猪鼻支原体膜蛋白p37酶切修饰的质谱分析

p37是猪鼻支原体的膜脂蛋白,有潜在的致癌活性.在对真核表达的p37蛋白分析时发现,p37表现为不同大小的分子片段,提示其存在蛋白质修饰.为了对p37的确切修饰进行分析,进而为其功能研究奠定基础,在构建不同融合蛋白表达质粒并证明其存在修饰蛋白的基础上,通过飞行质谱及N端氨基酸序列测定,分析了p37蛋白的精确分子量和酶切修饰的大致部位,发现3种形式的p37蛋白的精确分子量分别为47 644、46 105和43 984.p37蛋白在其N端被信号肽酶切去1个21肽,在其C端被蛋白酶切去1个18～26小肽后,成为分子量为43 984的成熟p37蛋白. 对p37不同酶切修饰片段的分析将有助于对p37蛋白生物学功能及意义的研究.     

生物素化ATP硫酸化酶的表达、固定化与应用

现代大规模焦测序技术的产生是DNA测序技术的一次革命,其关键技术之一是得到高活性的、固定于磁性微球表面的ATP硫酸化酶．生物素化的ATP硫酸化酶可以通过生物素与亲和素之间的特异结合特性固定在包被亲和素的磁性微球表面,但是利用化学修饰法将ATP硫酸化酶进行生物素化修饰很可能会影响酶的活性．利用融合表达策略,将大肠杆菌生物素酰基载体蛋白C端87个氨基酸肽段(BCCP87)与ATP硫酸化酶在大肠杆菌内融合表达,经SDS-PAGE和Western blot分析,表达的融合蛋白分子质量约为64 ku,并且能够在大肠杆菌内被生物素化．生物素化的ATP硫酸化酶能够与亲和素包被的磁珠结合,固定后的ATP硫酸化酶具有活性,并且能够用于定量检测焦磷酸盐(PPi)和焦测序,为今后建立高通量大规模焦测序系统提供了一个有效的工具酶．     

蛋白修饰途径中结合酶在免疫应答中的功能

泛素化途径和SUMO化途径是真核生物细胞内两种很重要的蛋白修饰途径,结合酶为蛋白修饰途径中的第二个酶,对于靶蛋白的修饰具有十分重要的作用。近年来,在研究细胞遭受病原体入侵时产生的免疫应答中屡次鉴定出结合酶的参与。对于结合酶在免疫反应中的功能多样性从病毒和细菌引起的免疫应答两个方面,对泛素结合酶进行了总结,同时也介绍了SUMO结合酶在免疫反应中的研究进展。     

断裂型内含肽在蛋白生产和生物工程中的应用

蛋白反式剪接是蛋白翻译后修饰的一种特殊机制,这一反应由断裂型内含肽自我催化完成,不需要酶和其他因子参与。与常规顺式的蛋白剪接不同的是,反式剪接是基于断裂型内含肽由N端和C端这两段多肽的高亲和力,精准地构建成一个具有剪接活性的内含肽蛋白质。反式剪接已被发展成新的生物技术应用于生产环化蛋白、构建蛋白定点与定时表达的载体和转基因植物,以及改造cDNA文库技术等。     

人修饰型降钙素和鼠酰胺化酶基因在昆虫细胞中的偶联表达

人降钙素 (hCT)是 32氨基酸的多肽激素 ,C-端为α脯氨酰胺结构 ,具有调节体内钙、磷代谢等许多重要生理功能。用重组昆虫杆状病毒表达系统 ,偶联表达合成的人修饰型降钙素 (hmCT)基因与GST融合基因和大鼠酰胺化酶 (PAM)基因 ,再用抗hmCT或抗PAM抗体 ,既检测到由昆虫细胞表达的GSThmCT产物也检测到PAM产物。经GSH 琼脂糖凝胶亲和层析 ,分离纯化GSThmCT融合蛋白。这种蛋白修饰酶与底物在真核细胞偶联表达也将适用于其他生物活性肽的体外表达     

