幽门螺杆菌动物模型的应用进展

在幽门螺杆菌(Hp)研究中,动物模型可以复制Hp相关疾病,研究Hp致病机制、药物治疗效果以及评价Hp疫苗治疗和保护作用.本文综述了各种Hp动物模型的应用价值.     

幽门螺杆菌尿素酶B单位DNA疫苗的构建及鉴定

定植于人胃粘膜的幽门螺杆菌是导致慢性感染的最常见病原微生物之一 ,全世界约有 5 0 %以上的人感染过Hp。 1994年世界卫生组织 (WHO)把Hp列为一类致癌因子。目前用抗生素等治疗Hp感染存在一些缺陷 ,因此研制预防和治疗性Hp疫苗具有重要的意义。本研究首先用PCR法扩增获得了ureB基因 ,亚克隆至pMD 18载体 ,并最终将ureB基因克隆至真核表达载体pTCAE。对阳性克隆子pT ureB用PCR、酶切及测序的方法进行了鉴定 ,鉴定后的 pT ureB即为候选的Hp核酸疫苗。进一步将疫苗体外转染CHO细胞 ,用抗UreB多抗检测培养上清 ,证实了UreB蛋白的…     

幽门螺杆菌疫苗诱导的免疫保护反应及临床试验研究进展

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是一种微需氧、寄生于胃黏膜表面的革兰阴性致病菌,可导致各种不同的疾病,如慢性活动性胃炎、胃和十二指肠溃疡,甚至包括胃黏膜相关淋巴样组织(mucosa-associated lymphoid tissue,MALT)淋巴瘤和胃腺癌等恶性疾病。目前根除Hp主要依靠包括2种抗生素、铋剂和质子泵抑制剂(proton pumpinhibitors,PPI)在内的四联疗法。随着Hp耐药性的增强,研发Hp疫苗成为防治Hp感染的新途径。Hp疫苗能够诱导机体产生抗原特异性血清IgG和黏膜sIgA体液免疫反应以及抗原特异性CD4+T细胞免疫反应等的有效免疫保护反应。     

幽门螺杆菌相关保护性抗原

幽门螺杆菌(Hp)是人类上消化道疾病的重要致病菌,为慢性胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡的主要病因。1994年国际癌症研究所将Hp认定为第一类致癌因子。幽门螺杆菌疫苗的研究近年来取得了很大的进展,本文对幽门螺杆菌主要保护性抗原的研究及其特征作了概述,并对未来抗原和疫苗的研究方向进行展望。     

幽门螺旋杆菌重组尿素酶B亚基的纯化及其免疫学性质的研究

目的:幽门螺旋杆菌(Hp)尿素酶是Hp重要的定制因子和致病因子,Hp尿素酶活性位点位于Hp尿素酶B亚基(UreB),研发基于UreB的Hp疫苗是一种很有前景的防治Hp感染的策略。方法:主要利用基因克隆技术从幽门螺旋杆菌标准菌株SS1(Hp SS1)获得Hp尿素酶B亚基基因,并构建含有重组Hp尿素酶B亚基(rUreB)基因的重组表达载体pET-rUreB及其重组菌株;重组菌株经蛋白表达和优化后,利用Ni-NTP镍离子亲和层析和DEAE Sepharose FF阴离子交换层析纯化重组尿素酶B亚基(rUreB),并进一步通过腹腔注射免疫BALB/c小鼠,研究rUreB的免疫学性质。结果:通过基因克隆技术成功获得了Hp尿素酶B亚基基因,并成功构建了重组表达载体pET-rUreB及其重组菌株BL21(DE3)/pET-rUreB,经蛋白表达优化及纯化,可获得高纯度(96.5%)的重组蛋白rUreB。重组蛋白rUreB辅以弗氏佐剂腹腔注射免疫BALB/c小鼠,经间接ELISA鉴定小鼠能够产生针对天然Hp尿素酶和UreB的高滴度特异性抗体,且能够显著性抑制Hp尿素酶的活性。结论:重组Hp尿素酶B亚基能够在大肠杆菌表达系统中获得较高水平的表达,具有较高的免疫学特异性,其抗体能够有效抑制Hp尿素酶活性。为研究基于尿素酶的防治Hp感染的Hp疫苗奠定了一定的实验基础。     

