日本三角涡虫Caspase-7基因的克隆及功能研究

本文以日本三角涡虫Dugesia japonica为研究对象,通过c DNA末端快速扩增技术首次克隆得到了涡虫Caspase-7基因,全长935 bp,编码251个氨基酸,5'-UTR和3'-UTR长度分别为86 bp和93 bp。涡虫Caspase-7具有Caspase家族保守而关键的LSHG与QAC(Q/R) G两大结构域。此外,基于SWISS-MODEL同源建模对涡虫Caspase-7蛋白三维结构的预测和分析,发现其包含2个催化单位,且潜在催化位点由4个表面环构成。进化分析也显示,涡虫Caspase-7基因未与扁形动物门Platyhelminthes物种聚为一支,而与刺胞动物门Cnidaria水螅Hydra vulgaris有较近的亲缘关系,说明Caspase-7基因可能发生了趋同进化。本文通过实时荧光定量PCR检测了Caspase-7基因在涡虫再生不同时间段的表达变化,发现在涡虫切后再生6 h和3 d,Caspase-7基因表达量升高,这2个时间点是涡虫切后凋亡发生的2个高峰期。此外,通过喂食ds RNA干扰涡虫体内Caspase-7基因的表达,结果发现,干扰Caspase-7基因并不影响涡虫的再生,但再生完成后或未切割的成体涡虫在饥饿环境下,受Caspase-7基因干扰,虫体逐渐溶解直至死亡,而Djclg-3及PCNA基因的表达量也显著降低,说明干扰Caspase-7基因表达可能引起涡虫细胞凋亡与增殖减少,涡虫组织重塑失衡,导致虫体溶解并死亡。该结果揭示Caspase-7基因可能在涡虫组织重塑中起关键作用。     

东亚三角涡虫DjPreb基因干扰载体的构建及干扰效果鉴定

以含有东亚三角涡虫DjPreb基因的pcDNA3-DjPreb重组质粒为模板,经PCR扩增目的片段,将其克隆到干扰载体L4440上,构建重组质粒L4440-DjPreb后转化入大肠杆菌HT115感受态细胞中,IPTG诱导表达dsRNA后喂食涡虫.显微观察喂食dsRNA后的涡虫在再生过程中的表型变化,Real-time PCR检测载体对涡虫DjPreb基因的表达抑制效果.试验结果显示DjPreb基因的RNA干扰表达载体构建成功,DjPreb基因RNA干扰后涡虫不能正常再生.Real-time PCR分析饲喂RNA干扰食物后DjPrcb mRNA的表达显著下降,进一步说明DjPreb在涡虫头尾的形成中发挥作用.     

日本三角涡虫自然状态下的生殖研究

作者１９９０年对六安市某水塘中的日本三角涡虫Ｋｕｇｅｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ（下文简称涡虫）在自然状态下的生殖进行了近一年的观察研究，并于１９９２年５－６月、１０－１１月进行了采样。每月采标本３－４次，每次１５分钟，并记录水湿。从统计数据得知涡虫每年进行２次有性生殖，分别是４－５月，水温１９－２１℃；９－１０月，水温２０－２４℃。涡虫的断裂生殖３－１１月均可发生，并在５月、１０月出现高峰，其水温分     

环境中无机盐对三角涡虫再生的影响

用解剖镜观察,以眼点的出现为完成再生的标志,在恒温10℃条件下研究了钠、钾、钙离子对日本三角涡虫头部再生速度的影响。结果表明：跟对照组相比,低浓度氯化钠对涡虫再生速度影响不大,高浓度氯化钠引起涡虫解体;氯化钾对再生涡虫的毒性较大;0.1％和0．3％氯化钙可以提高涡虫的再生速度。由于Ca^2＋可以活化蛋白激酶和起始DNA合成,因此,培养液中适宜的Ca^2＋可以提高涡虫再生的速度。     

