鸭坦布苏病毒E蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的用RT-PCR技术扩增鸭坦布苏病毒(DTMUV)AH-F10株E基因,并克隆至pET32a(+)载体,构建重组表达质粒pET32a-E,表达E蛋白。方法重组表达质粒转化感受态细胞BL21(DE3),经IPTG诱导后,获得含6个His标签的融合蛋白,大小约54kDa。表达的蛋白以包涵体形式存在。对目的蛋白进行纯化,用纯化的E蛋白免疫Balb/c小鼠,制备多克隆抗体血清。结果SDS-PAGE和Western blot试验结果表明E基因在大肠埃希菌中成功表达,并能与抗DTMUV多克隆抗体产生特异性反应,具有良好的反应原性。间接免疫荧光试验表明免疫小鼠后获得的多克隆抗体能与DTMUV反应。结论本研究为DTMUV新型疫苗和诊断试剂盒的进一步研究奠定了基础。     

重组酶Exo、Beta和Gam在大肠杆菌中的表达与纯化

目的:构建exo、beta和gam基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达、制备重组酶Exo、Beta和Gam。方法:将exo、beta和gam基因分别构建在原核表达载体pEGKG和pET28a上,分别转化大肠杆菌BL21(DE3)和DH5α,经IPTG诱导后,在大肠杆菌中获得可溶性表达蛋白,用柱层析方法纯化蛋白。结果:构建了原核表达质粒pET28a-exo、pET28a-beta、pET28a-gam和pEGKG-exo、pEGKG-beta、pEGKG-gam;SDS-PAGE结果表明重组酶融合蛋白His-Exo、GST-Exo、His-Beta、GST-Beta、His-Gam、GST-Gam得到可溶性表达;用His标签抗体和GST标签抗体通过Western印迹方法检测到纯化后的融合蛋白。结论:在大肠杆菌中诱导表达了λ噬菌体重组酶,并纯化获得了一定量的纯度较好的蛋白,为下一步制备检测用多克隆抗体奠定了基础。     

Nono蛋白的原核表达、纯化和多克隆抗体的制备

目的表达和纯化带多聚组氨酸（6×His）标签的Nono （ non-POU-domain-containing, octamer-binding protein ）融合蛋白并制备抗Nono多克隆抗体。方法构建pET-28a（＋）-Nono重组表达质粒,转入Rosetta（DE3）大肠埃希菌,以IPTG诱导6×His-Nono融合蛋白表达,经镍离子金属螯合树脂纯化后,用纯化出的蛋白免疫BALB／C小鼠制备多克隆抗体,并用ELISA检测多克隆抗体的效价,Western印迹检测多克隆抗体的特异性。结果在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的His-Nono融合蛋白,经亲和树脂纯化后免疫小鼠,获得了高特异性的抗Nono抗血清。结论成功构建pET-28a（＋）-Nono原核表达质粒,表达并纯化出高纯度的目标蛋白,制备出高滴度、高特异性的多克隆抗体。     

沙门菌外膜蛋白D的原核表达及多克隆抗体制备

目的:在大肠杆菌中表达沙门菌外膜蛋白(OMP)D,纯化后制备兔抗OMPD抗体。方法:用PCR方法从鼠伤寒沙门菌中扩增出ompD基因,并插入融合表达载体pET-28a(+)的多克隆位点,构建重组表达质粒pET28a(+)-ompD;以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性重组菌株,经IPTG诱导目的蛋白表达,在变性条件下对目的蛋白进行亲和层析纯化;以表达的OMPD蛋白免疫家兔,制备抗OMPD的多克隆抗体并进行鉴定。结果:扩增了ompD基因,测序证实正确后亚克隆于表达载体pET-28a(+)中,经PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,经诱导在大肠杆菌中表达出相对分子质量为40×103的目的蛋白并进行纯化;纯化的OMPD免疫家兔后,能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价达到1∶10000以上,且具有良好的特异性。结论:构建ompD基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;制备出兔抗OMPD抗体,效价及特异性均良好,为进一步制备肠黏膜高亲和力疫苗奠定了基础。     