幽门螺杆菌重组蛋白脂质体疫苗免疫保护作用的动物实验研究

探讨幽门螺杆菌重组蛋白脂质体疫苗的免疫预防作用及可能的免疫机制.用逆向蒸发法制备以卵磷脂和胆固醇为膜组分包裹的重组蛋白和/无免疫佐剂的口服疫苗,并用透射电镜测定其粒径.BALB/c小鼠分为6组,分别通过灌胃方法给予PBS、空白脂质体、UreB重组蛋白 CT、脂质体包裹UreB重组蛋白、脂质体包裹UreB重组蛋白和CT、脂质体包裹(UreB Kat CT),每周1次共4次,末次攻击2周再用活幽门螺杆菌(Hp)攻击3次,5周后处死小鼠,行胃组织快速尿素酶试验、Hp的定植半定量、炎症程度及其炎症活动度的评分.RT-PCR检测小鼠脾淋巴细胞中γ-干扰素(INF-γ)和白细胞介素-4(IL-4)表达.脂质体疫苗电镜下负染,显示粒径为(0.7±0.2)μm.PBS组、空白脂质体组、UreB重组蛋白 CT组、脂质体包裹UreB重组蛋白组、脂质体包裹UreB重组蛋白和CT组、脂质体包裹(UreB Kat CT)组的免疫保护率分别为0(0/11)、0(0/11)、58.3%(7/12)、54.5%(6/11)、63.6%(7/11)、75.0%(9/12),UreB重组蛋白 CT组免疫保护率与脂质体包裹UreB重组蛋白组比较无显著性差异(P>0.05),脂质体包裹UreB重组蛋白 CT组免疫保护率与脂质体包裹(UreB Kat CT)组比较有显著性差异(P<0.05).各疫苗组Hp定植评分均明显低于PBS和脂质体对照组(P<0.01),且UreB Kat双价疫苗组较三个单价疫苗组比较也有显著性差异(P<0.05).疫苗组不仅能降低Hp的定植,而且能减轻Hp造成的小鼠胃黏膜的局部慢性炎症反应(P<0.05),但各疫苗组间比较未见显著性差异(P>0.05).Hp攻击后,与对照组比较,各疫苗组脾淋巴细胞INF-γmRNA水平较低(P<0.05),而IL-4mRNA水平则较高(P<0.05),各疫苗组间比较未见显著性差异(P>0.05).研究表明,在小鼠Hp感染模型中脂质体能部分代替霍乱毒素的免疫佐剂作用,在Hp攻击后,未经免疫小鼠体内诱导以Th1为主应答,免疫小鼠体内则诱导以Th2为主的免疫应答.     

幽门螺杆菌致人胃病的小鼠模型研究

目的建立幽门螺杆菌致人胃病的小鼠模型.方法用Ⅰ型幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)对三种SPF级小鼠(BALB/c、NIH、 KM)采用循环滴喂攻击等方法处理,从菌体定值、抗体水平、病理变化三个方面分14、39、69、105 d进行测试.结果 Hp可持续定植于各供试小鼠胃粘膜上,并刺激Hp抗体(IgG)维持一较高水平,Hp在小鼠上主要引起以胃粘膜变性坏死为主,伴有淋巴细胞浸润的炎症反应,这为Hp致人胃病的症状相似.结论为Hp的致病机理,治疗药物和疫苗研究提供了良好的小动物模型.     

