DNA末端构型调控RecJ核酸外切酶活性

目的 核酸酶介导的DNA双链末端切割对同源重组修复至关重要。然而,DNA末端构型对RecJ 5’-3’核酸外切酶活性的调控尚不清楚。本研究旨在探究DNA3’端和5’端构型对RecJ核酸外切酶活性的影响及其机制。方法 为探究DNA3’端构型对RecJ核酸外切酶活性的影响,使用含有Mg²⁺的体系,对具有不同3’突出末端长度（9 nt与18 nt）和3’突出末端修饰（磷酸化和硫代磷酸酯修饰）的单链DNA分别进行RecJ核酸酶活性检测。为揭示DNA 3’端构型对RecJ外切酶活性的调控机制,在Mg²⁺缺失的体系中,使RecJ与底物结合后进行凝胶迁移实验（EMSA）。为探索其他调控因子与DNA3’端构型对RecJ的协同作用,分别检测5’端磷酸化修饰和单链DNA结合蛋白（SSB）对DNA3’突出末端修饰的影响。结果 DNA3’端构型包括突出末端的长度和修饰（磷酸化和硫代磷酸酯修饰）均会抑制RecJ外切酶活性。DNA 3’端磷酸化和硫代磷酸酯修饰通过重塑RecJ-DNA的结合模式抑制RecJ外切酶活性。DNA 5’端磷酸化修饰可增强RecJ对具有不同3’端...     

Red同源重组技术研究进展

伴随着分子生物学的发展,一种基于λ噬菌体Red重组酶的同源重组系统已应用于大肠杆菌基因工程研究。Red重组系统由三种蛋白组成:Exo蛋白是一种核酸外切酶,结合在双链DNA的末端,从5′端向3′端降解DNA,产生3′突出端;Beta蛋白结合在单链DNA上,介导互补单链DNA退火;Gam蛋白可与RecBCD酶结合,抑制其降解外源DNA的活性。Red同源重组技术具有同源序列短(40～60bp)、重组效率高的特点。这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突变等操作,无需使用限制性内切酶和连接酶。此外,这种新型重组技术可直接将目的基因克隆于载体上,目的基因既可来源于细菌人工染色体也可是基因组DNA。Red同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行,大大推动功能基因组研究的发展。     

苏云金杆菌6－内毒素基因及3’末端缺失基因在大肠杆菌和农杆菌中的亚克隆和表达

苏云金芽孢杆菌交种Bacillus thuringiensis aizawai 7-29 δ-内毒素基因及其3,末端缺失基因,亚克隆到质粒pUCl9上,构建了Pucf33和Puck63重组质粒。进一步将δ-内毒素基因及其3’端缺失基因,插入到植物表达载pBl121．2质粒中,构建了Pgy61和Pgyck63重组质粒。．用32P标记的δ-内毒素3’末端缺失的KpnI DNA片段的探针,与重组质粒进行DNA—DNA分子杂交,结果阳性。带有全长和3’末端缺失重组质粒,转入大肠杆菌HB101和农杆菌LA4404受体细胞中,其克隆子细胞抽提物,对大菜粉蝶和玉米螟幼虫均具有杀虫生物活性。结果证明δ－内毒素基因不仅能在大肠杆菌HB10l中,而且能在农杆菌LA4404中表达。     

植物转基因座位形成的分子机制

转基因座位是指染色体上插入的转基因及相邻的特定DNA序列。大多数转基因座位是以转基因片段、基因组片段和填充DNA相间而存在,仅少数含有完整的单拷贝转基因,这是由于在转基因整合过程中,转基因及基因组DNA发生缺失、重复和染色体的重排。转基因整合主要通过双链DNA断裂修复中的异常重组所产生,而同源重组也发挥了一定的作用。异常重组主要由单链复性、合成依赖链复性和依赖Ku蛋白的非同源末端连接途径调节。     

Red体内同源重组介导的egfp、kan基因融合和重组质粒构建

重组工程是近年来建立的一种基于高效率体内同源重组的新型遗传工程技术,可应用于靶DNA序列的敲入、敲除和基因克隆等。在应用重组工程技术进行基因亚克隆时发现,体外重叠PCR法难以获得高质量的目的DNA打靶片段,严重影响重组效率。为了解决上述问题,根据Red重组酶介导的体内同源重组工作原理进行了技术改进。先用PCR方法合成egfp和kan两条末端互补的线性DNA片段,然后将其电击共转化进入携带Red重组酶和pcDNA3．1载体DNA的大肠杆菌DY331菌株内,经体内同源重组直接产生的pcDNA3.1—egfp-kan环状重组质粒DNA分子可通过抗生素标记筛选获得,阳性率可达到45％。瞬时转染pcDNA3．1-egfp-kan可获得绿色荧光蛋白在293细胞中的表达。     

