苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)LuxR家族转录因子ExpR调节motC操纵子的表达

目前已知苜蓿中华根瘤菌(S.meliloti)Rm1021 ExpR 突变导致胞外多糖Ⅱ(EPSⅡ)的过量表达,而胞外多糖是根瘤菌成功侵染宿主植物形成有效根瘤必需的物质。软琼脂板实验发现ExpR 突变株运动能力有缺陷。但是鞭毛染色实验并没有检测到突变株的鞭毛与野生型有什么不同。通过启动子-lacZ融合子进一步研究突变株中基因表达的差异发现,ExpR以细胞密度依赖的方式调节motC操纵子的表达。由此可见,在苜蓿中华根瘤菌中,ExpR同时参与了胞外多糖Ⅱ的合成和细胞运动能力的调节。     

苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）LuxR家族转录因子ExpR调节motC操纵子的表达

目前已知苜蓿中华根瘤菌（S.meliloti）Rm1021 ExpR+突变导致胞外多糖Ⅱ（EPS Ⅱ）的过量表达,而胞外多糖是根瘤菌成功侵染宿主植物形成有效根瘤必需的物质。软琼脂板实验发现ExpR+突变株运动能力有缺陷。但是鞭毛染色实验并没有检测到突变株的鞭毛与野生型有什么不同。通过启动子lacZ融合子进一步研究突变株中基因表达的差异发现,ExpR以细胞密度依赖的方式调节motC操纵子的表达。由此可见,在苜蓿中华根瘤菌中,ExpR同时参与了胞外多糖Ⅱ的合成和细胞运动能力的调节。     

紫云英根瘤菌Ra159的巨大质粒上存在有nod和nif基因的证明

在紫云英根瘤菌(Rhizobium astragali)Ra159中存在有两个分子量分别约为300Md(pRal59a)及大于300Md(pRal59b)的巨大质粒。以肺炎克氏杆菌的固氮酶结构基因nifHDK片段和苜蓿根瘤菌共同结瘤基因nod ABCD片段作探针进行的杂交试验证明了紫云英根瘤菌的大质粒pRal59b上存在有nod基因和nif基因。将这些大质粒转移到nod—nif基因缺失的苜蓿根瘤菌突变株Rm627—1,只有带pRal59b的转移接合子能在紫云英植物上形成根瘤,但这些根瘤均不能还原乙炔。     

费氏中华根瘤菌腺嘌呤缺陷突变株的构建与筛选

构建出费氏中华根瘤菌嘌呤合成酶基因purL的基因置换载体pHN701,purL内部NotⅠXhoⅠ片段被luxAB基因取代,造成正常基因的破坏。用该载体对野生型费氏中华根瘤菌HH103进行purL的基因置换,筛选到腺嘌呤缺陷型突变株P825。波动实验和连续转接试验结果表明该突变菌株表型十分稳定。purL表达载体pBBRPG在P825中可恢复其在基本培养基上的生长情况,证明突变株确实为purL单基因破坏。盆栽结瘤实验结果表明,该突变株只能侵染大豆根系形成不固氮的根瘤。     

茎瘤固氮根瘤菌环二鸟苷酸代谢相关基因的功能鉴定

【目的】考察茎瘤固氮根瘤菌ORS571中c-di-GMP合成酶AZC-2412的编码基因缺失的突变表型,初步探究其功能机理。【方法】本实验构建基于cre-loxp重组酶系统的根瘤菌基因敲除系统,以及采用三亲接合技术构建突变株。测定野生型和突变株的生长速率、趋化能力、胞外多糖产量、生物膜形成等表型。【结果】突变株与野生型生长速率几乎相同。与野生型相比突变株由于细胞内c-di-GMP水平降低,胞外多糖、生物膜产量等均有所下降。【结论】实验表明,环二鸟苷酸合成酶AZC-2412缺失,使得c-di-GMP水平降低,对胞外多糖生成、细菌的运动能力、生物膜的形成、细胞絮凝、与植物的互作等均有调控作用。     