幽门螺旋杆菌ATCC 43504感染BALB/c小鼠动物胃炎模型的建立及分析

利用幽门螺旋杆菌标准菌株建立稳定可靠的幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染小鼠胃炎模型对Hp疫苗研制、Hp致病机制的研究及抗Hp药物的筛选具有重要意义。通过灌胃国际标准菌株幽门螺旋杆菌Hp ATCC 43504,构建了BALB/c小鼠动物胃炎模型。利用小鼠胃部Hp尿素酶活性检测、Hp的定量培养、PCR检测、组织病理学等多种方法鉴定BALB/c小鼠动物胃炎模型。通过Hp诊断试剂盒检测,造模组小鼠的胃组织能使Hp尿素酶试剂变色,呈现玫瑰红色,而健康小鼠的胃组织不能使Hp尿素酶试剂变色,依旧呈现黄色;通过小鼠胃组织匀浆液培养Hp,造模组小鼠的胃组织匀浆液均可在BHI血平板长出Hp菌落,而对照组小鼠的胃组织匀浆液不能培养出Hp菌落;利用PCR对造模组和对照组BALB/c小鼠的胃组织进行Hp检测,造模组小鼠胃组织可扩增出150 bp的DNA产物,而对照组小鼠胃组织无扩增产物;通过HE染色法观察小鼠胃部病理变化和炎症情况,与健康BALB/c小鼠比较,造模组小鼠胃粘膜和粘膜下层有大量白细胞浸润,胃部炎症明显。利用国际标准菌株Hp ATCC 43504菌株成功构建了BALB/c小鼠胃炎模型,为评价防治Hp感染药物的效果奠定了实验基础。     

高效表达幽门螺杆菌UreB重组蛋白工程菌的构建

克隆表达幽门螺杆菌(Hp)的尿素酶B亚单位(UreB)重组蛋白,可为Hp疫苗开发和快速诊断试剂盒的研究奠定基础。用PCR方法由幽门螺杆菌染色体DNA扩增UreB基因片段,将其融合插入原核表达载体pQE30中,并在M15大肠杆菌表达。经酶切、测序分析,包括部分融合载体基因在内的重组UreB基因片段由1773bp组成。为编码591个氨基酸残基的多肽。SDS-PAGE分析显示重组表达的目的蛋白相对分子量约为66kD,表达量点菌体总蛋白的23．5％,并经免疫印迹分析证实被幽门螺杆菌感染的阳性血清可与纯化UreB重组蛋白发生特异性的结合反应。UreB重组蛋白具有良好的抗原性,将有可能成为一种有效蛋白质疫苗以及快速诊断试剂盒用于Hp感染的防治和检测。     

幽门螺杆菌空泡毒素N端的变异分析

空泡毒素(VacA)是幽门螺杆菌(Hp)一个重要的毒力因子,口服纯化VacA可以对小鼠再感染产毒Hp菌株产生有效保护.然而,野生型VacA蛋白由于其致胃上皮细胞损伤作用而不能成为候选疫苗.尽管现在认为基因水平灭活毒力VacA蛋白可以成为合适的候选疫苗,但基因点突变是否可以将VacA细胞毒活性降低足够水平尚无定论.本文利用哺乳动物细胞瞬时转染系统研究VacA发挥致空泡化作用的最小活性片段及其特征,并且对毒素功能有重要作用的区域和氨基酸残基进行突变研究.     

幽门螺杆菌重组腺病毒双价疫苗的构建及免疫学评价

幽门螺杆菌(Hp)是导致胃炎、消化道溃疡和胃癌的的主要病原菌.利用基因重组技术,成功将Hp的ure B和hsp A基因融合.将ure B-hsp A融合基因成功构建到腺病毒载体上.检测结果表明,该重组腺病毒具有侵染真核细胞能力,且能在真核细胞中表达目标抗原.以血清中IgG和新鲜粪便中sIgA,评价其免疫效果,结果显示,该重组腺病毒载体双价疫苗能在小鼠体内激发体液免疫和黏膜免疫反应.     