革兰阴性菌中的寡核苷酸重组

该报道描述了一种新的不依赖RecA的同源重组方式的几个关键方面。通过转化进入细菌的人工合成单链DNA寡核苷酸在缺少任何附加的噬菌体编码功能时,可与细菌染色体发生位点特异重组。该研究检     

AAV-ITR单链DNA微载体在小鼠骨骼肌中的表达

AAV-ITR单链DNA微载体是一种基于腺相关病毒(AAV)倒置末端重复序列(ITR)的基因表达载体(AAV-ITR ss DNA mini vector)。前期研究已证明AAV-ITR单链DNA微载体在HEK 293T细胞中具有较高的转染、表达效率。本文中将相同拷贝数的AAV-ITR单链DNA微载体、3?-ITR末端错配的AAV-ITR单链DNA微载体(AAV-ITRmm ss DNA mutant vector)、AAV-ITR双链DNA和质粒分别用Turbo Fect转入小鼠骨骼肌中,比较检测AAV-ITR单链DNA微载体与其他基因表达载体在小鼠体内1周、1个月及3个月的表达效率。组织切片经荧光显微镜观察及荧光灰度值分析表明,相同分子摩尔数的AAV-ITR单链DNA微载体比AAV-ITR双链DNA和质粒在不同时期表达效率都要高且更稳定。提取注射3个月后的肌肉组织的DNA,用荧光定量PCR分析比较各载体的存留分子数。RT-PCR的结果显示AAV-ITR单链DNA微载体在注射3个月后的存留分子数较其他载体高。综合结果显示AAV-ITR单链DNA微载体在动物体内具有表达效率高和长久稳定的优势,有可能开发为基因治疗的一种高效、稳定的新型载体。     

耐辐射球菌DNA双链断裂修复机制研究新进展

耐辐射球菌对于电离辐射等DNA损伤剂具有极强的抗性,能够将同一个基因组中同时产生的高达100个以上的DNA双链断裂在数十小时内高效而精准地进行修复,是研究DNA双链断裂修复机制的重要模式生物。同源重组、非同源末端连接和单链退火途径作为3个主要的修复途径参与了耐辐射球菌基因组DNA双链断裂的修复过程。此外,一系列新发现的重要蛋白质,如Ppr I、Ddr B等对于耐辐射球菌基因组的修复过程同样至关重要。根据本实验室和国内外在这一研究领域近年来的报道,以不同的修复途径为线索,综述该菌DNA双链断裂修复机制的最新研究成果。     

一种简单高效的5'-突出末端平端化方法

目的:报道一种利用Pfu DNA聚合酶延伸法补平限制片段5’-突出末端的平端化方法。方法:Pfu DNA聚合酶是用于PCR扩增的常规高保真DNA聚合酶,可在DNA模板和dNTPs存在条件下,沿5’→3’方向催化寡聚核苷酸聚合。由于终产物为平末端,可利用这一特点进行限制片段5’-突出末端补平。本文采用这一方法消除pAN7-1潮霉素抗性标记末端的XbaⅠ位点,以便载体构建中能够利用这一常见位点。pAN7-1先用XbaⅠ酶切成线性化载体,产生的5’-突出末端再用Pfu DNA聚合酶延伸法补平,通过平端化载体自连后XbaⅠ位点的消除来评价Pfu DNA聚合酶的平端化效果。结果:随机挑取3个重组子提取质粒均不能再用XbaⅠ切开,表明XbaⅠ位点成功消除。结论:Pfu DNA聚合酶具有高效率及高保真特性,因此本法简单高效而且经济适用。     

Red体内同源重组介导的egfp、kan基因融合和重组质粒构建

重组工程是近年来建立的一种基于高效率体内同源重组的新型遗传工程技术,可应用于靶DNA序列的敲入、敲除和基因克隆等。在应用重组工程技术进行基因亚克隆时发现,体外重叠PCR法难以获得高质量的目的DNA打靶片段,严重影响重组效率。为了解决上述问题,根据Red重组酶介导的体内同源重组工作原理进行了技术改进。先用PCR方法合成egfp和kan两条末端互补的线性DNA片段,然后将其电击共转化进入携带Red重组酶和pcDNA3.1载体DNA的大肠杆菌DY331菌株内,经体内同源重组直接产生的pcDNA3.1-egfp-kan环状重组质粒DNA分子可通过抗生素标记筛选获得,阳性率可达到45%,瞬时转染pcDNA3.1-egfp-kan可获得绿色荧光蛋白在293细胞中的表达。     