日本三角涡虫成体干细胞的异质性研究进展

Neoblasts是日本三角涡虫Dugesia japonica成体体内唯一具有增殖和分化能力的多能干细胞,是其损伤修复和再生的细胞基础。Neoblasts的组成是均质还是异质,长期以来一直存在争议。近年来研究表明,neoblasts具有异质性,由不同的细胞亚群组成。本文从形态、射线抗性、细胞周期及分子标志等4个方面综述了neoblasts异质性研究的最新进展,为将来探讨neoblasts不同亚群功能、相互关系及各亚群在涡虫再生过程中的作用提供借鉴。     

日本三角涡虫神经系统的组织学观察

为了给涡虫神经生物学的比较研究提供基础资料和通过RNAi技术为研究与脑部再生有关基因的功能奠定基础,本研究使用石蜡连续切片技术,经HE和Masson染色后,对日本三角涡虫Dugesia japonica的神经系统进行观察.日本三角涡虫的中枢神经系统由脑和2条纵神经索组成,脑呈马蹄形;纵神经索从头部到尾部逐渐变细;脑部神经细胞突起连接成网状,纵神经索内神经细胞突起呈纵向排列;咽壁神经组织排列成内外2个圆筒状.这些结构差异反映出日本三角涡虫在涡虫纲系统演化中处于较高级的地位.     

日本三角涡虫摄食行为的影响因素

研究了光强度、温度变化、食物种类、饥饿程度以及破坏耳突对日本三角涡虫(Dugesia japonica)涡虫摄食行为的影响。弱光和低温最利于涡虫摄食;4种人工饲料中,涡虫偏爱食熟的鸡蛋蛋黄;在一定范围内,饥饿时间长短与摄食强度呈正相关;破坏耳突后涡虫的摄食能力基本消失,“脑”对涡虫摄食是否有作用尚待进一步研究。     

日本三角涡虫的耗氧率和窒息点

应用静水呼吸室法,测定10℃、14℃、18℃、22℃、26℃和32℃温度下日本三角涡虫（Dugesiaj aponica）的耗氧率和窒息点,并测定涡虫耗氧率是否与温度和昼夜节律有关。结果表明,10℃和14℃涡虫耗氧率很低;18℃、26℃和32℃耗氧率较高;22℃涡虫耗氧率低于18℃、26℃和32℃条件下的耗氧率（P〈0,05）高于10℃和14℃条件下的耗氧率（P〈0．05）。18℃时窒息点最高,22℃窒息点最低。10℃、14℃、18℃、22℃、26℃和32℃温度下涡虫的窒息时间分别为125h,120h,55h,42h,37．5h和18．5h。18℃、22℃和26℃3个温度下涡虫耗氧率都呈昼夜节律性变化,白天耗氧率低,晚上耗氧率高（P〉0．05）。同一时间段比较,22℃耗氧率也最低。     

日本三角涡虫神经系统的AChE组化定位

日本三角涡虫(Dugesia japonica)是探索再生机理常用的模式动物之一.本实验利用乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)组织化学定位整体日本三角涡虫神经系统,对其方法做了改进,取得理想效果.结果表明:1)日本三角涡虫的AChE阳性(DjAChE+)神经系统结构由中枢神经及其分支神经...     

河南省桐柏县两产地日本三角涡虫核型分析

利用空气干燥法对采自河南省桐柏县下虎山和盘古溪两产地日本三角涡虫(Dugesia japonica)的染色体及核型进行了研究。结果表明,日本三角涡虫下虎山种群体细胞中染色体数目以16条为主,染色体基数x=8,为2倍体,核型公式为2n=2x=16=16m;日本三角涡虫盘古溪种群体细胞中染色体数目以24条为主,染色体基数x=8,为3倍体,核型公式为2n=3x=24=24m。     

