两类金属蛋白酶在炎性细胞模型中的变化及中药RDQ的天然抑制效应

目的 探讨金属蛋白酶（MPs）家族的MMPs和ADAMs两亚类成分在前体TNF-α （mTNF-α）向成熟型TNF-α （sTNF-α）转化过程所起的作用,MMPs在炎症过程中活性的变化和中药RDQ抗炎保护功效的分子机制,为人工干预炎症过程提供依据和手段.方法 以IPS刺激HL-60细胞为天然模型,用细胞学和分子生物学技术在蛋白质和mRNA水平上研究MMPs、ADAM17、TNF-α在炎症过程中的表达和活性变化.结果 ①LPS刺激后,HL50细胞上清中MMPs的活性随刺激时间延长逐渐减弱,胞浆裂解物中的MMPs则随刺激时间延长活性增加但LPS刺激对MMPs mRNA的表达影响不大;②LPS刺激能使HL-60细胞中ADAM17 mRNA和TNF-α mRNA表达在6 h同时达高峰;③RDQ能明显降低LPS诱导的ADAM17 mRNA的增加,并能抑制sTNF-α的分泌.结论 ①ADAM17对sTNF-α的产生起主导作用;②纯中药注射液热毒清（RDQ）能调节TACE的表达,最终抑制TNF-α的分泌.     

ADAMs与生长发育(英文)

ADAMs是近几年发现和鉴定的一类具有多个结构域和广泛生物学功能的细胞表面糖蛋白 ,由信号肽区、前调控区、金属蛋白水解酶区、去整合蛋白区、富半胱氨酸区、表皮生长因子区、跨膜区和胞质区组成 ,已发现 3 0多种成员。它们在性细胞发生、受精、胚胎发育、细胞融合、器官形成、细胞分化等方面起重要作用。本文重点介绍了ADAM1 0 Kuz在神经发育过程中的信号传导和蛋白水解酶作用及ADAM1 7 TACE、ADAMTS在小鼠胚胎发育过程中对眼、肾、肾上腺、生殖等器官结构、功能的作用 ;另外 ,还对ADAM1 2 meltrinα促进肌细胞融合、分化、MIG 1 7介导细胞迁移等多种ADAMs在生长发育方面的研究作了简要介绍     

ADAMs与生长发育

ADAMs是近几年发现和鉴定的一类具有多个结构域和广泛生物学功能的细胞表面糖蛋白,由信号肽区、前调控区、金属蛋白水解酶区、去整合蛋白区、富半胱氨酸区、表皮生长因子区、跨膜区和细胞质区组成,已发现30多种成员。它们在性细胞发生、受精、胚胎发育、细胞融合、器官形成、细胞分化等方面起重要作用。本文重点介绍了ADAM10／Kuz在神经发育过程中的信号传导和蛋白水解酶作用及ADAM17／TACE、ADAMTS在小鼠胚胎发育过程中对眼、肾、肾上腺、生殖等器官结构、功能的作用;另外,还对ADAM12／meltrin α促进肥细胞融合、分化、MIG－17介导细胞迁移等多种ADAMs在生长发育方面的研究作了简要介绍。     

ADAM17调控Hippo信号转导通路对人脑胶质瘤细胞增殖和迁移的影响

为探讨去整合素-金属蛋白酶17(disintegrin and metalloproteinase 17,ADAM17)对人胶质瘤细胞增殖和迁移的影响及其调控机制,该研究用ADAM17 sh RNA质粒转染ADAM17高表达的胶质瘤细胞U87MG、U251MG,用过表达ADAM17载体转染ADAM17低表达细胞SW1783,q-PCR和Western blot检测ADAM17表达水平的变化,同时检测ADAM17和Hippo信号通路中相关蛋白质表达水平,CCK-8法分析细胞增殖能力并绘制生长曲线,划痕实验检测细胞迁移率。结果表明,下调ADAM17后,U87MG、U251MG细胞增殖和迁移能力减弱,而Hippo信号通路中MST2、p-MOB1、p-YAP蛋白表达水平升高;上调ADAM17后,SW1783细胞增殖和迁移能力增强,而MST2、p-MOB1、p-YAP蛋白表达水平降低。结果说明,ADAM17在脑胶质瘤细胞的增殖和迁移中发挥了重要作用,这可能是通过抑制Hippo信号通路来实现的,MST2被抑制,p-MOB1水平降低,从而YAP的磷酸化水平也降低,促进了胶质瘤细胞的增殖和迁移。     

