CRISPR相关生物信息学基础

成簇规律间隔短回文序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）是细菌和古细菌在不断进化的过程中获得的一种适应性免疫防御机制,该结构与一些功能相关的蛋白质（CRISPR associated, Cas）合称CRISPR Cas系统。由于其致突变效率高、操作简单及成本较低的特点,近年来对CRISPR/Cas系统的研究获得越来越广泛的关注。该系统迅速在各领域中得到广泛应用,被认为是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子工具。但是,该系统存在脱靶效应、测序数据分析等挑战。为此,许多研究者开发出各种软件解决以上问题。本文着重从生物信息学的角度出发,对CRISPR/Cas系统中sgRNA的设计软件、CRISPR全基因组筛选功能基因的测序数据分析软件以及CRISPR在生物信息学中的运用作一系统综述。     

利用CRISPR／Cas9技术实现快速、经济的大鼠条件基因敲除技术

在2014年第1期的Cell Research杂志上发表了一篇利用CRISPR／Cas9技术进行大鼠条件基因敲除技术的技术性论文（Ma，et al．，Generating rats with conditional alleles using CRISPR／Cas9， Cell Research （2014）24：122-125．），这篇论文利用CRISPR／Cas9在靶基因的特定外显子产生DNA双链断裂，同时提供一个环形质粒模板，该质粒包含两端被loxP位点标记的、且与被打断外显子相同的DNA片段。在受精卵内同源重组修复系统（ homologous recombination repair pathway ）的作用下，可实现高效率的靶基因loxP位点标记，从而用于大鼠的条件性基因敲除。论文中利用该技术实现了三个甲基化酶基因（Dnmt1， Dnmt3a， Dnmt3b）loxP位点标记，效率高达30％，使得制备一个含loxP位点标记大鼠的周期仅2～3个月，成为目前为止最经济、快速的大鼠条件基因敲除技术。     

基于CRISPR/Cas技术的核酸检测研究进展

由成簇、规则间隔的短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）和CRISPR相关蛋白（CRISPR-associated protein,Cas）组成的CRISPR/Cas系统是广泛存在于多数细菌和古细菌中的一种适应性免疫系统。CRISPR/Cas系统可识别并结合外源入侵的核酸分子,之后Cas蛋白的切割活性被激活,能够对入侵的核酸分子进行切割使其降解。利用CRISPR/Cas系统特异的序列识别及切割活性,将其应用于核酸检测中,为提高检测灵敏度及特异性等性能指标提供了一种新思路。本文介绍了CRISPR/Cas系统的发展、作用机制等,对多样化的Cas蛋白在核酸检测中的代表性应用研究进行总结,进一步讨论了CRISPR/Cas技术应用于核酸检测中存在的优缺点,并对未来研究进行了展望,为基于CRISPR/Cas技术的核酸检测方法在病原微生物的检测中提供参考和依据。     

CRISPR/Cas系统在病毒感染性疾病治疗中的应用进展

CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associate)系统作为当下炙手可热的基因编辑技术,近几年在各方面取得了诸多进展,本文就CRISPR主要类型Cas蛋白的作用方式,CRISPR/Cas技术在病毒感染性疾病中的应用,作用机制,当下治疗方法进行讨论,着重对人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus,HIV）、单纯疱疹病毒I型（Herpes simplex virus-1,HSV-1）、EB病毒（Epstein-barr virus,EBV）、乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）、人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）、人类嗜神经多瘤病毒JC(Polyoma JC virus,JCV)、非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）进行综述。     

CRISPR/Cas基因编辑技术及其在作物育种中的应用

CRISPR/Cas基因编辑技术在植物基因功能研究和作物遗传改良方面具有重要应用价值,其主要依赖gRNA引导核酸内切酶在目标基因组位置产生双链断裂（DSBs）,DSBs在通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HDR）方式进行修复时,会引起靶标位置核苷酸序列的缺失、插入或者替换,从而实现基因编辑。介绍了CRISPR/Cas基因编辑技术的作用机理及发展趋势,并对CRISPR/Cas技术在主要粮食及经济作物育种中的应用进展进行了总结,以期为农作物育种提供有益的参考。     