用飞行时间质谱研究尿素对重组人肝再生增强因子的修饰作用

为研究尿素在变性、复性过程中对重组人肝再生增强因子 (recombinanthumanaugmenterofliverregeneration ,rhALR)的修饰作用及被修饰后蛋白质的结构和生物活性 ,采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪 (MALDI TOF MS)测定蛋白质分子量及以胰蛋白酶酶解后的蛋白质各肽段的分子量 ,验证蛋白质是否被修饰 ,以急性肝损伤动物模型检测被修饰后蛋白质的生物活性。结果包涵体用尿素变性、复性 ,再经纯化获得的rhALR分子量为 30780 ,比理论分子量 30 0 98增加 6 82 ,且含有赖氨酸残基的酶解肽段分子量增加 4 3。采用盐酸胍变性、复性 ,再经纯化获得的rhALR分子量为 30 0 87,与理论值基本吻合。含赖氨酸残基的酶解肽段分子量亦正常。说明尿素可对rhALR蛋白肽链上的赖氨酸残基修饰。活性实验表明虽然尿素分解释放的氰酸盐在变性复性过程中能与蛋白质肽链上赖氨酸的ε氨基结合 ,造成rhALR蛋白质分子量增加 ,但被修饰的rhALR仍能提高四氯化碳致肝损伤小鼠的存活率。     

核糖核酸酶A的s-蛋白与DNA的结合作用

核糖核酸酶A具有DNA结合蛋白的作用。本文报道,核糖核酸酶A经枯草杆菌蛋白酶作用后,被切断而形成一个20肽和s-蛋白。分离纯化后的s-蛋白完全丧失了水解RNA的酶活性,却完全保持着作为DNA结合蛋白的活性。这个结果说明核糖核酸酶A表现RNA水解酶活力与其同DNA的结合作用对结构的要求有所不同。对s-蛋白与双链及单链DNA结合作用的研究还表明,在这种结合过程中s-蛋白分子中的酪氨酸和苯丙氨酸残基的萤光发生淬灭作用,可能系因s-蛋白中的这些氨基酸残基直接参与了与DNA的结合,RNaseA经枯草杆菌蛋白酶作用切除s-肽后产生的s-蛋白的α-螺旋含量由RNaseA的17.5%增加到23.7%。     

核糖核酸酶A的s-蛋白与DNA的结合作用

核糖核酸酶A具有DNA结合蛋白的作用。本文报道,核糖核酸酶A经枯草杆菌蛋白酶作用后,被切断而形成一个20肽和s-蛋白。分离纯化后的s-蛋白完全丧失了水解RNA的酶活性,却完全保持着作为DNA结合蛋白的活性。这个结果说明核糖核酸酶A表现RNA水解酶活力与其同DNA的结合作用对结构的要求有所不同。对s-蛋白与双链及单链DNA结合作用的研究还表明,在这种结合过程中s-蛋白分子中的酪氨酸和苯丙氨酸残基的萤光发生淬灭作用,可能系因s-蛋白中的这些氨基酸残基直接参与了与DNA的结合,RNaseA经枯草杆菌蛋白酶作用切除s-肽后产生的s-蛋白的α-螺旋含量由RNaseA的17.5%增加到23.7%。     

酵母表面展示技术应用的最新进展

酵母表面展示(yeast surface display, YSD)技术是一种将外源靶蛋白基因序列与特定的载体基因序列融合后导入酵母细胞，利用酵母细胞内蛋白转运机制将靶蛋白表达并定位于酵母细胞表面的技术，最常用的是α-凝集素表达系统。酵母细胞具有真核细胞翻译后修饰机制，能够帮助目的蛋白正确折叠，可以用来展示各种真核蛋白，包括抗体、受体、酶和抗原肽等。酵母表面展示技术已成为生物技术和生物医学领域的强大蛋白质工程工具，结合流式细胞分选可用于改善蛋白质性质，包括亲和力、特异性、酶功能和稳定性等。本文从文库构建与筛选、抗体工程、蛋白质工程、酶工程和疫苗开发等方面对酵母表面展示技术应用最新进展进行了综述。     

化学修饰--提高酶催化性能的重要工具

讨论了化学修饰对酶的稳定性、有机溶剂溶解性、特殊条件下的活性和选择性的影响。对常见的和近期出现的酶修饰技术,包括交联酶晶体、酶蛋白侧链功能基共价修饰、酶蛋白表面修饰、结合定点突变的化学修饰、通过酶活性位点氨基酸原子置换进行化学突变等方法作了重点阐述。     