含幽门螺杆菌CagA、UreB蛋白与霍乱肠毒素B亚单位（CTB）融合基因的植物表达载体的构建及遗传转化

幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染是慢性胃炎和消化性溃疡的主要病因,与胃癌和胃粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤的发生也密切相关。目前所用的疫苗制造成本高、运输费用贵,然而利用转基因植物生产的植物疫苗成本低廉、服用方便是现有疫苗的良好替代品。将Hp相关蛋白与免疫佐剂CTB的融合基因(ctb-linker-cagA和ctb-linker-ureB)利用PCR、酶切、连接等一系列方法从载体p1300-WxCLCN和p1300-WxCLUN中重组到载体pCAMBIA2301中(含35S启动子),重组载体分别命名为p2301-35SCLCN和p2301-35SCLUN。通过冻融法将载体导入农杆菌EHA105菌株中,以农杆菌介导的方法,将重组载体p2301-35SCLCN和p2301-35SCLUN转化烟草黄苗榆和心叶烟,获得了具有卡那霉素抗性再生植株,经过酶切、PCR、GUS染色和PCR-Southern鉴定结果表明,目的基因分别正确插入载体中并稳定整合到植株中,为利用植物反应器生产幽门螺杆菌疫苗奠定了坚实的基础。     

幽门螺杆菌表面抗原免疫保护作用的体外与活体研究

目的：调查幽门螺杆菌（Hp)几种表面蛋白体外对T细胞增殖的影响和在小鼠体内的免疫保护作用。方法：评价Hp全菌抗原、尿原酶（Urease)、黏附素（hpaA)、外膜蛋白25（Hop25)和38（Hop38)对人外周血T细胞及小鼠CD4^ T细胞增殖的影响;与佐剂合用,评价上述重组蛋白对小鼠Hp感染的免疫预防作用。结果：Urease和Hop25可刺激人及鼠T细胞增殖,hapA只能刺激Hp^ PBL增殖,而Hop38则有毒性作用;Hop25和Hop38均可产生60％的完全保护,hpaA可产生100％的部分保护即降低细菌定植密度,而Urease只能产生40％的部分保护。结论：外膜蛋白可能是一组高效的Hp疫苗免疫原;其长期免疫效果及对T细胞功能的活体调节作用尚需进一步评价。国际上尚未见相关报道。     

桂林市人群体Hp遗传性多态现象的研究

本文采用垂直板不连续系统聚丙烯酰胺凝胶电泳对桂林市918名居民无关个体的血清Hp的表现型进行了研究。结果常见的三种表型频度分别为: Hp 1-1 0.121; Hp2-1 0.439; Hp 2-2 0.425, 其基因频率为: Hp1 0.340; Hp2 0.644。同时观察到Hp0型的表型频度为0.0153。还观察到Hp 2-1 M、Hp 2-1(Haw)、Hp 2-1 J、Hp 2-H、C-1和2-Z等变异型。对Hp型在男女性别中的表型频度的调查结果是: Hp1-1男性: 0.101, 女性: 0.135, Hp 2-1男性: 0.475, 女性: 0.409, Hp 2-2男性: 0.405, 女性: 0.446, Hp 0男性: 0.02, 女性:0.01。另外还观察到16-24岁、25-34岁和35-66岁各年龄组的Hp1基因频率基本相等。     

幽门螺杆菌过氧化氢酶基因的克隆、序列测定及其生物信息学分析

幽门螺杆菌(Helicobacter pylorl,Hp)感染是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的主要病因,与胃腺癌、胃粘膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤的发生亦密切相关。其有效抗原成份过氧化氢酶可刺激机体产生保护性的免疫反应。用高保真PCR扩增系统扩增出过氧化氢酶基因片段,将其定向插入载体pET-22b( ),对其全序列进行了测定。并以生物信息学软件分析其生物学特性。克隆的过氧化氢酶基因序列与报道的序列完全一致,并显示出良好的抗原性和疏水性。这一研究获得了序列正确的过氧化氢酶基因,为将来以过氧化氢酶分子作抗原的Hp疫苗研制工作打下了良好基础。     

幽门螺杆菌在牙菌斑及胃粘膜分布研究

目的:探讨幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)在牙菌斑及胃粘膜分布状况。方法:采用聚合酶链式反应(polym erase chain reaction,PCR)技术对80 例慢性胃溃疡患者的牙菌斑及胃粘膜组织进行Hp 检测。结果:48 例胃粘膜Hp 阳性的患者中12 例牙菌斑Hp 阳性;胃粘膜Hp 阴性的患者无一例牙菌斑Hp 阳性;胃Hp 阳性检出率大于牙菌斑。结论:幽门螺杆菌不仅存在于胃粘膜组织中,也存在于口腔牙周组织中。提示牙菌斑可能是Hp 的重要寄居地。     