GOLPH2的原核表达、纯化、抗体制备和初步应用

目前发现GOLPH2蛋白与肝癌密切相关,将golph2基因进行克隆、表达并制备多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定基础.应用RT-PCR技术,从人肝癌细胞系HepG2细胞中扩增得到golph2 cDNA,将其克隆到原核表达载体pET21a(+)-TRX内、转化大肠杆菌DH5a,用IPTG诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.His-tag磁珠纯化试剂盒纯化重组蛋白GOLPH2,SDS-PAGE鉴定.将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,采用ELISA、Western blot方法检测抗体的灵敏度和特异性,并测定临床血清标本中GOLPH2蛋白水平.成功地构建了表达TRX-GOLPH2融合蛋白的原核表达质粒pET21a(+)-TRX-GOLPH2.并在大肠杆菌BL21(DE3)内得以高效表达,且以可溶性的形式存在.SDS-PAGE和Western blot证实,重组GOLPH2蛋白质与预期结果一致.抗血清能够特异地识别52 kD重组蛋白、73 kD细胞裂解液和血清蛋白质.成功制备了GOLPH2蛋白质和多克隆抗体,能用于后续研究.     

SPA-Luc嵌合基因的构建及其融合蛋白活性检测

目的:葡萄球菌A蛋白-荧光素酶(SPA-Luc)原核表达载体的构建,表达,纯化,并对其生物学效应进行初步研究。方法:PCR扩增SPA和Luc基因,并连接到pET28a(+)中,构建原核表达质粒。构建正确的重组质粒转化至E.coliBL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE及Western Blot鉴定,同时用Ni-NTA亲和层析法纯化SPA-Luc蛋白,最后用荧光素酶试剂盒和ELISA检测融合蛋白的生物学活性。结果:成功构建重组质粒pET28a(+)-SPA、pET28a(+)-Luc和pET28a(+)-SPA-Luc,SDS-PAGE及Western Blot证明正确表达了重组蛋白,并获得了纯化的融合蛋白SPA-Luc。荧光素酶试剂盒检测发现该蛋白仍能与IgG结合,并且与兔和鼠的IgG有较高亲和性。ELISA显示SPA-Luc蛋白替代常规二抗检测抗原,具有更高的敏感性。结论:成功的克隆、表达、纯化的SPA-Luc蛋白可用于抗原抗体的检测,且比常规二抗具有更高的敏感性,为进一步研究其在免疫学中的应用奠定了实验基础。     

人SUMO-3基因原核表达及多克隆抗体制备

构建人SUMO-3基因的原核表达载体pET41a(+)-SUMO-3,表达重组GST-SUMO-3融合蛋白,制备人SUMO-3多克隆抗体。试验结果显示,通过PCR方法从重组质粒pEYFP-SUMO-3中克隆到的SUMO-3 N端93个氨基酸的基因序列与NCBI上提供的序列一致,重组质粒pET41a(+)-SUMO-3构建成功;重组pET41a(+)-SUMO-3在E.coli.BL21 (DE3) pLysS中表达GST-SUMO-3融合蛋白,分子量为44.0 kDa,与预期分子量一致;采用亲和层析纯化融合蛋白GST-SUMO-3并免疫家兔,获得人SUMO-3抗体;Western blot 检测显示该抗体可以特异性识别SUMO-3,ELISA检测结果成阳性,抗体效价约为1: 20000。实验结果为进一步研究人SUMO-3及SUMO第二类家族的功能提供了有用工具。     

沙门菌毒力基因spvB的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的:构建沙门菌毒力基因spvB的原核表达载体,诱导表达纯化SpvB蛋白并以其为抗原免疫小鼠,制备多克隆抗体。方法:利用生物信息学软件对SpvB进行分析,选取抗原性较高、易表达的氨基酸序列作为克隆序列,以携带spvB基因的鼠伤寒沙门菌为模板,PCR扩增目的片段后与原核表达载体pET28a(+)连接;将质粒pET28a-SpvB转化大肠埃希菌BL21(DE3)后诱导表达并纯化。目的蛋白免疫小鼠,制备抗SpvB多克隆抗体,Western blot检测抗体特异性。结果:成功构建spvB原核表达载体,经IPTG诱导结果显示,重组蛋白表达且主要存在于包涵体中,将纯化后的蛋白免疫小鼠Western blot检测血清中抗体与SpvB特异性结合。结论:获得具有免疫原性的SpvB蛋白及其多克隆抗体,为进一步研究该基因的功能奠定基础。     

Scytovirin在大肠杆菌中的可溶性表达

目的:获得Scytovirin(SVN)蛋白及其多克隆抗体.方法:按照NCBI上公布的SVN基因序列设计合成引物,合成SVN基因,构建pET32c-SVN原核表达重组质粒,经限制性酶切分析、DNA序列测定插入片段正确;将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达;用离子交换层析法及金属亲合层析法纯化蛋白,采用Tris-Tricine系统分析;以经过纯化的蛋白为抗原免疫白兔,制备SVN多克隆抗体.结果:对表达产物进行了分离纯化,SVN纯度达到91%;用纯化的样品制备了多克隆抗体,抗血清效价为1∶102 400.结论:SVN在大肠杆菌表达系统中获得了高效可溶表达,并制备了其多克隆抗体,为进一步深入研究SVN提供了材料.     