Red体内同源重组介导的egfp、kan基因融合和重组质粒构建

重组工程是近年来建立的一种基于高效率体内同源重组的新型遗传工程技术,可应用于靶DNA序列的敲入、敲除和基因克隆等。在应用重组工程技术进行基因亚克隆时发现,体外重叠PCR法难以获得高质量的目的DNA打靶片段,严重影响重组效率。为了解决上述问题,根据Red重组酶介导的体内同源重组工作原理进行了技术改进。先用PCR方法合成egfp和kan两条末端互补的线性DNA片段,然后将其电击共转化进入携带Red重组酶和pcDNA3.1载体DNA的大肠杆菌DY331菌株内,经体内同源重组直接产生的pcDNA3.1-egfp-kan环状重组质粒DNA分子可通过抗生素标记筛选获得,阳性率可达到45%,瞬时转染pcDNA3.1-egfp-kan可获得绿色荧光蛋白在293细胞中的表达。     

一种简单高效的5＇-突出末端平端化方法

目的：报道一种利用Pfu DNA聚合酶延伸法补平限制片段5’-突出末端的平端化方法。方法：Pfu DNA聚合酶是用于PCR扩增的常规高保真DNA聚合酶,可在DNA模板和dNTPs存在条件下,沿5’→3’方向催化寡聚核苷酸聚合。由于终产物为平末端,可利用这一特点进行限制片段5’-突出末端补平。本文采用这一方法消除pAN7-1潮霉素抗性标记末端的XbaⅠ位点,以便载体构建中能够利用这一常见位点。pAN7-1先用XbaⅠ酶切成线性化载体,产生的5’-突出末端再用Pfu DNA聚合酶延伸法补平,通过平端化载体自连后XbaⅠ位点的消除来评价Pfu DNA聚合酶的平端化效果。结果：随机挑取3个重组子提取质粒均不能再用XbaⅠ切开,表明XbaⅠ位点成功消除。结论：Pfu DNA聚合酶具有高效率及高保真特性,因此本法简单高效而且经济适用。     

荧光偏振技术研究Bloom解旋酶催化核心与双链DNA的相互作用

Bloom 综合症(BLM)解旋酶是RecQ家族DNA解旋酶中的一个重要成员,参与了DNA复制、修复、转录、重组以及端粒的维持等细胞代谢过程,在维持染色体的稳定性中具有重要的作用．BLM解旋酶的突变可导致Bloom综合症,患者遗传不稳定易患多种类型癌症．本研究运用荧光偏振技术研究BLM解旋酶催化核心(BLM642-1290)与双链DNA(dsDNA)的相互作用,分析其相关特征参数,了解BLM642-1290解旋酶与dsDNA的结合和解链特性．结果表明,BLM642-1290解旋酶与dsDNA的结合和解链和dsDNA3’末端的单链DNA(ssDNA)长度有关;解旋酶优先结合于dsDNA底物的ssDNA末端,且每分子解旋酶可结合9.6 nt的ssDNA;dsDNA3’末端ssDNA的长度为9.6 nt时,解旋酶的解链效率达到最大且不再随其长度而变化．另外,BLM642-1290解旋酶也能够结合和解链钝末端dsDNA,但其结合亲和力和解链效率低于有3’末端ssDNA的dsDNA．推测BLM642-1290解旋酶在与dsDNA底物结合和解链时是单体形式,可能以尺蠖的形式解开dsDNA．这些结果可为进一步研究BLM解旋酶的功能特征提供理论基础．     

人淋巴毒素基因的分子克隆及其物理图谱

本文报道用一种简便、快速并省时的方法——体内同源重组⑴,以小鼠淋巴毒素 (MuLT)cDNA为探针,从以粘粒pcos2EMBL为载体构建成的人基因组文库中分离出人淋巴毒素(HuLT)基因。然后,以同位素³²P标记重组粘粒的cos单链末端⑵,再将经限制酶部份酶切的这种重组粘粒DNA片段电泳分部后,制作出HuLT基因的EcoR I、BamH I、PstⅠ和PvuⅡ四种限制性内切酶的物理图谱。     

