丙型肝炎病毒核心蛋白对转录因子的调控作用

丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白是HCV病毒粒子核衣壳的组分,同时又是一种多功能蛋白。它能与胞内多种蛋白相互作用,调控NF-κB、AP-1、Sp1、Elk-1、STAT3、ATF-2、NF-AT等多种转录因子,影响一系列基因的表达。核心蛋白在HCV感染的病理发生和慢性化及致癌等过程中起着重要作用。     

Hepatitis C Virus Infection Modulates Expression of Interferon Stimulatory Gene IFITM1 by Upregulating miR-130A

We have examined the underlying mechanism of hepatitis C virus (HCV)-mediated IFITM1 regulation. IFITM1 is a potential target of miR-130a. Our results demonstrated that miR-130a expression was significantly higher in HCV-infected hepatocytes and liver biopsy specimens than in controls. Introduction of anti-miR-130a in hepatocytes increased IFITM1 expression. Hepatocytes stably expressing IFITM1 reduced HCV replication. Together, these results suggested that HCV infection of hepatocytes upregulates miR-130a and that use of anti-miR-130a may have potential for restriction of HCV replication.     

Partitioning of MLX-Family Transcription Factors to Lipid Droplets Regulates Metabolic Gene Expression

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丙型肝炎病毒核心蛋白基因真核表达质粒的构建和表达

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白真核表达质粒,并在HepG2细胞中稳定表达.方法:采用RT-RCR方法从丙型肝炎患者血清中得到HCVC区的cDNA序列,然后克隆入pcDNA3.0载体,构建真核表达质粒pcDNA-HCV,并进行酶切鉴定和测序鉴定;采用脂质体转染技术将pcDNA-HCV稳定转染于HepG2细胞系,并用G-418进行筛选;采用Western Blotting方法和免疫细胞化学方法检测HepG2细胞中HCV核心蛋白表达情况.结果:从HCV感染者血清中扩增得到的503bpHCV cDNA序列.属于HCV 1型基因C区,并成功构建了真核表达质粒pcDNA-HCV.经Western blotting和免疫细胞化学检测,稳定转染的HepG2细胞中有HCV核心蛋白的表达.结论:成功构建HCV核心蛋白真核表达质粒pcDNA-HCV,并可以在真核细胞HepG2中稳定表达.     

乙型肝炎病毒蛋白对纤维介素基因的激活作用

纤维介素基因（fgl2）在人和小鼠的重型肝炎的发病机制中发挥重要作用.为探讨乙型肝炎病毒（HBV）编码蛋白对人纤维介素基因（hfgl2）的激活作用, 构建了HBV编码蛋白C、 S和X的真核表达质粒pcDNA-HBc、pcDNA-HBs和pcDNA-HBx, 分别与hfgl2启动子荧光素酶报告基因质粒及β半乳糖苷酶基因质粒（βGal ）共转染到CHO细胞和HepG2 细胞, 采用免疫组织化学和免疫印记方法(Western blotting)鉴定病毒蛋白的表达.通过检测报告基因荧光素酶（LUC）及β半乳糖苷酶的表达活性, 反映病毒蛋白对hfgl2启动子的转录激活作用.结果显示, 转染了真核表达质粒的细胞均能瞬时表达相应的肝炎病毒蛋白, 在CHO细胞, 转染pcDNA-HB组和pcDNA-HBx组相对荧光素酶的活性是对照组的5.4和6倍, 在hepG2细胞, 转染pcDNA-HBc组和pcDNA-HBx组相对荧光素酶的活性是对照组的8.7和11倍.研究表明, CHO和HepG2细胞中表达的HBV C蛋白和X蛋白均具有激活hfgl2的功能, 而S蛋白则不能激活.进一步揭示了HBV病毒蛋白与宿主基因的相互作用机制.     

丙型肝炎病毒基因突变与免疫逃逸

免疫逃逸（Immune evasion）是指病原体逃避机体免疫监控的现象。在宿主和病毒的长期共同进化过程中,病毒形成了各种逃选机制以逃避宿主的免疫监控,其中病毒基因变异是最主要机制。丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）在感染个体中表现出极高的基因异质性,能有效地逃逸机体免疫识剐和破坏宿主免疫应答的能力,HCV还可侵袭免疫细胞来抑制机体的免疫功能,而建立HCV持续性感染。了解HCV病毒突变与免疫逃逸机制将会为预防和控制丙型肝炎提供依据。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因表达致人肝细胞恶性转化的研究

