猪骨骼肌快肌肌钙蛋白C2基因的cDNA克隆与表达分析

从人骨骼肌快肌肌钙蛋白C2（TNNC2）基因出发,在dbEST数据库中进行同源性搜索,找到一个有较高同源性且在猪背最长肌中表达EST（BM083186）。通过电子克隆和进一步RT-PCR实验验证,获得猪TNNC2基因全长cDNA序列,其全长843bp,开放阅读框为201～683bp,编码有160个氨基酸。同源性分析结果表明,与人、鼠的骨骼肌快肌肌钙蛋白C2基因cDNA编码区（CDS）同源性分别为93.6％、90.5％,蛋白序列同源性均为97.5%。多种组织的半定量RT-PCR研究表明,该基因在骨骼肌中表达,并且在杜洛克猪背最长肌中的表达比兰塘猪高。     

人牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶的cDNA克隆、基因定位及组织表达谱分析

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)在真核生物中主要参与对包括Rho/Rac,Rap和Rab家族在内的多种蛋白质的翻译后修饰及细胞凋亡的调控.牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)是合成GGPP的关键酶,它催化法呢基焦磷酸与异戊烯焦磷酸的缩合反应而产生GGPP.报道了从人睾丸cDNA文库中克隆到一个与果蝇GGPPS cDNA高度同源的基因转录本,它的序列长1466 bp,其中nt 239～1138是一个完整的可读框,编码一个由300个氨基酸组成的35 ku蛋白质.该推导蛋白质的氨基酸序列与果蝇GGPPS的一致性和相似性分别达到了57.5%和75%,并且含有异戊二烯转移酶中保守的5个特征性结构域.Northern杂交结果显示人GGPPS基因在心脏中表达最高,在脾、睾丸、脑、胎盘、肺、肝、骨胳肌、肾、胰腺组织中为中度表达,而在其他组织中未见有明显的杂交带.采用辐射杂种细胞系定位技术,发现GGPPS位于人染色体lq43区.由于此前有遗传连锁资料证实该区域存在一个前列腺癌的易感位点,并且另有研究发现GGPP的结构类似物可抑制PC-3前列腺癌细胞系中p21rap蛋白的牻牛儿基牻牛儿基化,从而提示GGPPS有可能是与该病相关的候选基因之一.     

野生马铃薯ANS同源基因的克隆与表达分析

采用PCR和RT-PCR方法从野生马铃薯（Solanum cardiphyllum）分离得到了一个花色素合成酶（anthocyanidin synthase）同源基因ScANS的cDNA（GenBank登录号HQ701726）和DNA序列（GenBank登录号HQ701727）。序列分析表明,ScA册基因全长为1583bp,由一个内含子和两个外显子组成,开放阅读框长度为1365bp,编码一个由454个氨基酸残基组成的蛋白。该蛋白分子量为51．10kDa,理论等电点为5．24。ScANS含有典型的20G—FeII-Oxy保守功能域,属于2-OOD酶家族,其氨基酸序列与茄子的同源蛋白序列一致性最高,达82．86％。组织表达分析表明,SScANS在马铃薯植株的茎、叶和顶芽中有较高水平的转录表达,在根中有微量表达,在匍匐茎和块茎中检测不到。     

牛性别决定新基因Fgf9的克隆及生物信息学分析

Fgf9基因是脊椎动物性别决定中重要的信号因子,它在睾丸发育过程中参与Sertoli细胞的增殖和睾丸索的形成。基于表达序列标签（expressed sequence tags, ESTs）克隆原理,采用序列拼接和 RTPCR方法获得了荷斯坦奶牛Fgf9基因的cDNA序列,并对其组织表达特征进行分析。利用生物信息学方法对Fgf9基因序列和蛋白结构进行分析。结果显示：Fgf9基因定位于牛12号染色体上,cDNA全长为697bp,开放阅读框为627bp,编码208个氨基酸,分子量23.38245kDa,等电点7.0600。RTPCR证实该开放阅读框正确,在牛的各组织中均有表达,且与牛其他cDNA无同源性,获得GenBank登陆号为：EU693028。功能结构分析显示Fgf9蛋白具有典型的FGF家族保守结构域,包括受体相互作用位点和肝素结合位点。信号肽预测显示牛Fgf9蛋白可能不存在信号肽序列。
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猪I-FABP基因的分子克隆与组织特异性表达分析

