细菌表达dsRNA介导的家蚕FTZ-F1基因的RNA干扰

为探索细菌表达目标基因dsRNA介导的RNAi技术是否在家蚕Bombyx mori可行, 本研究引入了在其他物种中广泛应用的细菌表达dsRNA的RNAi系统: HT115细菌株和L4440质粒。利用L4440载体两端含有T7启动子的特点, 设计并构建了针对家蚕核受体FTZ-F1基因的RNA干扰（RNA interference）载体, 将构建好的质粒转入大肠杆菌Escherichia coli HT115, 在IPTG诱导下成功获得目标基因对应双链RNA（dsRNA）。 结果显示: 通过对5龄第7天家蚕幼虫注射IPTG诱导后提取的FTZ F1基因对应的dsRNA 25 μg, 85%的蛹变态发育过程明显延迟, 不能实现幼虫到蛹的形态完全转变。荧光定量PCR分析显示目标基因的表达得到了特异的抑制。实验结果初步表明, 通过细菌表达目标基因dsRNA介导的RNAi策略, 以其经济、高效的特点, 具有广泛应用于家蚕基因功能研究中的潜力。     

细菌小RNA的调控及在代谢工程中的应用

细菌代谢工程需要优化基因的表达来平衡代谢物通量分布和减少有毒的中间体积累,从而提高产物生物合成。细菌小RNA(small RNA,sRNAs)与靶标mRNA通过碱基互补配对结合来抑制或激活其靶标基因的表达。sRNA在细菌的生理过程中都起到了至关重要的调控作用,因此被认为是细菌代谢工程中调节靶标基因表达的有力工具。近年来,越来越多的人工合成sRNA在细菌代谢工程中得到应用,分别就细菌sRNA的靶标识别和其对靶标的调控及代谢工程中的应用做了总结概括。     

生物防治因子

在根瘤菌-豆科作物共生中,根毛是细菌第一个靶细胞、豆科作物分泌出一个因子(类黄酮),它与组型表达的细菌 nod D 基因产物协同引导其它 nod 基因的表达作用。此后,在接种后3小时内,宿主的根毛就变形卷曲。为观察在根毛中的进程,从未接种根毛中分离出 RNA。在体外,用双向凝胶电泳比较了总 RNA 的转译,表明在根和根毛中 RNA 量有本质的差别。用 nod D 突变     

细菌转录起始调控机制*

原核生物同一种群的每个细胞都是和外界环境直接接触的,它们主要通过开启或关闭某些基因的表达来适应环境条件。所以,环境因子往往是调控的效应因子,必须严格调控转录来确保细胞对环境改变做出有效且充分的反应。原核生物基因的表达受多种因素的调控,而对于大多数细菌来说,调控基因表达的关键步骤是启动子识别和RNA聚合酶启动转录。在细菌的细胞中,可以通过调节RNA聚合酶的活性以及改变RNA聚合酶对启动子的结合来优化基因的转录过程以适应不同环境变化。总结了目前已发现的参与细菌细胞转录调节的各类因子,从这些因子对启动子的作用、RNA聚合酶的作用以及两者的相互作用等方面阐述它们调控基因表达的分子机制。总结多种基因调控的作用,加深对转录起始过程的认识,希望能对未来调控转录起始过程来实现目标基因的高效表达和不利基因的抑制表达提供思路,为以后的工业菌株改造提供依据。     

MSTN基因siRNA表达载体的构建和鉴定

目的构建能沉默MSTN基因的小干扰RNA表达载体,并鉴定它沉默肌母细胞MSTN基因的效率。方法合成3对发夹小干扰RNA模板寡核苷酸链,退火后插入pSileneer载体．构建成可沉默MSTN基因的小干扰RNA表达载体,通过酶切和测序鉴定构建的小干扰RNA表达载体。将小干扰RNA表达载体转染肌母细胞,用实时荧光定量RT—PCR和Western印迹检测转染的肌母细胞myostatin的表达水平。结果酶切和测序证实3个小干扰RNA表达载体构建正确,实时荧光定量RT—PCR显示所构建的3个小干扰RNA表达载体对肌母细胞MSTN基因的干扰率分别为43．6％、47．7％和81．6％,它们的干扰效果被Western印迹所证实。结论干扰率为81．6％的小干扰RNA表达载体为构建成功的小干扰RNA表达载体,。岜可用作MSTN基因的功能研究和肌病治疗的分子研究。     