CRISPR/Cas12a系统：核酸检测的多功能工具

规律成簇的间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）是原核生物的适应性免疫系统,对抗外来遗传物质（如质粒和噬菌体）的攻击。近年来,科学家们发现了一种新型基因编辑工具,一种强大的分子剪刀CRISPR/Cas12a系统,该系统在对靶标DNA进行切割的同时还具有对体系内单链DNA进行任意切割的活性,并将其转移到体外检测系统。本文对CRISPR/Cas12a系统组成、结构、Cas12a与Cas9的对比和CRISPR/Cas12a系统在核酸检测中的应用进行了综述。     

快速构建CRISPR/Cas9基因组靶向编辑系统

CRISPR/Cas9核酸酶作为一种新的基因组靶向编辑技术,已成功应用于多种动植物基因组修饰研究. CRISPR/Cas9作用后的阳性细胞筛选和富集是该技术的关键之一. 本研究以鸡EAV-HP（endogenous avian retrovirus-HP）基因和MSTN（myostatin）基因为例,从靶位点的选择、表达载体构建、双基因报告载体构建和核酸酶活性验证4个方面,系统研究了CRISPR/Cas9核酸酶技术平台. 结果表明,利用寡聚核苷酸直接退火方法,构建表达载体和报告载体的阳性率分别高达100%和89.5%. 报告载体的PuroR（puromycin resistant gene）和eGFP（enhanced green fluorescent protein）基因的成功表达表明,构建的CRISPR/Cas9系统能有效切割靶序列,并用于后续阳性克隆的筛选和富集. 本方法摒弃了传统分子克隆的PCR扩增和酶切处理目标基因的方法,而是利用寡聚核苷酸直接退火获得含有黏性末端的目标DNA,简化了载体构建过程,低成本且快速获得CRISPR/Cas9基因组靶向编辑系统.     

基于CRISPR/Cas系统的核酸生物传感器

近年来,CRISPR/Cas系统已经成为转录调控和基因组编辑的重要工具。除了在基因编辑领域的贡献,CRISPR/Cas系统独特的靶核酸顺式切割和非特异性单链核酸反式切割能力,在开发核酸检测的新型生物传感器方面展现出巨大潜力。构建基于CRISPR/Cas系统高灵敏度生物传感器的关键通常依赖其与不同信号扩增策略,诸如核酸扩增技术或特定信号转导方法的结合。基于此,本文旨在通过介绍不同类型的CRISPR/Cas系统,全面概述基于该系统的核酸检测生物传感器的研究进展,并重点对结合核酸扩增技术（PCR、LAMP、RCA、RPA和EXPAR）、灵敏的信号转导方法（电化学和表面增强拉曼光谱）和特殊结构设计生物传感的三大类型信号放大策略的CRISPR/Cas生物传感器进行总结和评论。最后,本文对目前的挑战以及未来的前景进行展望。     

基于CRISPR/Cas系统的纸基分析在快速检测食源性致病菌中的应用

由食源性致病菌引起的食品安全事件严重影响人类健康,开发针对食源性致病菌的快速检测技术十分必要。成簇间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）及相关蛋白（CRISPR-associated protein,Cas）是原核生物的适应性免疫系统,具有特异性识别并切割核酸序列的功能。纸基分析方法作为一种简便性好、成本低廉的分析检测工具,在快速检测领域展现出良好的前景。因此,将CRISPR/Cas系统的高效识别能力和纸基分析方法的简便性相结合可实现对食源性致病菌的快速灵敏检测。本文简要介绍了CRISPR/Cas系统用于核酸检测的概况,对第二类单Cas效应蛋白系统的特点及原理进行概述,重点综述基于CRISPR/Cas系统的试纸分析、侧向流动分析和纸基微流控装置在检测食源性致病菌方面的应用,并讨论了CRISPR/Cas系统结合纸基分析建立检测方法的优势、当前的挑战及未来的发展前景。     

基因组编辑技术及其在昆虫研究中的应用

基因组编辑技术是进行功能基因组研究的重要工具．锌指核酸酶技术（ZFNs）、类转录激活因子核酸酶技术（TALENs）以及CRISPR／Cas技术是近年来发展起来的3种主流基因组编辑技术．这3种基因组编辑技术的原理都是通过在生物基因组特定位点制造DNA断裂损伤,从而激活机体自身的DNA损伤修复机制,在此过程中引发各种变异．ZFNs是最早发展的通用基因组编辑技术,可用以实施定点敲除和定点敲入变异,但ZFNs技术的发展受限于构建难度大、成本高等缺点．TALENs技术在ZFNs基础上发展而来,较ZFNs技术而言,TALENs技术具备构建灵活度高、成本低等优势．不同于ZFNs与TALENs技术,CRISPR／Cas技术具有独特的DNA靶向机制,这种机制使其非常适合进行多位点编辑．目前,3种技术都在多种物种中成功测试,例如小鼠、斑马鱼、果蝇、线虫和家蚕．在后基因组时代,这些新技术工具必将在未来功能基因组研究中发挥重大作用．     

