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Pfu DNA聚合酶是分子生物学研究中最常用的高保真DNA聚合酶之一。本研究对重组菌株的Pfu酶基因表达条件进行优化,以提高Pfu DNA聚合酶的表达效率。通过在菌液深度OD600=0.87时加入1.5 mmol/L的IPTG进行诱导培养,诱导培养时间为11.03 h,用酶溶法对重组菌株进行破胞提取粗酶液,经热变性法与盐析沉淀法对杂酶进行纯化,最后经过透析后得到纯酶。采用考马斯亮蓝G-250法对酶进行含量测定及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测纯度,最后使用PCR反应检测提纯后的Pfu酶的活性。结果表明优化处理后制备的Pfu DNA聚合酶,其纯度、酶活性和酶特异性均达到市售的Pfu DNA聚合酶水平。本研究为Pfu DNA聚合酶的开发和利用奠定了基础。 相似文献
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采用国产溶壁酶蛊酿酒酵母菌株X8的原生质体,将4×10^8/ml的原生持体悬浮液与等体积的1%低融点琼脂糖混匀后,凝固的原生质体包埋块在含1mg/ml蛋白酶K的NDS缓冲中处理24h,获得适宜于CHEFJ民泳的染色体DNA样品。采用了上述与前人不同的方法制备酿酒酵母染色体DNA样品,为广泛研究真菌电泳核型和制备巨型DNA分子量标记样品奠定了基础。CHEF电泳结果显示,供试菌株X8与对照菌755之间 相似文献
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土壤样品中DNA提取方法的比较 总被引:7,自引:0,他引:7
对土壤样品中提取DNA方法的有效性进行了比较研究。如果以细胞有效裂解和DNA产率为标准,用冻融进行预处理再结合SDS和溶菌酶的化学裂解方法,是效果最佳的DNA抽提方法,细胞裂解率为82%,DNA产率达20.8μg/g。为了去除PCR抑制物,将DNA样品进一步用柱纯化,回收率为80%。纯化后的DNA样品可用于16SrDNA扩增及其他分子操作。 相似文献
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超高忠实性PCR用DNA聚合酶 总被引:4,自引:0,他引:4
PCR(PolymeraseChainReaction)法已在生物工程领域得到了广泛的应用,而PCR法的推广完全得益于Taq耐热性DNA聚合酶。近年来,PCR法的应用除生物工程领域外,已应用至工业、农业、医学、制药等与人们生活息息相关的各个领域。随着PCR法的不断推广,人们对DNA聚合酶的忠实性(Fidelity)要求越来越高,一般来说,TaqDNA聚合酶在进行PCR延伸反应过程中的错配率为0.5%左右。TaKaRa公司独自研制成功的PyrobestDNA聚合酶是一种来源于Pyrococcuss… 相似文献
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耐热DNA聚合酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 总被引:5,自引:0,他引:5
用PCR法从水生栖热菌菌株YT-1中扩增耐热DNA聚合酶基因,得到2.5kb的DNA片段t扩增片段重组到pUCl8中测序证实为Taq DNA聚合酶基因,将该片段重组到pBV221温控表达质粒中,在大肠杆菌中表达出94kDa的重组蛋白,100ml培养物的细胞产酶为1.5×105u,表达的蛋白能催化PCR反应的进行。 相似文献
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人头发DNA的提取及其基因扩增 总被引:1,自引:0,他引:1
头发是犯罪现场最容易得到的材料之一。本文报道从人的头发中提取DNA的方法以及利用PCR(聚合酶链反应)技术,从少量人发DNA扩增大量拷贝数的基因片段。对基因扩增得到的大量基因片段进行进一步的基因分析,将为法医物证学提供客观证据,具有重要价值。 相似文献
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一种以PCR介导的、可对任意长度靶DNA片段上的核蛋白结合位点进行DNA足纹作图分析的新方法.原理是:采用被随机降解靶DNA分子作为模板,用标记的跨越整个模板的足够多条特异性引物进行单链扩增.首先,利用某种化学试剂或酶如DNaseⅠ对已与蛋白质结合或未结合的双链靶DNA进行随机降解,在一定条件下使每一个DNA分子恰好只有一个位点被切割.然后,这些被随机降解DNA分子即可作为模板,用同位素标记的跨越整个模板的足够多条特异性引物(正向或反向)进行单链扩增.最后,扩增的单链产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影形成DNA片段梯队,而被蛋白质保护的位点则在DNA片段梯队中形成位置缺口,从而确定DNA与蛋白质相结合的精确位点.该方法被应用对人干细胞因子基因5′旁侧-1190~-273区域的DNA足纹部分作图. 相似文献
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建立了一种简单处理单个卵子和早期胚胎制备DNA模板的方法——KOH/DTT-Triton X裂解法,并与TE-蛋白酶K法比较了PCR扩增效率。结果,采用KOH/DTT-Triton X裂解法处理单个卵子或2-细胞胚、8-细胞胚、桑椹胚、囊胚后,作为DNA模板直接进行PCR扩增线粒体DNA片段,3对引物的PCR扩增总成功率为100%(70/70),而TE-蛋白酶K法处理的单个卵子的PCR扩增总成功率为92.9%(65/70),二者差异显著(P<0.05)。但两种方法所制备模板的PCR假阳性率均为0。实验设计的KOH/DTT-Triton X裂解法是一种有效的单个早期胚胎的DNA模板制备方法,经一次PCR扩增即能获得清晰的目的DNA条带,能够满足早期胚胎遗传物质检测的需要。 相似文献