细菌中非编码小RNA的筛选及鉴定

细菌非编码小RNA(small non-coding RNA,sRNA)是一类长度在50-200个核苷酸,不编码蛋白质的RNA.它们通过碱基配对识别靶标mRNA,在转录后水平调节基因的表达,是细菌代谢、毒力和适应环境压力的重要调节因子.近年来,随着生物信息学和RNA组学技术应用于细菌sRNA的筛选,sRNA已被证实存在于大肠埃希杆菌(Escherichia coli),铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)等细菌中,是细菌基因调控中新的调节因子.本文对细菌中非编码小RNA的筛选和鉴定技术作一个简要论述.     

细菌非编码小RNA的筛选及鉴定方法

细菌非编码小RNA（smallnon．codingRNAs,sRNAs）是一类长度为50～500nt、不编码蛋白质的功能RNA,在应对胁迫、毒力产生和新陈代谢等生命过程中起重要的调控作用。其主要通过碱基配对与靶mRNA发生作用,导致mRNA翻译和稳定性改变,从而在转录后水平调节基因的表达,最终影响细菌各种生命活动。近年来,利用生物信息学和分子生物学技术,已在细菌中筛选并鉴定得到了几百个sRNA。该文对细菌sRNA的筛选和鉴定方法作一简要综述。     

CRISPR/Cas系统与志贺菌毒力和耐药的关系及插入序列IS600对cse2表达水平的影响北大核心CSCD

【目的】了解志贺菌中成簇的规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)的分布及其与毒力和耐药的关系,并分析志贺菌中插入序列IS600对CRISPR相关蛋白基因cse2 m RNA表达水平的影响。【方法】利用课题组前期设计的引物PCR扩增志贺菌的3个CRISPR位点、CRISPR相关蛋白基因cse2、耐药基因和毒力基因;改良Kirby-Bauer(K-B)纸片法进行药敏试验;台盼蓝计数试验检测细菌毒力;Real-time PCR检测志贺菌中cse2基因m RNA表达水平。分别分析志贺菌中CRISPR/Cas系统与耐药基因、耐药表型、毒力基因、毒力表型的关系;了解IS600对CRISPR相关蛋白基因cse2 m RNA表达水平的影响。【结果】志贺菌中CRISPR1位点阴性细菌的毒力强;插入序列IS600使cse2 m RNA表达水平降低。【结论】志贺菌中存在CRISPR1、2、3位点;CRISPR1位点与毒力有关;插入序列IS600对cse2 m RNA表达水平有影响。     

非完全互补shRNA对RNA聚合酶II启动子调控的RNAi的影响

RNA干扰（RNAi）是一种转录后基因沉默技术,可有效诱导序列特异性基因沉默．由RNA聚合酶Ⅱ启动子调控表达的小发卡RNA可有效介导RNAi效应,为组织特异性基因沉默提供了一条新的途径．但是,由RNA聚合酶Ⅱ启动子调控表达的小发卡RNA（shRNA）在序列上与靶基因非完全互补对RNAi效应的影响鲜有报道．本文初步探索RNA聚合酶Ⅱ启动子调控表达的shRNA碱基发生突变或缺失对RNAi效应的影响．研究表明,靶向hTERT mRNA的碱基突变shRNA显著降低RNAi效应,而靶向GFP mRNA的碱基缺失shRNA对RNAi效应没有显著影响．本研究为非完全互补shRNA对RNAi效应的进一步深入研究提供了理论与实验依据．     

利用重组噬菌体诱导表达的大肠杆菌表达系统

将编码噬菌体T7RNA聚合酶的基因克隆至噬菌体M13mpl8RFDNA中,置于lac启动子的控制之下,得到了可表达T7 RNA聚合酶的重组噬菌体M13HEP。利用该噬菌体感染含T7启动子表达质粒的宿主菌以提供T7RNA聚合酶,可以诱导T7启动子控制下的外源基因的表达。该噬茵体诱导表达系统已成功地表达了多种外源基因,特别是一些表达产物对宿主菌有毒性的基因。同时,通过细菌接合将F',因子从大脑杆菌XL1-blue转至大肠杆菌HMS174,构建了新的大脑杆菌菌株HMSl74F,,使得T7表达质粒构建、表达及单链制备可以在同一菌株中完成,得到了一个完整的T7表达系统。     