成年大脑神经细胞特异性ADAM10基因敲除小鼠模型的建立与鉴定

去整合素和金属蛋白酶10(ADAM10)是一种能够水解30余种跨膜蛋白质的“脱落酶”(sheddase), 参与诸多生理过程和致病机制, 如胚胎发育、细胞粘附、信号转导、免疫反应、癌症和阿尔茨海默病。迄今, 已报道的ADAM10完全基因敲除小鼠和大脑神经前体细胞特异性ADAM10基因敲除小鼠分别于胚胎期或围产期死亡, 致使无法研究成年小鼠大脑神经细胞ADAM10基因的功能。文章利用本研究小组建立的CaMKIIα-Cre转基因小鼠与ADAM10^loxP/loxP转基因小鼠杂交, 获得了CaMKIIα-Cre/ADAM10^loxP/loxP小鼠, 并对其进行鉴定。利用PCR方法检测成年ADAM10 cKO小鼠大脑基因组DNA表明, ADAM10基因缺失主要发生在前脑皮层和海马中。荧光定量PCR检测结果显示, ADAM10 mRNA的表达水平在前脑皮层和海马中分别降低55.7%和60.8% ; 使用Western blotting方法研究发现, ADAM10成熟蛋白质的含量在前脑皮层和海马中分别减少63%和84.8% 。采用免疫组织化学方法检测表明, 成年ADAM10 cKO小鼠与野生型小鼠相比, 其大脑皮层和海马神经细胞的ADAM10免疫染色明显减弱, 而其它细胞如胶质细胞的免疫染色基本一致。总之, 文章成功制备了首个存活至成年的大脑神经细胞特异性ADAM10基因敲除(cKO)小鼠, 克服了小鼠因ADAM10缺失在胚胎期或围产期死亡的弊端, 为研究成年小鼠大脑神经细胞ADAM10基因的功能奠定了坚实的基础。     

ADAM17在恶性肿瘤中的研究及其进展

去整合素-金属蛋白酶17(adisintegrin and metalloproteinase 17,ADAM17)是近年来发现的金属蛋白酶解聚素(adisintegrin and metalloproteinase,ADAMs)家族成员之一,参与肿瘤发生发展的重要过程.去整合素-金属蛋白酶17(ADAM17)又称为肿瘤坏死因子转换酶(TACE),因此除了具有解聚素和金属蛋白酶的活性,还可以将没有活性的肿瘤坏死因子(TNF-α)从细胞膜上切割下来,并与其受体相结合,从而激活TNF-α下游的EGFR信号传导,此外还可以激活多条信号传导途径如Notch传导通路等,进而影响肿瘤细胞的粘附、凋亡、转移、增殖等生物学行为.纵观ADAM17的研究,在多种恶性肿瘤中呈高表达状态,且这种高表达状态与肿瘤侵润程度及转移情况相关.随着人们对ADAM17基础科学的研究不断深入,ADAM17的临床应用前景也正被不断开发,鉴于其在多种恶性肿瘤组织中高表达的情况,可将其作为许多肿瘤的诊断标志物、及判断其转移和预后情况.靶向药物的研究给恶性肿瘤患者带来了新的福音,利用EGFR为研究扳机点成功研制出许多靶向药物,在EGFR的配体释放环节,ADAM17尤为重要.本文总结了ADAM17在恶性肿瘤发展中的作用及其机制,对其在癌症治疗的应用前景进行展望.     

ADAM10/17活性调控在Aβ致神经小胶质细胞激活中的作用

阿尔茨海默病(AD)是一种神经退行性疾病,严重影响老年患者的生活质量。AD最主要的致病机制是淀粉样β蛋白(Aβ)对神经细胞的损伤。Aβ前体淀粉样前体蛋白(APP)由β和γ剪切酶剪切而来,另外α剪切酶也可剪切APP,从而减少Aβ的产量。因此上调α剪切酶ADAM10/17的活性有可能成为AD的治疗策略之一。该研究实验数据证实,ADAM10/17不仅参与APP的剪切,还参与神经胶质细胞的激活和神经炎症反应;ADAM10/17可能参与胶质细胞炎症因子翻译后的修饰和剪切。该研究的结果为APPα剪切酶激活剂的研究提供了研究基础,在APPα剪切酶激活剂的研发过程中,不应只局限于神经细胞的作用,还必须考虑神经胶质细胞神经炎症的参与,以有效规避药物的不良反应。     

ADAM33基因研究进展

ADAM33基因定位于20号染色体短臂20p13,属于ADAM基因超家族。ADAM基因超家族编码的蛋白质具有金属蛋白酶活性,这种活性与多种疾病的发生相关。在不同人群中的病例-对照及家系研究提示ADAM33基因可作为哮喘的候选基因,其抑制剂有望用于哮喘病的治疗。     