末端终止法测定非特异性降解的DNA片段的顺序

用末端终止法测定DNA顺序的方法之一是用限制性内切酶将被测DNA降解,再与噬菌体M_(13)DNA重组、克隆。提取单链DNA做为模板,进行顺序测定。寻找一些非特异性的降解工具取代内切酶,有一定的经济价值,而且还可以扩大方法的应用范围。尤其在多酶切点的载体M_(13)mp系列出现后,更为DNA重组提供了方便。本文用酶法及超声波法切剪,得到了适合在M_(13)mp_8载体中以平齐末端重组的片段。一、材料与方法 1.材料小牛胸腺DNA及质粒PJDB     

通路克隆系统:DNA重组技术的新进展

近几年新发展了一种载体间DNA片段相互灵活转化的多功能系统 ,即通路克隆系统(gatewaycloningsystem)。它是一种位点特异的DNA重组技术 ,包括PCR产物的定向克隆 ,DNA片断高效、广泛的亚克隆 ,氨基或羧基末端的融合蛋白表达等。重点阐述了该系统的作用原理、特点及其应用。     

用羟基磷灰石柱分级洗脱法纯化小牛胸腺末端脱氧核苷酸转移酶和DNA聚合酶

DNA分子体外重组一般有两种方法。一种是限制性核酸内切酶—DNA连接酶方法此法缺点是要求克隆的DNA和载体DNA都必须具有粘性末端,如无粘性末端,必须加大DNA连接酶的酶量才能重组;另一种方法为末端转移酶法,其优点是任意的两种DNA     

Gap-Repair方式建立一种基于pBR322-Red的新型重组工程系统

应用Gap—Repair新技术,以pBR322为载体,在λ噬菌体Red重组酶的作用下,通过同源重组直接从大肠杆菌DY330染色体上亚克隆了长度为6．7kb的包含Red重组酶基因的λ噬菌体左向操纵子基因序列。建立了一种能够随意在不同细菌宿主中转移的基于pBR322-Red的重组工程系统。为了验证pBR322-Red的生物功能,以大肠杆菌染色体上的galk基因为靶标,用Red介导的单链DNA重组技术敲入T→G单碱基突变,使galk基因内编码第145位氨基酸的密码子由TAT转变成TAG,产生了一个琥珀突变。确定了pBR322-Red系统的重组功能。     

应用T/A策略克隆乙肝病毒pC/C及C基因

以克隆乙型肝炎病毒pC/C及C基因为例,报道了在DNA重组中,当目的基因与载体末端不匹配时可采取的一新方法.用内切酶切取的基因片段为平端时,可在含dATP的反应体系中,用Taq酶的末端转移酶活性在其3′末端加上单个碱基(dA)的突出尾;基因片段为3′凹端时,可在含4种dNTP的体系中,利用Taq酶的聚合酶活性先将其末端补平,再经末端转移酶活性在其3′末端加dA尾;末端经此修饰的基因片段可亚克隆至T载体中,再克隆于其他表达载体中.     

碱性磷酸单醋酶在DNA体外重组试验中的应用

在遗传工程中,目的基因与载体DNA进 行连接反应时,为确保这些DNA与载体重组成 功,通常需加人数倍于目的基因的载体DNA, 但是,大量加人载体DNA,由于连接反应使大 多数DNA分子自身环化［[31,在转化时产生大量 不含目的基因的转化子,而含重组DNA的转 化子则很少,需筛选大量菌落,才能得到含有重 组DNA的转化子,这样,载体的自身环化给筛 选工作带来很大的工作量。Ullich等141介绍了 一种减少载体DNA自身环化的简单方法,就是 用碱性磷酸单醋酶切除掉载体DNA 5’末端的 磷酸基151,然后再进行体外重组。经这样处理 后的载体分子,由于缺少连接酶作用的底物（5’ 磷酸基）,分子之间不能相互连接,但其3‘末端 的经基可与未脱磷的外源DNA连接成缺口环 状型的重组DNA分子。采用这种方法可以大 大减少筛选时的工作量,所以碱性磷酸单醋酶 在DNA体外重组中的应用日趋广泛。我们选 用质粒四R325为模式,用细菌碱性磷酸单醋酶 处理后,转化Ecoli RRI,获得了较为满意的 结果。我们采用此法顺利地完成了国内乙型肝 炎病毒基因组与pBR325的重组工作。