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昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达尿激酶原* 总被引:2,自引:0,他引:2
在转瓶和2L搅拌反应器中,利用重组杆状病毒AcNPV感染sf9昆虫细胞表达尿激酶原。在转瓶中,细胞接毒密度1.2×106/mL、MOI=30时,尿激酶原活性达到1065IU/mL研究了尿激酶原表达过程中葡萄糖、乳酸的代谢变化。实验结果表明细胞状态对尿激酶原的表达水平有显著影响。 相似文献
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目前,尿激酶原(Pro-UK)作为~种新型溶栓剂,越来越多的受到重视。北京大学承担国家“863”课题“利用昆虫一杆状病毒系统表达Pro一UK”获得成功[川。表达P]-UK酶活为8O0~1600IU/rnl,本研究将Sfg细胞用4L转瓶和SL生物反应器培养,并用重组Pro-UK的病毒感染,以进行尿激酶原的表达。1材料与方法工.且材料1.1.ISfg细胞和表达Pro-UK的重组病毒北京大学胡美浩教授提供。1.1.24L转瓶机美国BellcoGlass公司。1.1.3SL生物反应器美国NBS公司。1.1.4尿激酶检测试剂中国药品生物制品检定所。1.2方法1.2.1细胞在4… 相似文献
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RGDS-尿激酶原嵌合体的构建与表达 总被引:6,自引:0,他引:6
利用定点突变及DNA重组技术,构建了在尿激酶原K区C端的β发夹区插入了精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸〔RGDS〕片段的尿激酶原嵌合体基因,并利用昆虫杆状病毒表达系统通过感染Sf9细胞对野生型及嵌合体尿激酶原进行了高效表达,表达量分别为1200~1800IU/(106细胞·ml)和1800~2400IU/(106细胞·ml).经过CM-SepharoseFF离子交换层析、SephadexG-75凝胶过滤层析及超滤浓缩对野生型及突变型进行了部分纯化,并对其性质进行了初步研究.表明突变体尿激酶原保留了全部尿激酶原的纤溶酶原激活活性,并具有很强的抗血小板聚集活性.RGDS-尿激酶原嵌合体兼有溶栓及抗栓活性 相似文献
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家蚕BmN细胞的微载体培养及HBeAg的高效表达 总被引:1,自引:0,他引:1
选择微载体Cytodex3对家蚕BmN(从SilkwormBombyxmori获得的细胞系)细胞进行高密度培养,并获得成功。观察了家蚕BmN细胞在微载体Cytodex3上的贴壁分布,研究了不同接种浓度与微载体浓度时细胞的生长情况,并筛选出最佳的技术参数。在1000mL滚瓶中用微载体Gytodex3培养家蚕细胞,在合适的培养条件下(细胞接种浓度3.6×105细胞/mL、微载体浓度5g/L),5d后,细胞的终密度达到2.8×106细胞/mL,细胞增长指数为7.9。在细胞指数生长期(传代后48~60h)用载有HBeAg基因的重组病毒(rBmHBe)接种(感染量为0.4PFU/细胞),5d后,培养上清中HBeAg滴度为1∶9.6×104,是用方瓶静止培养的家蚕细胞表达量的3倍。 相似文献
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表达人尿激酶原突变体的重组山羊乳腺特异性表达慢病毒载体的构建 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:构建山羊乳腺特异性表达尿激酶原突变体的重组慢病毒载体,证明其表达的有效性。方法:将劳氏肉瘤病毒增强子/启动子、复制缺陷型人免疫缺陷病毒(HIV-1)的5′端长重复序列(LTR)、HIV-1ψ包装信号、HIVRev反应元件、山羊β-酪蛋白调控序列、尿激酶原M13cDNA、AU3/3′LTR、牛生长激素(BGH)基因poly(A)依次连接,构建乳腺特异性表达的慢病毒载体,通过体外转染人乳腺癌细胞系MCF-7、中国仓鼠卵巢细胞及泌乳山羊乳腺注射证明其表达有效性。结果:酶切鉴定证实山羊乳腺特异性表达载体构建正确;将该载体转染细胞,采用溶圈法和Western印迹检测证实了其表达的有效性;慢病毒载体注射到泌乳山羊的乳腺,在乳汁中也检测到了尿激酶原的表达。结论:为在转基因动物乳腺中表达尿激酶原突变体奠定了基础。 相似文献
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尿激酶原测定方法的改进及对GL—11G工程细胞表达尿激酶原水平稳定性观察 总被引:1,自引:0,他引:1
该文对原来的纤溶板法进行了改进,使测定结果更可靠,精确,并节省成本。用该法对CL-11G工程细胞表达尿激酶原水平的稳定性观察表明,经104代连续传代,其表达量终始保持在559.6±96.31IU/106细胞/天左右,符合生产细胞的要求。 相似文献
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转小鼠金属硫蛋白cDNA枸杞的获得及其检测 总被引:2,自引:0,他引:2