果蝇心脏发育标记基因lbe的多克隆抗体制备

lbe是已经证明的心脏标记基因。为了深入研究lbe在心脏发育中的功能,需要获得lbe蛋白并制备其抗体。首先提取野生型成体果蝇的总RNA,反转录获得其cDNA文库,通过PCR克隆出lbe编码区序列,将其连接到pET-28a原核表达载体上。经酶切及测序鉴定后,质粒构建成功。将重组质粒（pET-28a-lbe）转化大肠杆菌菌株Rosseta,用IPTG诱导表达出融合蛋白,经Ni-IDA凝胶柱纯化后,最后将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备lbe多克隆抗体,并用Western blotting检测抗体的效价和特异性。结果显示获得了lbe原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗lbe多克隆抗体,为lbe功能的进一步研究奠定了基础。     

LPTS抗体的制备和活性检测

LPTS是利用定位候选克隆策略 ,得到的一个新的肝相关候选肿瘤抑制基因 (anovelliver relatedputativetumorsuppressor) ,为了进一步研究其结构与功能 ,利用DNA重组技术 ,将LPTS的cDNA克隆到融合表达载体pET 2 4a中 ,在E .coli中表达 ,以Ni+柱亲和层析 ,获得纯化的 6×His LPTS融合蛋白。以此为抗原免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体 ,ELISA法检测其滴度达 2 0 0 0 0以上 ,经亲和层析纯化 ,Western印迹结果表明 ,该纯化抗体可与真核表达的HA LPTS蛋白和内源性的LPTS蛋白特异性结合 ;免疫荧光分析显示SMMC 772 1细胞内源性表达的LPTS蛋白呈点状分布于细胞核内。以上结果表明获得了效价高 ,活性强的针对LPTS蛋白的多克隆抗体 ,可用于对LPTS的结构和功能研究。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp4抗体制备与鉴定

为了获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)nsp4的抗体,根据HP-PRRSV TA-12株(Gen Bank Accession No.HQ416720)的nsp4基因序列,设计并合成一对引物。用RT-PCR扩增后克隆到原核表达载体p ET-28a(+)中,构建重组质粒p ET28a-nsp4,转化至Trasseta(DE3),经IPTG诱导重组蛋白获得了高效可溶性表达,大小约为26 k Da。经镍离子亲和柱(Ni+-NTA)纯化获得了高纯度重组蛋白,将纯化的nsp4蛋白免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体。ELISA检测抗体效价可达106,Western blotting和IFA检测结果表明所制备的多克隆抗体具有良好的免疫反应特异性,能够识别PRRSV感染宿主细胞中的nsp4蛋白。本研究成功制备了针对nsp4的多克隆抗体,为进一步研究nsp4的功能及PRRSV致病机制奠定了基础。     

传染性法氏囊病病毒非结构蛋白VP5的原核表达及多克隆抗体的制备

利用PCR技术,从传染性法氏囊病病毒（IBDV）Gx,Gt毒株中分别扩增出VP5基因,将其克隆到表达载体pET30a、pET28a中。经PCR、酶切和序列分析鉴定获得重组质粒命名为pET28a-GtVP5、pET30a-GxVP5。将pET30a-GxVP5、pET28a-GtVP5分别转化宿主菌BL21(DE3),在IPTG诱导下均成功表达约24 kDa的Gx-VP5及23kDa的Gt-VP5融合蛋白,并都以包涵体形式存在。将Gx-VP5纯化后的蛋白免疫8周龄BALB/c雌鼠,ELISA分析表明制备的抗血清效价在1:25600以上,Western blot分析VP5表达产物能与抗6×His mAb及抗IBDV多克隆抗血清发生反应,具有良好的免疫反应特异性。     