植物蛋白质SUMO化修饰体外高效检测系统

蛋白质SUMO化修饰是一种调控蛋白命运的关键修饰方式, 广泛参与植物生长发育及逆境胁迫响应。SUMO化修饰过程主要由激活酶(E1)-结合酶(E2)-连接酶(E3)组成的级联酶促反应催化, 其关键酶组分将SUMO分子缀合至底物蛋白的赖氨酸残基, 形成共价异肽键以完成SUMO化修饰过程。该文报道了1种植物蛋白质SUMO化修饰体外高效检测系统, 通过在大肠杆菌(Escherichia coli)中构建拟南芥(Arabidopsis thaliana) SUMO化修饰的关键通路实现对底物蛋白的SUMO化修饰, 结果可通过免疫印迹进行检测。该系统可以简化植物蛋白质SUMO化修饰的检测流程, 为植物细胞SUMO化修饰的功能研究提供了有力工具。     

分子生物学技术讲座（二）——分子克隆中所用的酶

限制性内切酶及其它DNA与RNA修饰酶是分子克隆技术的基本工具。1限制性内切醉和DNA甲基化酶限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性内切酶识别序列的特定的DNA序列或附近的序列,并在此切割DNA双链。它可以分成3类：Ⅰ类和Ⅲ类在同一蛋白分子中兼有修饰（甲基化）作用及依赖于ATP的限制（切割）活性。Ⅰ类酶结合于识别序列,但随机切割DNA;Ⅲ类酶能在识别序列位点切割DNA。在分子克隆中1类和皿类酶都不常用。D类限制一修饰系统限制性内切醇和修饰（甲基化）酶不在同一蛋白分子中,限制性内切酶能专一地切割识别序列,并不依…     

降钙素基因相关肽家族的受体活性修饰蛋白

降钙素基因相关肽家族中的降钙素、胰淀粉样酶、两种降钙素基因相关肽和肾上腺髓质素具有相似的结构。受体活性的修饰蛋白（RAMP）是新近从蟾蜍卵细胞中发现并克隆出来的蛋白质。受体活性修饰蛋白是具有单一跨膜功能域的蛋白,可调节降钙素的受体样受体（CRLR）向细胞膜的转运和识别配体的特异性。不同的RAMP可与降钙素受体试样受体或降钙素受体结合表现为对不同配体具有亲和的、不同的受体表型而决定了体内的生物学效应。RAMP1转运的末端糖基化的成熟的CRLR蛋白,使CRLR表现为功能性的降钙素基因相关肽（CGRP）受体表型;RAMP2转运的CRLP是核心糖基化的未成熟的CRLR蛋白,使CRLR表现为功能性的肾上腺髓质素（Adm）受体表型。RAMP亦可与降钙素受体作用产生Amylin受体表型。     

乙型肝炎病毒表面抗原前S区和谷胱甘肽巯基转移酶融合基因在大肠杆菌中的表达

我们构建了谷胱甘肽巯基转移酶（ＧＳＴ）和完整的或部分缺失的乙型肝炎病毒表面抗原前Ｓ区的融合基因,并在大肠杆菌中进行了表达。融合蛋白的产量随着前Ｓ区长度的增加而迅速降低,而且融合蛋白的前Ｓ区有严重的降解,主要降解位点在ｐｒｅＳ１区的ａ．ａ．７５和ｐｒｅＳ２区的ａ．ａ．１３０和ａ．ａ．１６５左右。利用蛋白降解酶系缺陷型菌株进行的研究表明,这种降解酶存在于多个大肠杆菌株中而且和大肠杆菌中的两个主要的蛋白降解酶系Ｌｏｎ和ｈｔｐＲ无关。具有重要生物学功能的前Ｓ区肽段（ｐｒｅＳ１ａ．ａ．１－６５）因含有阻止分泌的滞留顺序而无法在哺乳动物细胞和酵母中大量表达,但滞留顺序的存在并没有影响含有这一肽段的融合蛋白在大肠杆菌中的表达和产物的纯化。ＧＳＴ融合表达系统产量高,纯化快速简便。用这一方法大量表达并得到的这一肽段不仅是研究乙型肝炎病毒的分子生物学的重要材料,而且可以作为新一代乙型肝炎疫苗的主要组成成分。     