小鼠金属硫蛋白-IcDNA通过根癌农杆菌介导转枸杞,枸杞体内的表达产物对重金属镉有一定的抗性。用带有嵌合mMT-IcDNA及Ca MV35s启动子的含非致瘤性Ti持粒载体的根癌农杆菌LBA4404感染枸杞幼茎外植体,在含有卡那霉素100μg/mL和50μmol/L Cd^2+的选择培养基上筛选转化的愈伤组织,并在含卡那霉素50μg/mL和100μmol/L,Cd^2+的分化培养基上得到再生小芽。 相似文献
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采用PCR重叠延伸法和基因重组技术构建了人尿激酶原cDNA序列中缺失150~156位氮基酸的突变体,以COS-7细胞中获得暂时性表达以及在CHO细胞中稳定高效表达,其表达水平为450~500IU/106cell/24h,表达产物经SDS-PAGE电转溶实验和westemblot分析证明,细胞分泌的Pro-UK突变体与天然Pro-UK以及完整全长DNA序列表达Pro-UK的分子量相同,为54kDa.绝大多数为单链,比完整cDNA序列表达产物的单链比例明显增高,与纤维蛋白的亲和性有所提高。 相似文献
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高山被孢霉ATCC16266△^6—脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达 总被引:16,自引:0,他引:16
△^6-脂肪酸脱氢酶基因是形成γ-亚麻酸的关键酶。从含有高山被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因的重组质粒pT-MACL6中,酶切出1.4kb的目的片段,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pYES2.0,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒pYMAD6,用醋酸昔方法转化到酿洒酵母的缺陷型菌株INCSc1中,在SC-Ura合成培养基中,选择得到酿酒酵母工程株YMAD6。在合适的培养基及培养条件下,加入外源底物亚油酸,经半乳糖诱导后,收集菌体。通过GC-MS对酵母工程株进行脂肪酸色谱分析,结果表明,产生了31.6%的γ-亚麻酸,边是迄今为止,国内外△^6-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中表达量最高的报道。 相似文献
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目的:构建stathmin特异性SiRNA质粒表达载体,探讨其对鼻咽癌5-8F细胞stathmin的沉默作用.方法:合成用于stathmin基因特异性干扰表达的DNA片段,经退火形成双链DNA片段,片段克隆到质粒表达载体pGenesil 1.1上.载体导入JM109菌株进行筛选与扩增,采用酶切和测序对克隆表达载体进行鉴定.应用脂质体将鉴定后的重组表达质粒载体转入鼻咽癌5 -8F细胞,RT-PCR与Western Blot分析stathmin基因表达.结果:经酶切和测序鉴定,插入SiRNA质粒表达载体的stathmin特异性碱基序列和方向正确.重组质粒表达载体转染鼻咽癌细胞后,细胞转染效率达78.8 ±6.8%,stathmin基因在鼻咽癌中的表达明显下降.结论:构建的stathmin基因SiRNA质粒表达载体能抑制stathmin的表达. 相似文献
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应用PCR扩增RANTES-KDEL基因,鉴定后与真核表达载体pCMV-S/K连接,构建成HIV-1辅受体的配体,趋化因子RANTES和SDF-1的融合表达载体pCMV-R-K-S-K,酶切鉴定和测序证明成功构建了pCMV-R-K-S-K融合表达载体。脂质体介导pCMV-R-K-S-K转染HeLa细胞,间接免疫荧光证实了RANTES和SDF-1可高效表达于HeLa细胞。细胞表明构建的pCMV-R-K-S-K融合表达载体能在HeLa细胞中高效表达,可用于下一步的HIV-1感染实验。 相似文献
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随着杆状病毒载体和筛选方法的不断改进,通过Bac-to-Bac方法可以使杆状病毒最大重组率达到100%,缩短了构建重组载体的时间,极大提高了工作效率。另外,研究者开发了一些新的宿主域扩大的昆虫杆状病毒载体,能够在家蚕或蛹内进行高水平表达重组蛋白。昆虫杆状病毒表达系统具有完备的翻译后加工修饰功能和高效表达外源蛋白的能力等特点,是一种非常理想的真核表达系统。利用该表达系统现已成功表达了约千种外源蛋白。以重组杆状病毒为载体的昆虫表达系统、外源基因在该表达系统中的表达情况及在农业领域中的应用进行了介绍。 相似文献
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应用PCR扩增RANTES-KDEL基因,鉴定后与真核表达载体pCMV-S/K连接,构建成HIV-1辅受体的配体、趋化因子RANTES和SDF-1的融合表达载体pCMV-R-K-S-K,酶切鉴定和测序证明成功构建了pCMV-R-K-S-K融合表达载体.脂质体介导pCMV-R-K-S-K转染HeLa细胞,间接免疫荧光证实RANTES和SDF-1可高效表达于HeLa细胞.结果表明构建的pCMV-R-K-S-K融合表达载体能在HeLa细胞中高效表达,可用于下一步的HIV-1感染实验. 相似文献