病原菌非编码sRNA的功能及研究新方法北大核心CSCD

细菌中的非编码小RNA(small RNA,sRNA)作为一种靶向调控分子在细胞生理代谢过程中具有重要作用。sRNA作用于特定靶标,调控基因的表达。大肠杆菌大约有100种sRNA,其中1/3sRNA需要伴侣蛋白Hfq的介导。病原细菌中sRNA分子如何调控致病基因的表达,目前研究仍处于初级阶段。本文将从生物膜形成、细菌耐药性以及对宿主的影响等方面,结合新颖的sRNA的研究方法,综述sRNA在调控代谢网络及控制病原菌致病性方面的作用。     

RNA复制子疫苗研究进展

最近兴起的RNA复制子疫苗,利用源自病毒的能够自主复制的RNA,其结构蛋白基因由外源抗原基因取代,保留了非结构蛋白(RNA复制酶)基因。RNA复制酶可使RNA载体在细胞质中高水平复制,并实现外源抗原基因的高水平表达,可同时诱导细胞免疫和体液免疫应答。大量双链RNA可诱导被感染细胞凋亡,宿主细胞的凋亡有利于免疫系统识别外源抗原。RNA复制子疫苗克服了传统疫苗和普通DNA疫苗存在的缺点,具有抗原表达效率高、安全性好、应用范围广等优点,因而被视为一种发展前景很好的疫苗形式。目前已对一些疾病模型基于复制子的治疗性和预防性疫苗进行了研究(涉及的对象包括病毒、肿瘤以及细菌毒素等),并对某些不足之处进行了改进。     

病原菌非编码sRNA的功能及研究新方法

细菌中的非编码小RNA（small RNA, sRNA）作为一种靶向调控分子在细胞生理代谢过程中具有重要作用。sRNA作用于特定靶标,调控基因的表达。大肠杆菌大约有100种sRNA,其中1/3 sRNA需要伴侣蛋白Hfq的介导。病原细菌中sRNA分子如何调控致病基因的表达,目前研究仍处于初级阶段。本文将从生物膜形成、细菌耐药性以及对宿主的影响等方面,结合新颖的sRNA的研究方法,综述sRNA在调控代谢网络及控制病原菌致病性方面的作用。     

超分辨显微技术结合smFISH方法在E. coli sRNA SgrS定位中的应用

细菌调节小RNA通常与靶mRNA结合,影响翻译和mRNA降解过程.了解细菌小RNA的定量和定位信息,将有助于揭示细菌转录后水平的调控机制.小RNA SgrS通过抑制ptsG mRNA翻译起始,参与细菌磷酸葡萄糖代谢的应激过程.本研究应用单分子荧光原位杂交(smFISH)方法和超分辨显微技术可视化定位大肠杆菌细胞内小RNA SgrS,并初步验证伴侣分子Hfq蛋白和RNaseE降解酶对小RNA SgrS定位的影响.选取大肠杆菌模式菌MG1655 (野生株)、sgrS敲除株(△sgrS)和过表达株(△sgrS-pBAD-SgrS),使用RNA印迹和smFISH方法验证SgrS的过表达.应用smFISH方法分别在野生菌株、hfq敲除株(△hfq)和rne敲除株(△rne-710)中定位小RNA SgrS和ptsG mRNA,超分辨成像观察.与野生株相比,△hfq和△rne-710中SgrS主要定位于近膜区域,ptsG mRNA定位于细菌胞浆中,并且这两种RNA拷贝数均极显著增加.以上结果表明,分别敲除大肠杆菌hfq和rne-710基因导致SgrS和ptsG mRNA的表达量增加. smFISH方法和超分辨技术的结合应用为细菌RNA的直观定量和定位提供了高敏感性的检测方法,可用于基因调控的功能研究.     