小肠型脂肪酸结合蛋白对长链脂肪酸具有高度的亲和力,参与脂肪酸的吸收和细胞内转运。利用cDNA末端快速扩增（RACE）技术并结合同源克隆策略,克隆到了编码猪小肠型脂肪酸结合蛋白基因（I-FABP）的全长cDNA序列（GenBank接受号：AY960624）,并对系统发育关系等进行了生物信息学分析。猪I-FABP基因的cDNA序列全长614 bp,其中包括399bp的开放式读码框（ORF）,43bp的5’末端非编码区（5’URT）和172bp的3’末端非编码区（3’URT）,编码132个氨基酸残基蛋白,在氨基酸水半上与其他物种的I-FABP具有高度的同源性。以邻接法（Neigbor-Joining,NJ）所构建的系统发育关系表明,猪I-FABP与其他物种的,I-FABP属于同一类群,且与人的遗传距离最近。Northern杂交和半定量RT—PCR分析发现,猪I-FABP在猪体组织中出现约620bp大小的转录本,且在猪体组织中广泛存在,但在小肠组织中表达量最为丰富。     

金银花黄酮醇合成酶基因全长克隆及其序列分析

根据已知的其它物种黄酮醇合成酶cDNA保守序列设计引物,用RT-PCR技术从金银花叶片中扩增获得黄酮醇合成酶基因部分eDNA序列,再用RACE技术获得其两端序列.序列拼接得到完整的1 248bp的黄酮醇合成酶基因,根据获得的序列,设计引物扩增获得1 001 bp的开放阅读框,编码333个氨基酸.序列分析显示,金银花黄酮醇合成酶与烟草、马铃薯和桔梗的同源性分别为86％、83％和80％,与其它物种的同源性也在80％左右,表明不同物种中黄酮醇合成酶基因具有高度同源性.     

唐鱼Caspase-3和Caspase-9 cDNA全长克隆及胁迫表达分析

研究以唐鱼(Tanichthys albonubes)鳃部组织为材料,利用同源克隆和RACE方法,首次克隆得到唐鱼Caspase-3和Caspase-9 cDNA全长序列,并对其生物信息学进行了分析和鉴定。实验结果表明唐鱼Caspase-3 cDNA全长2153 bp,开放读码框(Open Reading Frame,ORF)为840 bp,编码一段长为279个氨基酸的多肽序列;Caspase-9 cDNA全长为1758 bp,ORF为1323 bp,编码440个氨基酸。生物信息学分析表明Caspase-3和Caspase-9与其他鱼类在蛋白结构上较为保守,在重要的功能域呈现高度的保守性。应用实时荧光定量PCR技术,分析了氯氰菊酯对唐鱼鳃部组织表达Caspase-3和Caspase-9的影响,在氯氰菊酯的胁迫下,Caspase-3和Caspase-9的表达呈现抑制状态,且呈现明显的浓度和时间依赖效应。       

真鲷肿瘤坏死因子α（（TNFα）cDNA的克隆与表达

采用同源克隆和末端快速扩增 (RACE)的方法 ,从真鲷中克隆到 12 6 4bp的TNFα全cDNA编码序列 (Gen Bank登录号为AY314 0 10 )。该序列包括 6 6 6bp可读框 (ORF) ,85bp的 5′末端非编码区 (UTR)以及 5 14bp的 3′末端非编码区。序列的 3′UTR含 5个mRNA不稳定模体 (motif)和 3个内毒素应答序列 ,但是未发现基因的PolyA加尾信号。由该序列推导的多肽含有明确的跨膜域 ,TNF家族的标签序列 (signature) ,TNF2家族分布 (profile)文件 ,粘多糖结合位点和细胞粘附位点。进化分析显示 ,真鲷TNF与哺乳类TNFα和TNFβ具有较高的相似性 ,源于共同的祖先。但结构及表达分析表明 ,它是TNFα而不是TNFβ。表达研究显示 ,真鲷TNFα存在组成型和诱导型两种表达形式 ,表现在刺激与非刺激的真鲷中 ,TNFα均可在部分组织中表达 ,但是在受刺激鱼体中基因表达的组织分布显著增多。     