酶的酰胺化作用一步法

<正> 美国 Unigene 实验室发现一种酶,这种酶能够迅速有效地使肽的羧基终端酰胺化。细菌和酵母不能使蛋白质酰胺化,但许多重要的人类蛋白,包括降血钙素、生长激素释放因子、促皮质素释放因子、胰酶分泌素和其它神经肽和胃肽。(可以通过 rDNA 来制造),需要酰     

棒状链霉菌中隐性羊毛硫肽CLA 124的半体外生物合成

摘要:【目的】利用半体外生物合成方法获得棒状链霉菌中的隐性羊毛硫肽,为放线菌中羊毛硫肽资源的挖掘提供借鉴。【方法】利用nisin修饰系统,在大肠杆菌(Escherichia coli)中对隐性羊毛硫肽的核心肽进行体内修饰。修饰后产物经亲和层析和高效液相色谱(HPLC)纯化后,体外酶切反应切除前导肽,利用MALDITOFMS检测核心肽的脱水情况,并结合二级质谱解析其成环结构。【结果】获得了新的羊毛硫肽CLA 124,其核心肽脱去了4分子水,并形成2个硫醚键和一个二硫键。【结论】半体外生物合成方法可用于放线菌来源隐性羊毛硫肽的资源挖掘。     

植物SUMO化修饰及其生物学功能

SUMO化修饰是细胞内蛋白质功能调节的重要方式之一。植物中的SUMO化修饰途径由SUMO分子和SUMO化酶系组成。SUMO化修饰是一个可逆的动态过程。SUMO前体蛋白在SUMO特异性蛋白酶的作用下成熟,随后通过SUMO活化酶、SUMO结合酶和SUMO连接酶将靶蛋白SUMO化,最后SUMO特异性蛋白酶将SUMO与靶蛋白分离,重新进入SUMO化循环。初步研究表明,植物SUMO化修饰参与植物花期调控、激素信号转导、抗病防御以及逆境应答等生理过程。     

植物SUMO化修饰及其生物学功能

SUMO化修饰是细胞内蛋白质功能调节的重要方式之一。植物中的SUMO化修饰途径由SUMO分子和SUMO化酶系组成。SUMO化修饰是一个可逆的动态过程。SUMO前体蛋白在SUMO特异性蛋白酶的作用下成熟, 随后通过SUMO活化酶、SUMO结合酶和SUMO连接酶将靶蛋白SUMO化, 最后SUMO特异性蛋白酶将SUMO与靶蛋白分离, 重新进入SUMO化循环。初步研究表明, 植物SUMO化修饰参与植物花期调控、激素信号转导、抗病防御以及逆境应答等生理过程。     

烯醇化酶1多肽共价修饰改变细胞的生长和代谢模式

文章利用斑马鱼胚胎成纤维细胞(PAC2), 研究烯醇化酶1(Enolase1, ENO1)多肽生化功能及其共价修饰的影响。首先体外合成甲基修饰、乙酰修饰、磷酸修饰和未修饰的ENO1多肽, 分别处理PAC2细胞, 然后检测处理细胞CCK-8、胞内外乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase, LDH)和二磷酸甘油酸(2-phosphoglycerate, 2-PG)相对含量; 以及线粒体和溶酶体完整性; 同时利用PCR ARRAY试剂盒比较葡萄糖代谢通路变化。结果表明不同修饰的多肽处理后, 细胞增殖, 溶酶体和线粒体形态, 以及糖代谢通路发生了不同程度的改变。为了进一步研究乙酰化修饰ENO1多肽促进细胞增殖的代谢机制, 又将乙酰化修饰的多肽和空白对照处理的PAC2细胞进行转录组测序。转录组分析进一步显示乙酰化修饰的ENO1多肽可以改变糖、脂、蛋白质代谢途径, 并激活与癌症和病毒感染病的KEGG通路。研究结果提示烯醇化酶1的多种生化功能可能是蛋白翻译后不同化学修饰的结果。     

长半衰期重组人超氧化物歧化酶的研制及性质

一种双亲有机化合物聚苯乙烯马来酸丁酯(SMA)经酰胺键与重组人铜锌超氧化物歧化酶(rhCu/Zn SOD)共价交联,制得修饰酶.当42%游离氨基被修饰时,保留酶活力为88%.酶蛋白主链结构在修饰前后变化不大.与天然酶相比,修饰酶的生物半衰期延长了22倍,抗蛋白水解酶能力亦有所增强.