幽门螺旋杆菌诱发肝硬化大鼠高氨血症的实验研究

目的：探讨幽门螺旋杆菌与肝硬化大鼠高氨血症的相关性。方法：选取32 只SD大鼠,将其随机分为正常组(n=8)、Hp 感染组 (n=8)、肝硬化组(n=8)、肝硬化合并Hp 感染组(n=8)。肝硬化组及肝硬化合并Hp 感染组给予50%四氯化碳橄榄油腹腔注射;正常 组与Hp 感染组给予同量的橄榄油腹腔注射。从建立模型的第9 周开始,Hp 感染组与肝硬化合并Hp 感染组每周感染2 次Hp,共 8 次。记录各组大鼠的一般状态,检测大鼠血氨水平及胃粘膜Hp数量。结果：与正常组比较,肝硬化组及肝硬化合并Hp感染组体 重较低(P＜0.05);与肝硬化组比较,肝硬化合并Hp 感染组体重较低(P＜0.05)。与正常组比较,其余各组胃粘膜Hp 数量较高(P＜ 0.05),与肝硬化组与Hp 感染组比较,肝硬化合并Hp 感染组胃粘膜Hp 数量高(P＜0.05)。与正常组比较,肝硬化组及肝硬化合并 Hp 感染组血氨水平高(P＜0.05),与肝硬化组比较,肝硬化合并Hp 感染组血氨水平高(P＜0.05)。结论：幽门螺旋杆菌能诱发肝硬 化大鼠高氨血症     

幽门螺杆菌AlpA基因中四种黏附素基因保守区的克隆、表达、纯化及鉴定

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）感染是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的主要病因,与胃腺癌、胃黏膜相关淋巴样组织（MALT）淋巴瘤的发生亦密切相关.鉴于Hp已证实的四种粘附素保守区（AB）是外膜蛋白（OMP）和膜孔素(porin)样成分,而外膜蛋白和膜孔素样成分是优秀的疫苗候选抗原.用PCR技术扩增AB基因,将其定向插入pET-22b（+）载体,在BL21（DE3）大肠杆菌中表达.测序显示AB基因长588 bp,编码195个氨基酸.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶扫描分析,AB基因表达的蛋白质分子质量约为22.5 ku,其重组蛋白质表达量占菌体总蛋白质的29%,表达产物经亲和层析纯化后蛋白质纯度达96%.经免疫印迹证实该重组蛋白可以被AlpA免疫兔血清所识别.AB蛋白的获得为进一步研究Hp黏附素保守区的分子黏附机制和免疫防治作用提供了基础.     

消化性溃疡与幽门螺杆菌关系的内窥镜探查

目的:探讨幽门螺杆菌(Hp)与消化性溃疡(PU)的关系。方法:检测167例PU患者Hp阳性率,使用胃镜观察溃疡形态、大小和部位。结果:167例PU患者Hp阳性检出率为87.43%,胃溃直径大于1.5 cm者与,胃溃直径小于0.5cm,溃疡处于活动期者与愈合期和瘢痕期者,Hp阳性检出率有显著差异(P<0.05)。结论:Hp感染与溃疡的发生有密切关系,溃疡患者病情越重,Hp感染程度越高,但Hp阳性溃疡并不加重消化道出血现象发生。     

500例广东潮汕人群血清结合珠蛋白（Hp)分型的调查

应用聚丙烯酸胺凝胶电泳(PAGE）法对500名潮汕人群进行了Hp遗传分型的调查,分析结果：Hp1-1型81名,占16.2%, Hp2-1型168名,占33.6%, Hp2-2型252名,占50,4%, Hp0-0型1名,占0.2%。经过统计学处理,500例不同性别,年龄的Hp型分布分别无显著性差异(x²=3.27, P> 0.05)