猪Btnl5基因的克隆、表达分析及对NF-κB信号通路的调控作用

猪类嗜乳脂蛋白5(Btnl5)属于嗜乳脂蛋白家族,其同源蛋白多为免疫调节蛋白,为探索Btnl5的序列特征及其功能,利用反转录PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术对Btnl5基因cDNA全长进行克隆及序列分析,采用定量PCR技术检测Btnl5在猪不同组织中的表达丰度,利用报告基因法检测Btnl5对NF-κB信号通路的影响。克隆得到Btnl5基因cDNA全长共3 334 bp,包含1 680 bp的开放读码框,可编码长度为559个氨基酸残基的多肽链。蛋白结构预测表明Btnl5编码的蛋白含有信号肽、两段免疫球蛋白结构域、跨膜结构域和B30.2结构域。定量PCR分析表明,在检测的11个组织中,Btnl5只在空肠中具有较高水平的表达。报告基因检测结果显示Btnl5对NF-κB信号通路有一定的抑制作用。研究结果说明,Btnl5可能通过抑制NF-κB信号通路参与调节肠道免疫。     

三角帆蚌精氨酸酶基因的cDNA克隆与组织表达分析

精氨酸酶(Arginase,Arg)是生物体尿素循环当中一种标志性的酶类,它不但与生物体许多疾病相关,而且是目前用于治疗肿瘤和癌症的一种重要的工具酶。根据三角帆蚌消减杂交cDNA文库获得的EST序列,运用cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术获得三角帆蚌精氨酸酶基因的全长cDNA序列。生物信息学方法分析表明精氨酸酶基因cDNA序列长1720 bp,开放阅读框(651072)1008 bp,编码335个氨基酸,5端非编码区为64 bp,3端非编码区为648 bp,软件推测其编码蛋白相对分子量为36.81 kD。研究采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)方法分析该基因在不同组织中的表达规律,结果表明,该基因在肝脏、胃、肠、鳃、心脏、外套膜、斧足共7个组织中都有表达,但主要集中在肝脏、胃和肠消化器官中表达。这可能说明低等的无脊椎动物三角帆蚌的精氨酸酶兼具有Ⅰ型和Ⅱ型精氨酸酶的特征和功能,既可以参与尿素循环,又可以在生理和病理过程中发挥重要作用,但还需进一步验证。       

Cloning of the cDNA for the Human ATP Synthase OSCP Subunit (ATP50) by Exon Trapping and Mapping to Chromosome 21q22.1-q22.2

Exon trapping was used to clone portions of potential genes from human chromosome 21. One trapped sequence showed striking homology with the bovine and rat ATP synthase OSCP (oligomycin sensitivity conferring protein) subunit. We subsequently cloned the full-length human ATP synthase OSCP cDNA (GDB/HGMW approved name ATP50) from infant brain and muscle libraries and determined its nucleotide and deduced amino acid sequence (EMBL/GenBank Accession No. X83218). The encoded polypeptide contains 213 amino acids, with more than 80% identity to bovine and murine ATPase OSCP subunits and over 35% identity to Saccharomyces cerevisiae and sweet potato sequences. The human ATP50 gene is located at 21q22.1-q22.2, just proximal to D21S17, in YACs 860G11 and 838C7 of the Chumakov et al. (Nature 359:380, 1992) YAC contig. The gene is expressed in all human tissues examined, most strongly in muscle and heart. This ATP50 subunit is a key structural component of the stalk of the mitochondrial respiratory chain F₁F₀-ATP synthase and as such may contribute in a gene dosage-dependent manner to the phenotype of Down syndrome (trisomy 21).     

Isolation, nucleotide sequence, and expression of a cDNA encoding pig citrate synthase

Citrate synthase is a key enzyme of the Krebs tricarboxylic acid cycle and catalyzes the stereospecific synthesis of citrate from acetyl coenzyme A and oxalacetate. The amino acid sequence and three-dimensional structure of pig citrate synthase dimers are known, and regions of the enzyme involved in substrate binding and catalysis have been identified. A cloned complementary DNA sequence encoding pig citrate synthase has been isolated from a pig kidney lambda gt11 cDNA library after screening with a synthetic oligonucleotide probe. The complete nucleotide sequence of the 1.5-kilobase cDNA was determined. The coding region consists of 1395 base pairs and confirms the amino acid sequence of purified pig citrate synthase. The derived amino acid sequence of pig citrate synthase predicts the presence of a 27 amino acid N-terminal leader peptide whose sequence is consistent with the sequences of other mitochondrial signal peptides. A conserved amino acid sequence in the mitochondrial leader peptides of pig citrate synthase and yeast mitochondrial citrate synthase was identified. To express the pig citrate synthase cDNA in Escherichia coli, we employed the inducible T7 RNA polymerase/promoter double plasmid expression vectors pGP1-2 and pT7-7 [Tabor, S., & Richardson, C. C. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 1074-1078]. The pig citrate synthase cDNA was modified to delete the N-terminal leader sequence; then by use of a synthetic oligonucleotide linker, the modified cDNA was cloned into pT7-7 immediately following the initiator Met. A glutamate-requiring (citrate synthase deficient), recA- E. coli mutant, DEK15, was transformed with pGP1-2 and then pT7-7PCS. pT7-7PCS complemented the E. coli gltA mutation.(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS)     