黄单胞菌属细菌非编码小RNA的研究进展

黄单胞菌属(Xanthomonas)是一类能引起多种单子叶和双子叶植物感病的革兰氏阴性细菌,严重危害水稻、甘蓝、番茄、柑橘等多种作物,其入侵和增殖依赖于三型分泌系统(Type III Secretion System,T3SS)和其他毒素因子。细菌非编码小RNA能通过与靶m RNA互作,在转录后水平调控基因的表达,或直接与蛋白互作,影响细胞的各种生理功能。主要介绍了细菌非编码小RNA的分类、及其对细菌蛋白调节、生长代谢、基因转录以及毒力调控等方面的研究进展,并重点对黄单胞菌属细菌已鉴定的非编码小RNA及其生物学功能进行综述,以期为黄单胞菌引起的作物病害防控提供新的思路。     

储存条件对表达马铃薯甲虫腺苷高半胱氨酸水解酶基因dsRNA的大肠杆菌生物活性的影响

【目的】将RNA干扰应用于害虫防治领域,通过饲喂表达ds RNA的转基因植物或表达ds RNA的细菌,可沉默特定基因进而控制害虫,为农业害虫防治开辟一个新领域。而表达ds RNA的细菌能否有效储存是决定此项技术实际应用的关键。【方法】用﹣20℃冻存的表达马铃薯甲虫腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHase)ds RNA的大肠杆菌E.coli,饲喂马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata(Say)2龄幼虫,检测不同时间储存、灭活与否的活性变化,明确其储存条件。【结果】大肠杆菌﹣20℃储存24 h后生物活性优于新鲜菌,储存48 h后效果减弱,而载体大肠杆菌是否灭活对活性影响不大。【结论】ds RNA大肠杆菌发酵液在﹣20℃条件下可以短暂储存。     

细菌非编码小RNA研究进展

细菌非编码小RNA(small non-coding RNA, sRNA)是一类长度在50~500个核苷酸, 不编码蛋白质的RNA。迄今, 在各种细菌中共发现超过150多种sRNA。它们通过碱基配对识别靶标mRNA, 在转录后水平调节基因的表达, 是细菌代谢、毒力和适应环境压力的重要调节因子。细菌sRNA的研究技术主要有基于生物信息学的计算机预测法和基于实验室的检测分析方法。这些方法所得到的sRNA都需要进行实验室确认, 然后再进一步通过各种实验手段研究其功能。     

RNA干涉及其应用的研究进展

RNA干涉是指外源dsRNA引发身体内的基因的同源序列降解．从而表现出基因转录后的沉默现象．到目前为止在真菌、拟南芥、线虫、锥虫、水螅、涡虫、果蝇、斑马鱼、小鼠等真核生物中都发现存在这一基因沉默机制。研究表明,RNA干涉与植物中的共抑制、真菌中的基因压制,很可能具有共同的基本分子机制。RNA干涉可以用于功能基因组学研究．也可用于克服转基因生物的基因沉默现象,使外源基因在遗传改良生物中能更好地表达,还用于基因治疗,抑制有害基因的表达等。     

基因芯片技术在检测肠道致病菌方面的应用

基因芯片技术具有高通量、自动化、快速检测等特点,因此被广泛地应用于各种研究领域,如细菌分子流行病学、细菌基因鉴定、致病分子机理、基因突变及多态性分析、表达谱分析、DNA测序和药物筛选等。现介绍基因芯片检测肠道致病菌方面的国外研究进展,基因芯片应用于检测肠道致病菌的3个方面:结合多重PCR对致病菌的毒力因子或者特异性基因进行鉴定;直接检测细菌的DNA或者RNA;以致病细菌核糖体RNA作为检测的靶基因同时检测多种肠道致病菌。由于其检测的高效率,该技术要优于其他分子生物学检测方法。基因芯片技术在肠道致病菌检测中有着巨大的应用价值,具有广阔的应用前景。     

LeCOP1LIKE基因的克隆、反义构建及微型番茄的转化

本文报告利用EST筛选结合RT-PCR的方法从番茄中克隆了LeCOP1LIKE基因的1060bpcDNA片段,并利用其非保守域构建反义RNA表达载体。利用农杆菌介导法．将LeCOP1LIKE基因的反义RNA表达载体转入微型番茄Micro-Tom．获得了10株反义LeCOP1LIKE转基因微型番茄。RT-PCR分析表明其中4个转基因株系中的LeCOP1LIKE表达被显著抑制．并发现抑制LeCOP1LIKE基因的表达导致转基因番茄的株高下降、叶片的叶绿素含量提高、果实中番茄红素含量增加,并且明显抑制转基因种子的发育。这些实验结果证明了LeCOP1LIKE基因为番茄发育过程中光形态建成的抑制因子。