ADAM22蛋白与14-3-3β蛋白之间的相互作用

ADAM家族是一类具有去整合域和金属蛋白酶域的跨膜蛋白, 广泛参与各种重要的生理过程, 如精卵结合、神经系统发育、成肌细胞融合以及炎症反应等. 该家族蛋白具备潜在的粘连和蛋白酶活性. adam22在脑部高度表达, 基因剔除小鼠则出现严重的共济失调, 并在断奶前死亡, 但其作用机制不详. 用酵母双杂合系统筛选到与ADAM22相互作用的蛋白质14-3-3b, 离体结合实验、免疫共沉淀进一步证实了ADAM22与14-3-3β蛋白相互作用的专一性. ADAM22胞内部分系列缺失实验表明, C端第864~892氨基酸残基是14-3-3β的结合基序. 14-3-3β在脑部大量表达, 具有介导细胞的扩散、迁移及调节细胞周期等重要功能. 因此, 本实验证实这两种蛋白质之间存在相互作用,为阐明ADAM22在神经系统发育中的功能奠定了基础.     

宫颈鳞状细胞癌中ADAM17 的表达及其临床意义

目的:探讨去整合素-金属蛋白酶17(ADAM17)在宫颈鳞状细胞癌中的表达及其临床病理意义。方法:运用免疫组织化学法分别检测正常宫颈上皮、宫颈鳞状细胞癌及宫颈上皮内瘤样变组织中ADAM17的表达,并分析其与宫颈癌临床分期及淋巴结转移的相关性。结果:ADAM17在正常宫颈上皮组织切片中无明显表达,在宫颈上皮内瘤样变组织中少部分表达,呈浅黄色,在宫颈鳞状细胞癌中癌细胞大量表达,ADAM17表达呈棕褐色,数量较多且浓染。不同临床分期的宫颈鳞状细胞癌组织中ADAM17的阳性表达率比较存在显著统计学差异(P0.05),且随临床分期的上升,ADAM17的表达逐渐升高;有淋巴结转移的宫颈鳞状细胞癌组织中ADAM17的阳性表达率显著高于无淋巴结转移的宫颈鳞状细胞癌组织,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:ADAM17蛋白在宫颈鳞状细胞癌组织中呈异常高表达,且与宫颈鳞状细胞癌的临床分期和淋巴结转移密切相关,通过检测ADAM17蛋白的表达可能有助于宫颈鳞状细胞癌的诊断、治疗和预后预测。     

ADAM19在人胎盘组织中的表达及其对滋养层细胞侵润、黏附的影响

去整合素基质金属蛋白酶19（a disintegrin and metalloproteinase 19,ADAM19）是新近发现的ADAMs（a disintegrin and metalloproteinase）家族新成员,在人胎盘组织中有较高水平的表达,但其在胎盘发生过程中母胎界面的时空表达及功能还鲜有报道.本研究首次就ADAM19在正常胎盘中的时空表达进行了研究,并以人绒毛膜癌细胞系JEG-3细胞为体外研究模型分析了ADAM19对滋养层细胞侵润和黏附的影响及其机理.研究结果显示,从空间上看,ADAM19在多种滋养层细胞中有广泛的分布,包括细胞滋养层细胞（vctb）、合体滋养层细胞（stb）和滋养层细胞柱（ct）,绒毛内毛细血管的内皮细胞等.RT-PCR和Western印迹分析显示在孕早期8,9周龄绒毛中ADAM19的表达量较高,但在26周和足月胎盘中其mRNA和蛋白水平均明显下调.在JEG-3细胞中瞬时转染ADAM19可以降低其侵润能力同时增强细胞间的黏附.研究结果提示,ADAM19可能是胎盘发生过程中非常重要的滋养层细胞功能的调节分子.     

The transmembrane domain of TACE regulates protein ectodomain shedding

Numerous membrane proteins are cleaved by tumor necrosis factor-α converting enzyme （TACE）, which causes the release of their ectodomains. An ADAM （a disintegrin and metalloprotease domain） family member, TACE contains several noncatalytic domains whose roles in ectodomain shedding have yet to be fully resolved. Here, we have explored the function of the transmembrane domain （TM） of TACE by coupling molecular engineering and functional analysis. A TM-free TACE construct that is anchored to the plasma membrane by a glycosylphosphatidylinositol （GPI）-binding polypeptide failed to restore shedding of transforming growth factor-or （TGF-α）, tumor necrosis factor-α （TNF-α） and L-selectin in cells lacking endogenous TACE activity. Substitution of the TACE TM with that of the prolactin receptor or platelet-derived growth factor receptor （PDGFR） also resulted in severe loss of TGF-α shedding, but had no effects on the cleavage of TNF-α and L-selectin. Replacement of the TM in TGF-α with that of L-selectin enabled TGF-α shedding by the TACE mutants carrying the TM of prolactin receptor and PDGFR. Taken together, our observations suggest that anchorage of TACE to the lipid bilayer through a TM is required for efficient cleavage of a broad spectrum of substrates, and that the amino-acid sequence of TACE TM may play a role in regulatory specificity among TACE substrates.     