日本三角涡虫河南八种群基于COⅠ基因片段的分子系统学研究

对采自河南4大山系8产地的日本三角涡虫线粒体DNA细胞色素C氧化酶Ⅰ亚基(COⅠ)基因进行PCR扩增和测序,用MEGA4.0、PAUP*4.0等程序对所得序列进行分析和系统树重建。结果表明,采自大别山系商城县的两个种群XYshangcheng1和XYshangcheng2的COⅠ片段序列同源性最高,为100%;而采自伏牛山系嵩县的种群LYsongxian与其它7种群的COⅠ片段序列同源性最低,在84.3%～89.0%之间。NJ树、MP树和贝叶斯树拓扑结构完全一致,从系统树上可以看出LYsongxian种群与其它7种群的亲缘关系最远;另外7种群又聚为2支。该聚类结果基本和各种群的山系分布相符合。同时结合基于Hsp70基因的分子系统学研究以及涡虫形态学、细胞遗传学等方面的证据初步推测:LYsongxian种群可能不是日本三角涡虫,而是三角涡虫属另外一个种,该推测是否正确尚待进一步的组织解剖学验证。     

日本三角涡虫hsp70 cDNA克隆及原核表达

热休克蛋白70 是热休克蛋白家族中的重要成员, 它在保护生物体免受各种胁迫中发挥重要作用。由于其惊人的再生能力, 淡水涡虫作为研究再生和发育的模式动物受到研究者关注。但是, 有关涡虫抗逆性的分子机制却少有报道。研究采用 RACE (Rapid amplification of cDNA end) 技术首次从日本三角涡虫中克隆出hsp70 (Djhsp70)全长cDNA 序列。Djhsp70 cDNA 全长2066 bp, 含有1947 bp 的开放阅读框, 编码648 个氨基酸, 分子量71.18 kD, GenBank 登录号EU380241。DjHSP70 的氨基酸含有真核生物HSP70 家族蛋白的三个标签序列(9–16 位的IDLGTTYS、199—206 位的 DLGGGTFD、334–339 位的IVLVGG)和末端高度保守序列EEVD。经BLAST 检索分析, Djhsp70 的核苷酸序列和推定的氨基酸序列与目前已知HSP70 家族成员高度同源。有趣的是, HSP70 亲缘关系分析表明: 涡虫更靠近脊椎动物, 而与无脊椎动物果蝇和线虫相距较远。为了制备抗体研究DjHSP70 的组织学定位, 实验还成功构建了DjHSP70 表达载体, 在IPTG 诱导下表达出约76 kD 的融合蛋白。Djhsp70 cDNA 的克隆与表达载体的构建为下一步工作奠定了基础。       

东亚三角涡虫Djtraf3基因的时空表达模式

肿瘤坏死因子受体相关因子3(TRAF3)作为TRAF家族的成员之一,通过介导TLRs信号通路,参与动物的免疫反应。通过构建东亚三角涡虫Djtraf3的cDNA文库获得Djtraf3基因并分析基因结构。结果发现,该最大开放阅读框为564bp,编码的蛋白质含187个氨基酸,含有1个TRAF结构域。进化分析表明,DjTRAF3和果蝇的TRAF3聚群,位于进化树的基部;整体原位杂交结果显示,在涡虫成体及不同再生阶段,Djtraf3在整个肠部表达。这些结果为进一步探究其功能提供了依据和方向。     

云南省日本三角涡虫不同地理种群mtDNA CO I基因序列分析及其系统发育

对采自中国云南省的日本三角涡虫(Dugesia japonica)13个地理种群的细胞色素C氧化酶I亚基基因(CO I)的部分片段进行PCR扩增、克隆和测序,以采自河南省的日本三角涡虫Luoyang种群为外群,用Clustal X 1.80、MEGA 4.0、PAUP*4.0、MrBayes 3.1.1等程序对其进行序列分析和系统树构建.结果表明:13种群的CO I基因片段A+T的含量差异很小,稳定在67.1%～68.8%之间,明显高于G+C的含量.序列间的成对遗传距离介于0.000～0.199之间,其中Yuxi、Dali2、Lincang1 3个种群间的遗传距离最小,为0;Puer和Xishuang种群间的遗传距离最大,为0.199.最大简约树和贝叶斯树拓扑结构基本一致,均以较高支持率聚为两支.结合云南省的地形地貌及丰富的水系特征,推测云南省日本三角涡虫可能是中部起源,扩散至边缘,也可能相反.究竟哪种推测更为可靠,尚待进一步研究.     