大黄鱼PPAR β全长cDNA的克隆和组织表达

利用RT-PCR和SMART RACE的方法从大黄鱼肝脏中克隆了PPARβ全长cDNA。该序列长3390bp,5′端非翻译区146bp,3′端非翻译区1711bp,开放阅读框1533bp,可编码一个由510个氨基酸组成的蛋白质,该蛋白质分子量为57.2kDa、等电点为6.46。氨基酸序列分析表明,PPARβ基因具有较高的保守性,大黄鱼PPARβ与花鲈、金头鲷、欧鲽、大西洋鲑、红鳍东方鲀、人、黑猩猩、牛、兔及小鼠等10个物种的同源性为72%~91%,其中与花鲈同源性最高,为91%。用RT-PCR法检测PPARβ基因的组织表达,结果表明该基因在大黄鱼肌肉、眼、脾、肾、肝、鳃、心、肠和脑等9个组织中均有表达,其中肝脏组织表达量最大,肌肉最少。     

黄秋葵查尔酮合成酶基因AeCHS的克隆与表达分析

采用同源序列克隆和RT-PCR技术,首次克隆得到黄秋葵查尔酮合成酶基因(CHS)cDNA全长序列。序列分析表明,该序列全长1175 bp,包括一个1170 bp的完整ORF,编码389个氨基酸,命名为AeCHS。生物信息学分析表明,本研究所获得的AeCHS氨基酸序列与同科植物黄蜀葵和陆地棉的同源性较高,分别达99.23%和97.44%,AeCHS推断的氨基酸序列含有CHS蛋白的标签序列GFGPG以及4个保守活性位点Cys164、Phe215、His303、Asn336。实时荧光定量PCR分析黄秋葵果实、花、叶片不同发育时期AeCHS基因的表达量,结果表明AeCHS基因在上述植物材料中表现出不同的表达模式:花>果实>叶片,具体到不同植物组织,AeCHS基因在生长6 d的果实、盛开的花朵以及植株顶端第4片叶子中的表达量较高。     

Human mitochondrial ATP synthase: cloning cDNA for the nuclear-encoded precursor of coupling factor 6

Coupling factor 6 (F6) is a component of mitochondrial ATP synthase which is required for the interactions of the catalytic and proton-translocating segments. A human fetal muscle cDNA clone encoding this protein was isolated by screening a lambda gt10 library with oligodeoxyribonucleotide probes. The 497-bp F6 cDNA included a 96-bp segment that delineated a presequence of 32 amino acids (aa) in the precursor protein, and 140 bp of 3'-untranslated sequence. The remainder of the cDNA sequence coded for a mature human F6 protein of 76 aa. The deduced primary aa sequence showed 81% homology to that of bovine F6, differing in 14 aa. Almost all of these aa substitutions were conservative and comparison of the hydropathy profiles revealed a similar pattern.     

Cloning and sequence of a cDNA encoding human carbamyl phosphate synthetase I: molecular analysis of hyperammonemia.

Carbamyl phosphate synthetase I (CPSI) is the first enzyme involved in urea synthesis. CPSI deficiency is an autosomal recessive disorder characterized by hyperammonemic coma in the neonatal period. To analyze the enzyme and gene structures, and to elucidate the nature of mutations in CPSI deficiency, we isolated cDNA clones encoding human liver CPSI. Oligo(dT)-primed and random primer human liver cDNA libraries in lambda gt11 were screened using 5', middle, and 3' fragments of the rat CPSI cDNA as probes. Seven positive clones covered the full-length cDNA sequence with an open reading frame encoding a precursor polypeptide of 1500 amino acids (aa) (deduced Mr, 164,828) with a putative N-terminal presequence of 38 or 39 aa, a 5'-untranslated sequence of 118 bp and a 3'-untranslated sequence of 597 bp. Comparison with the rat CPSI cDNA showed that the deduced aa sequence of the human liver CPSI precursor is 94.4% identical to the rat enzyme precursor. A molecular analysis was made of the genomic DNA from three patients with CPSI deficiency. Heterogeneity of hybridized fragments that may or may not be the cause of the deficiency was apparent on the DNA blots from tissues from one patient.