ADAM家族的结构特征与生物学功能

ADAM家族(A Disintegrin And Metalloproteinase domain)是一类包括去整合域和金属蛋白酶域的跨膜蛋白分子,具有发育、细胞间相互作用、精卵结合、肌管融合、神经发育和肿瘤发生等功能。本文对ADAM家族的结构和主要功能进行介绍。     

ADAM17通过EGFR-PI3K/Akt/p27通路调控前列腺癌细胞增殖

ADAM17是金属蛋白酶家族(ADAMs)成员之一,研究发现ADAM17可以通过水解细胞表面蛋白的胞外结构域导致肿瘤细胞的增殖和转移.本课题前期研究结果显示,与LNCap细胞相比,ADAM17在DU145细胞中高表达,且与细胞增殖相关.为了研究ADAM17与前列腺癌细胞增殖相关基因p27表达的关系及调控机制,我们采用RNAi技术下调ADAM17的表达,加入PMA(一种ADAM17的激活剂)上调ADAM17的表达,通过细胞计数和CCK-8方法检测细胞增殖,RT-PCR检测p27mRNA的表达,Western印迹检测ADAM17的表达;进一步阻断EGFR和PI3K/Akt信号转导,RT-PCR方法检测p27mRNA的表达,Western印迹检测ADAM17、EGFR、pEGFR、Akt和pAkt的表达.结果显示ADAM17的表达与前列腺癌细胞的增殖呈正相关(P0.05);p27mRNA的表达与ADAM17的表达呈负相关(P0.05);分别阻断EGFR和PI3K/Akt信号转导通路,同时使ADAM17表达增加,与对照组(单独PMA处理组)相比,p27mRNA的表达均增加(P0.05).提示ADAM17调控前列腺癌细胞增殖相关基因p27表达是通过EGFR-PI3K/Akt信号通路实现的.     

解整合素金属蛋白酶19(ADAM19)与子痫前期的相关性研究

通过对孕妇胎盘组织和外周血中解整合素金属蛋白酶19(ADAM19)的检测,探讨ADAM19与子痫前期发病的关系.将病人分为研究组(子痫前期组)和对照组(正常妊娠组),子痫前期组病人中早发型50例,晚发型44例,对照组病人50例.于临近分娩时取静脉血,分娩后取胎盘组织,应用免疫组织化学技术和免疫印迹技术对胎盘组织中ADAM19蛋白进行检测,用ELISA法检测两组血浆中ADAM19的水平.结果显示,胎盘组织中ADAM19分布在多种滋养层细胞中,包括细胞滋养层细胞、合体滋养层细胞和一些绒毛间质结缔组织细胞、毛细血管中,其阳性信号定位于细胞膜上和细胞质中;ADAM19的蛋白表达正常胎盘中为0.34±0.03,晚发型子痫前期组为0.53±0.02,早发型子痫前期组为0.82±0.03,三者间比较差异均有统计学意义(P<0.01).正常孕妇血浆中ADAM19为(4.52±0.10)μg/L,晚发型子痫前期为(4.32±0.11)μg/L,早发型子痫前期(3.78±0.10)μg/L.早发型子痫前期组与对照组比较有统计学差异(P<0.001),晚发型子痫前期组与对照组比较无统计学差异(P>0.05),早发型与晚发型子痫前期比较有统计学差异(P<0.001).结果表明,子痫前期胎盘组织中ADAM19过度表达可能与子痫前期的发生和发展有关,ADAM19有可能作为预测子痫前期发病的分子标志.     