细胞自噬基因Atg6在涡虫中枢神经系统再生中的功能研究

细胞自噬基因Atg6在细胞自噬过程中发挥重要作用,其功能缺陷影响神经发生.涡虫是研究中枢神经系统(central nervous system,CNS)再生的良好模型,其头部切除后1周就能再生出一个新的头部.因此,研究Atg6基因在涡虫CNS再生中的作用对探究自噬调控神经发生具有重要意义.本研究首次报道了日本三角涡虫(...     

15种直饮水对涡虫再生的影响

通过切割57条日本三角涡虫(Dugesia japonica),每条切割为四段,观察和比较了228个涡虫体段眼、头、尾和咽在15种市售直饮水中的再生过程。结果显示:(1)切割后的涡虫体段在矿泉水中,无解体现象的比例为66.6%;而在纯净水中为12.5%。(2)解体体段占涡虫体段总数的19.74%。(3)头部解体占解体总数的55.55%。头部解体大于50%的现象分布在纯净水,其中3种纯净水中的头段全部解体。本实验结果提示,长期饮用能使涡虫正常再生的市售矿泉水比较适宜。     

云南省日本三角涡虫不同地理种群mtDNA COⅠ基因序列分析及其系统发育

对采自中国云南省的日本三角涡虫(Dugesia japonica)13个地理种群的细胞色素C氧化酶I亚基基因(CO I)的部分片段进行PCR扩增、克隆和测序,以采自河南省的日本三角涡虫Luoyang种群为外群,用Clustal X 1.80、MEGA 4.0、PAUP*4.0、MrBayes 3.1.1等程序对其进行序...     

涡虫wnt基因的研究进展

涡虫具有强大的再生能力,对其再生机制等方面的研究一直是发育生物学研究的热点问题。Wnt信号途径是动物发育中关键的信号途径之一,对生物的生长发育有着至关重要的作用,近年来国内外对涡虫的wnt基因进行了不断的深入研究。从Wnt信号途径、涡虫wnt基因的种类及命名、涡虫wnt基因的表达及功能几方面对wnt基因在涡虫中的研究进展进行综述。     

三角头涡虫的简易诱捕法

用猪肝或其它动物肝脏、肺、鱼鳃做诱铒诱捕三头涡虫的采集方法,简便易得,捕获量大。关键是采集地和下饵点的选择。用白色塑料泡沫做浮标,既可在山涧乱石中明显指示下饵点,又可避免诱饵丢失,提高工作效率。     

中国淡水三角涡虫的核型分析

用空气干燥法对安徽肥东龙泉山、安徽滁州琅?山、云南昆明海源寺龙潭和湖北恩施龙洞河4产地淡水三角涡虫的染色体组进行研究。结果表明:云南昆明海源寺龙潭的涡虫细胞中染色体数目有16条,24条和32条共3种类型,核型公式分别为2x=2n=16=16m,2x=3n=24=24m和2x=4n=32=32m。安徽肥东龙泉山、安徽滁州琅?山和湖北恩施龙洞河的涡虫细胞中染色体数目有16条和24条两种类型,核型公式分别为2x=2n=16=16m和2x=3n=24=24m。染色体组型分析初步鉴定上述4产地淡水三角涡虫均为日本三角涡虫(Dugesia japonica)。另外本文还对淡水三角涡虫的混倍体现象进行了探讨。