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快速、高效的羊绒羊毛织品DNA提取方法的建立 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:建立一种快速、高效的羊绒羊毛纺织品DNA提取的方法。方法:采用chelex-100法的3种处理、试剂盒法分别提取羊绒羊毛织品的DNA,用18S rDNA片段、山羊和绵羊源性成分PCR扩增结果来比较提取效果。结果:试剂盒法提取DNA的效果优于chelex-100法,整个提取过程约需2h。9种供试材料均提取到DNA,且含有山羊和/或绵羊源性成分,与显微镜观察结果的符合率为100%。结论:建立的试剂盒法是一种快速、高效的适用于羊绒羊毛织品DNA提取的方法,为应用分子生物学方法鉴别山羊绒和绵羊毛奠定了基础。 相似文献
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环境样品中DNA的分离纯化和文库构建 总被引:16,自引:1,他引:16
采用研磨 /冻融和SDS/蛋白酶K热处理等理化方法 ,直接从性质不同的环境样品中提取和纯化混合基因组DNA。所获得纯品DNA的产量为每克样品 2~ 1 6μg。对纯品DNA进行限制性内切酶处理后 ,构建了以pUC1 8为载体的DNA文库。建库效率为从每克环境样品获得约 1 0 3~ 1 0 4 个含 3~ 8kb外源随机插入片段的克隆。通过DNA序列测定和基因注释 ,对从文库中随机选取的克隆进行了分析 ,发现外源插入片段均含序列未见报道的新基因。本文所做的尝试对于保存、研究和开发未培养微生物基因资源具有意义 相似文献
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用FTA采样卡和普通定性滤纸采集藏绵羊血样,采用NaOH法提取血液基因组DNA,利用设计的一对引物对DRB1基因第三外显子进行扩增,通过PCR产物琼脂糖凝胶检测,对普通定性滤纸与FTA采样卡的两种提取DNA的方法进行比较,结果认为采用普通定性滤纸-NaOH法提取血液基因组DNA,NaOH的最佳洗涤浓度是25 mmol/L,采用FTA-NaOH法提取血液基因组DNA,NaOH的最佳洗涤浓度是20 mmol/L,但普通定性滤纸法提取血液基因组DNA平均成本远低于FTA采样卡,普通定性滤纸法提取血液基因组DNA具有快速、便捷、经济及高效的特点. 相似文献
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DNA作为生物大分子既可以引导生物发育和生命机能活动,也可以被用作构筑纳米生物材料.DNA水凝胶可以制备成兼具DNA生物功能和水凝胶特质,应用于环境样品的分析检测.依据制备DNA水凝胶长链的方法,对比分析了聚合酶链反应、杂交链式反应、滚环扩增技术的制备,物理水凝胶和化学水凝胶的合成过程和改性方法技术特点;并结合环境样品... 相似文献
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根据已发表的序列,分别在鸡贫血病毒(CAV)环形基因组DNA(全长2.3kb)的EcoRI位点和BamHI位点的两侧选择适当序列合成两对引物,用PCR技术,从斑点杂交检测到病毒核酸的CAV感染的MDCC-RP1细胞基因组DNA中,分别扩增出包含EcoRI和BamHI分割开的病毒基因组两部分(1.5kb和0.8kb)约1.5kb和约1.25kb的两个片段.再将其中相应序列拼接克隆进pUC18载体,获得包含CAV全基因组序列DNA片段的克隆质粒pCAV2.4.酶切分析表明,该质粒具有预期的BamHI位点、PstI位点、HindⅢ位点,而预期的EcoRI位点消失.重组质粒插入DNA片段的两端序列分析表明,质粒pCAV2.4是包含CAV全基因组序列的重组质粒,插入DNA片段序列中的EcoRI位点序列发生了一个碱基突变. 相似文献
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用基因组DNA剪接技术克隆SIgA相关基因 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:克隆分泌型IgA(SIgA)相关基因--J链基因(IgJ)、多聚免疫球蛋白受体基因(pIgR)和IgA重链恒定区基因(IGHA),为进一步构建SIgA真核表达质粒奠定基础。方法:采用本室建立的"基因组DNA剪接"技术,根据已发表的IgJ、pIgR和IGHA的核苷酸序列,通过计算机软件分别设计各个基因片段外显子的优化引物,从人外周血基因组DNA中直接扩增各基因的外显子序列;然后人工设计融合相邻外显子的融合引物,采用重叠PCR技术,把各基因片段的外显子串联起来形成全长编码序列,完成基因组DNA的体外剪接。扩增的PCR产物纯化后克隆到pGEM-T Easy Vector中,通过DNA测序对阳性克隆进行分析鉴定。结果:PCR扩增的IgJ、pIgR和IGHA基因与预期大小一致;测序结果表明本实验获得的上述基因与GenBank中的目标基因序列完全一致。结论:本文通过基因组DNA剪接技术成功克隆人类SIgA三个相关基因,提示此技术是合成多外显子cDNA的有效手段。 相似文献
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根据已发表的序列,分别在鸡贫血病毒(CAV)环形基因组DNA(全长2.3kb)的EcoRI位点和BamHI位点的两侧选择适当序列合成两对引物,用PCR技术,从斑点杂交检测到病毒核酸的CAV感染的MDCCRP1细胞基因组DNA中,分别扩增出包含EcoRI和BamHI分割开的病毒基因组两部分(1.5kb和0.8kb)约1.5kb和约1.25kb的两个片段。再将其中相应序列拼接克隆进pUC18载体,获得包含CAV全基因组序列DNA片段的克隆质粒pCAV2.4。酶切分析表明,该质粒具有预期的BamHI位点、PstI位点、HindⅢ位点,而预期的EcoRI位点消失。重组质粒插入DNA片段的两端序列分析表明,质粒pCAV2.4是包含CAV全基因组序列的重组质粒,插入DNA片段序列中的EcoRI位点序列发生了一个碱基突变。 相似文献