ADAMs参与哺乳动物精-卵结合与融合

ADAMs家族是含多结构域的跨膜蛋白。睾丸特异的ADAMs,在精子发生与附睾精子转运过程中,经过蛋白水解成为成熟精子的分子形式,与精．卵质膜结合和融合有关。对于精-卵质膜相互作用,ADAMs去整合素域具有关键氨基酸残基和特殊模体。模拟ADAM2和ADAM3去整合素域的短肽能用于鉴别特异性卵子识别蛋白。精子ADAMs去整合素域与卵子膜蛋白整合素β1、α4／α9、α6和CD9相互作用,介导了精卵质膜的结合与融合。     

整合素α6在不同转移潜能膀胱癌细胞中的定量差异表达分析

整合素是一类跨膜糖蛋白,能够与细胞外基质结合参与许多生物学过程,尤其是与癌细胞的增殖、迁移等密切相关.目前在研究膀胱癌的发生发展过程中,对整合素的关注较少.本研究利用稳定同位素标记技术(SILAC)蛋白质定量技术结合质谱分析技术,对3株不同转移潜能的膀胱癌细胞株中的蛋白质组差异表达进行研究,并通过蛋白质免疫印迹技术、实时荧光定量PCR、细胞免疫荧光照相和流式细胞术等多种技术进行验证.同时使用临床组织基因芯片结果对比分析表明,与正常膀胱表皮细胞HCV29相比,整合素α6在膀胱癌细胞中表达量均有明显的上升,且在非侵染性膀胱癌KK47细胞中的表达量最高,侵染性的膀胱癌YTS1细胞中表达量次之.这一结果说明整合素α6与膀胱癌的发展具有密切关系,并为深入研究整合素α6在膀胱癌发生发展中的作用提供了前期基础.     

Inhibitory role of TACE/ADAM17 cytotail in protein ectodomain shedding

AIM:To determine if the cytotail of the principal sheddase tumor necrosis factor-α converting enzyme (TACE;ADAM17) controls protein ectodomain shedding.METHODS:Site-directed mutagenesis was performed to derive TACE variants. The resulting TACE expression plasmids with amino acid substitutions in the extracel-lular,cysteine-rich disintegrin domain (CRD) and/or deleted cytotail,along with an expression vector for the enhanced green fluorescence protein were transfected into shedding-defective M1 mutants stably expressing transmembrane L-selectin or transforming growth factor (TGF)-α. The expression levels of the TACE substrates at the cell surface were determined by flow cytometry. RESULTS:Consistent with published data,a single point mutation (C600Y) in the CRD led to shedding defi-ciency. However,removal of the cytotail from the C600Y TACE variant partially restored ectodomain cleavage of TGF-α and L-selectin. Cytotail-deleted mutants with any other substituting amino acid residues in place of Cys600 displayed similar function compared with tail-less C600Y TACE.CONCLUSION:The cytotail plays an inhibitory role,which becomes evident when it is removed from an enzyme with another mutation that affects the enzyme function.     

跨膜型肿瘤坏死因子α稳定表达细胞株的构建

目的：在体内,相对分子质量为26×103的跨膜型肿瘤坏死因子α（mTNF-α）可被TNF转化酶（TACE）酶解成相对分子质量为17×103的游离型TNF-α（sTNF-α）。为评价新研发的TNF-α全人源单克隆抗体与mTNF-α的结合能力,以及该单抗的ADCC作用,须构建只能稳定表达mTNF-α而不受TACE影响的Sp2/0细胞株。方法：PCR扩增缺失了TACE酶切位点的人TNF-α野生型基因序列,构建pcDNA3.1（＋）-dTNF-α重组质粒并测序鉴定;重组质粒转染Sp2/0细胞,构建只能稳定表达mTNF-α的细胞株,用流式细胞仪检测其表达情况。结果：pcDNA3.1（＋）-dTNF-α重组质粒测序结果与设计缺失基因的碱基序列完全一致,重组质粒构建成功;转染的阳性细胞株经流式细胞仪检测有表达,其中Clone11、15、16的表达量最高。结论：跨膜型TNF-α稳定表达细胞株构建成功,可用于TNF-α全人源单克隆抗体体外药效的评价。     

ADAM19 在小鼠睾丸发育中的时空表达

目的 阐明含有去整合素和金属蛋白酶结构域的跨膜蛋白19(ADAM19)在小鼠睾丸发育中的作用.方法 采用半定量RT-PCR和免疫组化两种实验方法,分别检测ADAM19 mRNA和蛋白质在小鼠睾丸发育中的时空表达.结果 ①最早在胚胎发育的15.5 d才能检测到ADAM19 mRNA的表达,后其表达随着胚胎发育天数的增加而逐渐升高,到围产期表达水平达到最高.出生后,ADAM19 mRNA的表达呈现显著下降的趋势,到成体睾丸中就几乎检测不到ADAM19的表达.②和其mRNA表达变化趋势一样,ADAM19蛋白也是首次在胚胎发育的15.5 d被检测到,一直持续存在到出生后一周,一周后则几乎检测不到;阳性表达信号主要定位在睾丸的曲细精管(睾索)中.结论 ADAM19 在小鼠睾丸中的表达具有显著的发育依赖性.