O型口蹄疫病毒VP1基因真核表达质粒。克隆山羊C3d基因, 通过linker(G4S)2将3拷贝C3d基因串联; 克隆羊源O型口蹄疫病毒VP1基因, 通过linker(G4S)2与3拷贝C3d基因相连, 构建重组质粒pUC19-VP1-C3d3。将VP1-C3d3融合基因亚克隆入含有分泌表达信号肽tPA序列的pcDNA3.1(+)CMV启动子下游, 构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-tPA-VP1-C3d3。在脂质体介导下, 将pcDNA3.1-tPA -VP1-C3d3转染HeLa细胞。间接免疫荧光分析表明, VP1- C3d3在HeLa细胞中获得了瞬时表达, Western blot分析证实转染的阳性细胞能分泌预期大小(133 kD)的融合蛋白。重组质粒pcDNA3.1-tPA-VP1-C3d3为研制以羊补体C3d为分子佐剂的口蹄疫新型疫苗奠定了基础。     

编码山羊补体C3d与口蹄疫病毒VP1融合蛋白重组质粒的构建及表达

旨在构建含分子佐剂山羊补体C3d基因的O型口蹄疫病毒VP1基因真核表达质粒。克隆山羊C3d基因, 通过linker(G4S)2将3拷贝C3d基因串联; 克隆羊源O型口蹄疫病毒VP1基因, 通过linker(G4S)2与3拷贝C3d基因相连, 构建重组质粒pUC19-VP1-C3d3。将VP1-C3d3融合基因亚克隆入含有分泌表达信号肽tPA序列的pcDNA3.1(+)CMV启动子下游, 构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-tPA-VP1-C3d3。在脂质体介导下, 将pcDNA3.1-tPA -VP1-C3d3转染HeLa细胞。间接免疫荧光分析表明, VP1- C3d3在HeLa细胞中获得了瞬时表达, Western blot分析证实转染的阳性细胞能分泌预期大小(133 kD)的融合蛋白。重组质粒pcDNA3.1-tPA-VP1-C3d3为研制以羊补体C3d为分子佐剂的口蹄疫新型疫苗奠定了基础。     

Transgenic RNAi-mediated reduction of LZP3 in <Emphasis Type="Italic">Lagurus lagurus</Emphasis> oocytes results in decreased fertilization ability in IVF

Structural differences in oligosaccharides on mammalian zona pellucida 3(ZP3) from different species may determine whether or not spermatozoa being able to bind to ZP. We reported here that by microinjecting the siRNA interference recombinant construct pGenesil-ZP31 encoding a Lagurus zp3 (lzp3) hairpin dsRNA of 21 bp into the inmatured oocytes of Lagurus lagurus, distributed in northern region of Xingjiang, to disturb its fertility. Results of in vitro fertilization after in vitro maturation of the immature oocytes of Lagurus lagurus showed that the fertilization rate of the transgenic oocytes carried pGenesil-ZP31 was decreased greatly (2.82%) compared to the oocytes carried pGenesil-HK (15.71%), suggesting that the transgenic RNAi-mediated silencing of lzp3 in Lagurus lagurus oocytes results in decreased fertilization ability. These results proved that LZP3 of Lagurus lagurus, like other mammalians, is essential for the recognition between oocyte and spermatozoa.     

乙型肝炎病毒全S基因疫苗诱导小鼠的特异性免疫应答

乙型肝炎病毒 (ＨＢＶ)感染是我国常见病及多发病。ＨＢＶ难以清除的原因之一就是机体的免疫功能障碍。目前虽然基因重组ＨＢＶ表面抗原 (ＨＢｓＡｇ)疫苗预防ＨＢＶ感染取得了较好的效果 ,但基因重组ＨＢｓＡｇ疫苗主要能诱导特异性体液免疫 ,不能刺激机体的细胞免疫应答。近年来发现基因疫苗可诱导机体产生细胞及体液免疫反应 ,特别是诱导细胞免疫反应的能力优于蛋白、多肽类疫苗 ,更适应于慢性病毒感染的预防与治疗[1,2 ] 。为了探讨应用ＨＢＶ基因疫苗预防ＨＢＶ感染的可能性 ,本文构建了ＨＢＶ全Ｓ基因和ＨＢｓＡｇ基因疫苗 ,观察和比…     

C3d enhanced DNA vaccination induced humoral immune response to glycoprotein C of pseudorabies virus

Murine C3d were utilized to enhance immunogenicity of pseudorabies virus (PrV) gC DNA vaccination. Three copies of C3d and four copies of CR2-binding domain M28(4) were fused, respectively, to truncated gC gene encoding soluble glycoprotein C (sgC) in pcDNA3.1. BALB/c mice were, respectively, immunized with recombinant plasmids, blank vector, and inactivated vaccine. The antibody ELISA titer for sgC-C3d3 DNA was 49-fold more than that for sgC DNA, and the neutralizing antibody obtained 8-fold rise. Protection of mice from death after lethal PrV (316 LD50) challenge was augmented from 25% to 100%. Furthermore, C3d fusion increased Th2-biased immune response by inducing IL-4 production. The IL-4 level for sgC-C3d3 DNA immunization approached that for the inactivated vaccine. Compared to C3d, M28 enhanced sgC DNA immunogenicity to a lesser extent. In conclusion, we demonstrated that murine C3d fusion significantly enhanced gC DNA immunity by directing Th1-biased to a balanced and more effective Th1/Th2 response.