人vasorin蛋白的基因克隆、表达及纯化简

目的：克隆、表达人vasorin（VASN）蛋白。方法：利用PCR方法从HepG2细胞的cDNA中扩增获得目的基因,并插入带有6xHis标签的原核高效可溶性表达载体pET28a中,构建重组表达质粒pET28a-VASN,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导后目的基因获得表达,对融合目的蛋白进行Ni^2＋金属螯合柱纯化。结果：内切酶鉴定及基因序列测定证实重组表达质粒构建成功;对目的蛋白进行了原核表达,SDS-PAGE显示相对分子质量为61x10^3的特异表达条带;Western印迹证实目的蛋白为VASN,且主要以包涵体形式存在;对经尿素变性的表达产物进行了亲和层析纯化,有利于以后的变性、复性过程。结论：获得了人VASN融合蛋白,为其进一步的生物学功能研究奠定了基础。     

大肠杆菌O157:H7的sRNA伴侣蛋白Ufq的基因克隆、表达及纯化

目的:克隆、表达并纯化肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7的sRNA伴侣蛋白Hfq.方法:利用PCR方法从EHEC O157:H7基因组中扩增出基因hfq,并插入含6xHis标签序列的原核表达载体pET28a(+)的多克隆位点中,构建重组表达质粒pET28a(+)-hfq,以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)...     

重组斑马鱼CD36蛋白的原核表达及纯化

目的：在大肠杆菌中重组表达斑马鱼CD36蛋白胞外区38～432氨基酸残基段并纯化。方法：PCR扩增斑马鱼CD36蛋白的基因编码区,连接到带有6~His标签的原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET28a-CD36,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导表达,优化表达条件后用Ni^2＋柱进行纯化。结果：构建了pET28a-CD36重组质粒;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,亲和纯化后,SDS-PAGE显示相对分子质量为预期的46．8×10^3。结论：获得了斑马鱼CD36融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。     

水稻cDNA c73片段在大肠杆菌中的表达及其产物的纯化

曾以水稻蜡质基因５’调控区内一段３１ ｂｐ 片段为探针,用酵母单杂交法从水稻ｃＤＮＡ 文库中筛选出若干个其编码的蛋白可能与此３１ ｂｐ 片段结合的ｃＤＮＡ克隆,现将其中的ｐＣ７３ 克隆中的插入片段ｃ７３ 连接到含Ｈｉｓ６ 的表达载体ｐＥＴ２８ｃ（ ＋ ） 上,在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３） 中进行诱导表达,并用ＮｉＮＴＡ 树脂纯化得到预期的融合表达产物。在合适的诱导表达条件下,融合表达产物主要以可溶形式存在于大肠杆菌细胞内;表达量占到大肠杆菌总蛋白的１０ ％ 左右;经ＮｉＮＴＡ 树脂亲和层析纯化得到的产物纯度达９５ ％ ,可供进一步研究之用。     

黑胸大蠊浓核病毒磷脂酶A2功能区的克隆及其表达

通过RT-PCR扩增获得PfDNV结构蛋白基因VP1含磷脂酶A2(PLA2)功能区片段,将其连接到pMD18-T载体上并亚克隆到原核表达载体pET28a和pET26b,构建阅读框架正确的重组表达载体pET28a-PLA和pET26b-PLA,转化大肠杆菌BL21-codonplus(DE3)-RIL,经IPTG诱导,SDS-PAGE显示得到了目的融合蛋白,以抗组氨酸的单克隆抗体对经Ni-NTA亲和层析柱纯化的目的蛋白进行了westernblot鉴定,结果表明成功表达PfDNV结构蛋白PLA2,对于研究该酶的生物学特性及其在病毒对细胞侵染过程中的功能奠定了基础。     

中华绒螯蟹蜕皮抑制激素基因的表达及抗体制备

蜕皮抑制激素(Moltinhibitinghormone,MIH)属于甲壳动物高血糖激素家族神经肽,对甲壳类的蜕皮起抑制作用。本研究用DNA重组技术将中华绒螯蟹(Eriocheirjaponicasinensis)的蜕皮抑制激素1(ErsMIH1)成熟肽的cDNA序列亚克隆至原核表达载体pET28a( )中,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行高效表达。SDSPAGE检测结果显示,融合蛋白pET-MIH1的Mr约为12kD,与理论值相符。融合蛋白的表达量约占菌体总蛋白的15%,表达产物以包涵体形式存在。对包涵体进行变性、复性及纯化处理,并以8mol/L尿素溶解的包涵体作为免疫原免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。ELISA和Westernblot的结果表明制备的抗体效价高、特异性强