一种新型的CRISPR/Cas9-hLacI双链DNA供体适配基因编辑系统

在CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑中,借助于双链DNA （double-stranded DNA,dsDNA）供体模板的重组效应能够实现对目标基因组靶位点的精确编辑和基因敲入,然而高等真核生物细胞中同源重组的低效性限制了该基因编辑策略的发展和应用。为提高CRISPR/Cas9系统介导dsDNA供体模板的同源重组效率,本研究利用大肠杆菌（Escherichia coli）乳糖操纵子阻遏蛋白LacI与操纵序列LacO特异性结合的特点,通过重组DNA技术将密码子人源化优化的阻遏蛋白基因LacI分别与脓链球菌（Streptococcus pyogenes）源的SpCas9和路邓葡萄球菌（Staphylococcus lugdunensis）源的SlugCas9-HF融合表达,通过PCR将操纵序列LacO与dsDNA供体嵌合,构建了新型的CRISPR/Cas9-hLacI供体适配系统（donor adapting system,DAS）。首先在报告载体水平上对Cas9核酸酶活性、DAS介导的同源引导修复（homology-directed repair,HDR）效率进行了验证和优化,其次在基因组水平对其介导的基因精确编辑进行了检测,并最终利用CRISPR/SlugCas9-hLacI DAS在HEK293T细胞中实现了VEGFA位点的精确编辑,效率高达30.5%,显著高于野生型。综上所述,本研究开发了新型的CRISPR/Cas9-hLacI供体适配基因编辑系统,丰富了CRISPR/Cas9基因编辑技术种类,为以后的基因编辑及分子设计育种研究提供了新的工具。     

CRISPR/Cas及其衍生编辑技术在基因治疗中的应用进展

基因治疗是指利用基因编辑技术对细胞基因进行“修饰”而达到治疗的目的。CRISPR/Cas的出现为基因编辑提供了简单、高效和多功能的平台,同时,为克服DNA双链断裂产生的不良影响,基于CRISPR/Cas的新型技术,如碱基编辑器（base editors,BE）、Prime Editors（PE）和Cas13效应器,被相继开发出来。目前,CRISPR/Cas及其衍生编辑技术已被广泛应用于动物细胞模型构建、药物靶点筛查和基因功能研究等领域,在基因治疗领域也展现出广阔的应用前景。基于此,简要介绍了CRISPR/Cas及其衍生编辑技术,综述了其在单基因遗传病、肿瘤和其他疾病的基因治疗中的应用进展,并分析了其当下面临的挑战,以期为基因编辑在单基因遗传病、肿瘤和其他疾病治疗领域提供理论参考。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在丝状真菌中的应用

随着对丝状真菌基因水平研究的不断深入,CRISPR/Cas9技术作为先进的基因编辑技术,已被广泛应用于丝状真菌的基因编辑。探究了CRISPR/Cas9系统在不同丝状真菌中的应用情况,主要从sgRNA的构建与表达、Cas9蛋白的改造与表达、不同的DNA双链断裂修复（DNA double-strand break,DSB）方式等方面进行概述,并对编辑效率、脱靶效应进行总结,旨在为今后丝状真菌中CRISPR/Cas9系统的构建及改良提供思路。     

Cell Research发表CRISPR-Cas技术在植物中的研究进展

Cell Research2013年第10期,同时刊登了中科院植物生理生态研究所朱健康实验室和北京大学瞿礼嘉实验室的研究论文,他们将CRISPR．Cas技术成功用于植物基因组的编辑,实现了CRISPR—Cas技术在植物领域的新突破。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建马立克病病毒超强毒株原癌基因meq缺失株及其鉴定