丙型肝炎病毒核心（HCV-C）蛋白是维持丙型肝炎病毒结构的重要蛋白质,由于参与调节细胞的生长与凋亡,被认为与HCV感染所致的肝硬化及肝细胞癌的发生有关.为了进一步探索HCV-C蛋白与肝细胞癌发生的关系,首先构建了表达HCV-C蛋白的真核表达载体,脂质体介导转染Chang-liver人肝细胞株,建立表达HCV-C蛋白的人肝细胞模型,RT-PCR方法检测HCV-C基因在人肝细胞内的表达,蛋白质印迹和免疫细胞化学方法鉴定Chang-liver肝细胞内HCV-C蛋白及其在细胞内的分布情况.表达HCV-C蛋白的Chang-liver人肝细胞培养20代以后,与对照组细胞相比,细胞的形态出现长梭形样改变,生长速度显著加快,细胞内DNA含量的均一性变差.接种表达HCV-C蛋白的Chang-liver人肝细胞的6只裸鼠在第20天时全部有肿瘤长出,且肿瘤组织结构符合肝细胞癌病理形态特点,对照组裸鼠未见肿瘤生长.上述结果表明HCV-C基因表达可导致Chang-liver人肝细胞发生恶性转化,提示HCV-C蛋白与HCV感染所致肝细胞癌的发生有直接关系.     

人工转录因子研究进展

转录因子是真核表达调控中非常重要的一类反式作用因子,通常由DNA结合结构域与效应结构域两部分组成,研究发现这两个结构域可以各自独立发生作用。基于转录因子的这种结构特点,可以人为地选择针对特定序列的DNA结合结构域与具有特定作用的效应结构域构建人工转录因子。目前人工转录因子的DNA结合结构域多为C₂H₂ 型锌指结构,每一个锌指单元由大约30个氨基酸组成,识别DNA双螺旋大沟中相连的3bp序列,并可通过氢键作用与相应的碱基结合;多个锌指可以串联成簇,从而识别并结合较长的DNA序列区域。常见的人工转录因子的效应结构域有激活结构域以及抑制结构域,不同的效应结构域赋予人工转录因子不同的功能。目前人工转录因子已经在基础研究、药物设计以及基因治疗等领域得到了广泛的应用。     

乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建含有天然完整的乙型肝炎病毒(HBV)X基因序列的真核表达载体,观察其在肝癌细胞株中的表达。方法:设计并合成HBV X基因的引物,用PCR方法从含完整HBV全基因的HepG2细胞中扩增X基因序列,并将其连接到真核表达载体pVAX-1上,酶切、PCR鉴定;用Triton X-114去除质粒内毒素后,采用电穿孔法将重组质粒pVAX-HBV X和空质粒pVAX-1分别转染SMMC-7721细胞,RT-PCR法检测HBV X基因mRNA的表达,Western印迹鉴定HBV X蛋白(HBx)的表达。结果:酶切和PCR鉴定证实pVAX-HBV X载体中包含完整的HBVX基因片段,该重组质粒转染的SMMC-7721细胞中HBV X基因mRNA及HBx蛋白的表达稳定。结论:构建了HBV X基因的真核表达载体,为X基因及其编码蛋白的生物学功能的研究提供了可靠的基因材料。     

The Hepatitis C Virus Modulates Insulin Signaling Pathway In Vitro Promoting Insulin Resistance

Insulin is critical for controlling energy functions including glucose and lipid metabolism. Insulin resistance seems to interact with hepatitis C promoting fibrosis progression and impairing sustained virological response to peginterferon and ribavirin. The main aim was to elucidate the direct effect of hepatitis C virus (HCV) infection on insulin signaling both in vitro analyzing gene expression and protein abundance. Huh7.5 cells and JFH-1 viral particles were used for in vitro studies. Experiments were conducted by triplicate in control cells and infected cells. Genes and proteins involved in insulin signaling pathway were modified by HCV infection. Moreover, metformin treatment increased gene expression of PI3K, IRS1, MAP3K, AKT and PTEN more than >1.5 fold. PTP1B, encoding a tyrosin phosphatase, was found highly induced (>3 fold) in infected cells treated with metformin. However, PTP1B protein expression was reduced in metformin treated cells after JFH1 infection. Other proteins related to insulin pathway like Akt, PTEN and phosphorylated MTOR were also found down-regulated. Viral replication was inhibited in vitro by metformin. A strong effect of HCV infection on insulin pathway-related gene and protein expression was found in vitro. These results could lead to the identification of new therapeutic targets in HCV infection and its co-morbidities.     

庚型肝炎病毒基因在大肠杆菌中表达的初步研究

利用原核表达载体ｐＲＳＥＴ或（和）ｐＧＥＸ在大肠杆菌内表达了覆盖庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）Ｃ－ＮＳ３或ＮＳ５区的多段基因。ＣＥ１、Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ５及ＮＳ３－ＮＳ５嵌合基因等的８段基因均有高效表达,各重组蛋白产量与菌体总蛋白之比在１０％￣３５％之间。对以上重组蛋白进行免疫学筛选,证实其中７个重组蛋白均具免疫学活性,在一定程度上确定了重组ＨＧＶ抗原表位的分布,为ＨＧＶ的血清学和免疫学诊断试剂的研究奠定