近年来,CRISPR/Cas9基因编辑技术正迅速应用于大基因组DNA病毒的编辑,尤其是一些致瘤性疱疹病毒。马立克病病毒（Marek’s disease virus,MDV）属于甲亚科疱疹病毒,血清Ⅰ型MDV（MDV-1）感染自然宿主可诱导快速发作的T细胞淋巴瘤。meq基因是MDV-1致瘤的主要原癌基因,在马立克病（Marek’s disease,MD）肿瘤发生中具有重要作用。本文以超强毒MDV（very virulent MDV,vvMDV）国际代表株Md5和我国分离株GX0101为研究对象,设计合成了多组meq基因特异性gRNA,利用CRISPR/Cas9系统成功构建了两个meq基因缺失的毒株Md5△meq-C45和GX0101△meq-C56,并对病毒基因组相关区域进行PCR扩增和测序。结果证实,meq基因被完全编辑并敲除。间接免疫荧光实验（Indirect immunofluorescence assay,IFA）显示,MEQ蛋白在两个meq基因编辑毒株感染的CEF细胞中均无表达,并且meq基因缺失经连续15次传代仍保持稳定。通过荧光定量PCR（quantitative PCR,qPCR）对病毒增殖曲线进行测定,证实meq基因编辑不影响病毒的体外复制。本研究建立了CRISPR/Cas9系统快速编辑MDV-1病毒基因的技术方法,获得了稳定的meq基因缺失毒株,为后续MDV-1的致病及致瘤机制研究、MEQ单抗筛选鉴定及诊断试剂研发等奠定了重要基础。     

基于CRISPR/Cas9系统构建绵羊VASA基因敲入载体及验证

本研究旨在探索VASA基因在绵羊睾丸发育中的表达变化,并通过构建VASA基因敲入载体,为下一步进行绵羊生殖细胞体外诱导分化研究提供基础。采集性成熟前后即3月龄（3-month-old,3M）和9月龄（9-month-old,9M）绵羊睾丸组织,利用实时荧光定量PCR （quantitative real-time PCR,qPCR）和Western blotting技术分析VASA基因的差异表达,并利用免疫组织化学技术对VASA基因的表达定位进行分析。设计靶向VASA基因的向导RNA （guide RNA,gRNA）,并构建同源重组载体,进行质粒转染绵羊耳成纤维细胞。结合CRISPR/dCas9技术对VASA基因进行激活,进一步验证载体效率。结果表明,VASA基因随着绵羊睾丸发育,表达水平极显著增加（P<0.01）,且主要定位在精母细胞和圆形精子细胞中。利用CRISPR/Cas9系统构建了VASA基因敲入载体,联合pEGFP-PGK puro-VASA载体转染耳成纤维细胞,CRISPR/dCas9系统激活后,耳成纤维细胞成功表达VASA基因。结果提示,VASA基因在绵羊睾丸发育和精子发生中发挥潜在功能,且通过CRISPR/Cas9系统可在体外构建VASA基因敲入载体,为下一步探究VASA基因对绵羊雄性生殖细胞的发育和分化提供有效的研究手段。     

CRISPR/Cas:可应用于病毒检测和抗病毒治疗的前沿技术（英文）

近年来,病毒感染疫情频发,凸显了高效便利的病毒检测技术以及抗病毒药物研制的迫切性。基于成簇的规则间隔短回文重复序列（CRISPR）和CRISPR相关蛋白（Cas）的工程系统在靶向和切割核酸方面具有较高的特异性和效率,是目前使用最为广泛的基因编辑工具。该系统目前也广泛应用于病毒学研究和相关医疗实践。本文重点介绍了Cas9、Cas12和Cas13这三种最常用的CRISPR/Cas系统在病毒检测和抗病毒治疗中的应用。在病毒检测方面,Cas9通过与荧光传感器、电化学传感器和侧流层析试纸等生物传感器相结合,提高了生物传感器检测的灵敏度和准确性。Cas12和Cas13则基于其反式切割活性,目前已经开发了多种技术来检测DNA和RNA病毒,如SHERLOCK和DETECTER。在抗病毒治疗方面,Cas9已被用于靶向切割病毒DNA,从而抑制病毒的复制,其靶标包括DNA病毒的基因组和逆转录病毒的中间产物DNA;而Cas13则被用于靶向病毒RNA,其靶标包括RNA病毒的基因组和病毒mRNA。尽管CRISPR/Cas系统在灵敏度、效率和便利度等方面具有多种优势,但在一些方面仍不可避免地存在局限性,如脱靶效应、...