苜蓿中华根瘤菌desA基因功能的鉴定

为研究苜蓿中华根瘤菌脂肪酸脱饱和酶desA基因在不饱和脂肪酸合成、共生结瘤固氮以及应对逆境胁迫中的功能,为高效利用苜蓿中华根瘤菌提供理论依据,本文通过异体遗传互补和脂肪酸组成薄层层析,分析SmdesA编码蛋白是否具有脱饱和酶的活性并参与不饱和脂肪酸的合成,构建SmdesA的缺失突变株和互补菌株,比较各菌株在不同逆境胁迫条件下的生长速率以及回接宿主植物后与紫花苜蓿共生结瘤的能力.结果表明SmdesA不能互补大肠杆菌CY57中EcfabA的突变,但具有将饱和脂肪酸脱饱和形成不饱和的棕榈油酸和十八碳烯酸的能力.另外,SmdesA缺失突变对苜蓿中华根瘤菌的脂肪酸组成影响不大,但会显著影响低温和高盐条件下菌株的生长速率以及与紫花苜蓿共生结瘤的能力.我们推测,SmdesA参与的脱饱和途径可能是苜蓿中华根瘤菌不饱和脂肪酸合成的补偿途径,其编码的蛋白DesA不是不饱和脂肪酸合成的关键酶,但在应对逆境胁迫和共生结瘤中具有重要的生物学功能.     

苜蓿中华根瘤菌Sm NifA蛋白与阴沟肠杆菌Ec NifA蛋白功能差异的研究

nifA基因是固氮基因nif的调节基因, 其产物NifA蛋白是固氮过程的中心调节因子. 将多拷贝组成型表达的苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti, Sm) nifA基因或阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae, Ec) nifA基因引入苜蓿中华根瘤菌野生型菌株Sm1021和苜蓿中华根瘤菌nifA突变型菌株SmY中, 并检测这些苜蓿中华根瘤菌感染苜蓿之后根瘤的表型及固氮酶活性. 实验结果表明, 苜蓿中华根瘤菌NifA蛋白和阴沟肠杆菌NifA蛋白在苜蓿中华根瘤菌中的功能有明显差异. 在野生型菌株Sm1021中, 引入多拷贝Sm nifA基因对宿主根瘤固氮效率的促进作用明显优于引入多拷贝Ec nifA基因的作用. 引入多拷贝Sm nifA基因的SmY菌株(nifA突变型)能够共生固氮, 而引入Ec nifA基因的SmY菌株仍然不能固氮. 氨基酸序列同源性分析显示, N末端结构域是Sm NifA蛋白和Ec NifA蛋白同源性最低的功能域. 进一步研究表明, Sm NifA蛋白的N末端结构域在互补苜蓿中华根瘤菌nifA突变型菌株SmY的固氮功能时是必需的.     

苜蓿中华根瘤菌042BMnoeA基因的克隆、敲除与功能的初步分析

通过PCR扩增获得了 0 4 2BM的noeA基因。该基因与苜蓿中华根瘤菌 (Sinorhizobiummeliloti) 10 2 1noeA的同源性为 99% ,而其NoeA与 10 2 1NoeA的相似性为 97%。还发现其NoeA与中慢生根瘤菌 (Mesorhizobiumsp .)BNC1可能的SAM_依赖性的甲基转移酶相似性为 32 % ,而其 30 3～ 36 2氨基酸区域与大肠杆菌 (Escherichiacoli)的核糖体 5 0S亚基的L11蛋白甲基转移酶 (PrmA)的 16 0～ 2 2 0氨基酸区域的相似性达到 4 1%。通过插入卡那盒 ,敲除noeA ,获得突变株 0 4 2BMA_Km。与苜蓿中华根瘤菌 0 4 2BM相比 ,敲除noeA的突变株在普通紫花、保定、宁夏、百发和傲汉苜蓿品种上的结瘤数、根瘤鲜重和植株地上部分的干重都有不同程度的增加 ,而在秘鲁苜蓿品种上的结瘤数和植株地上部分的干重明显下降 ,在皇后和美国杂花苜蓿品种上则没有明显的变化。     

冻融法转化苜蓿中华根瘤菌

对于苜蓿中华根瘤菌转化方法的研究仅限于三亲杂交法和电激转化,本实验首次将冻融法用于转化苜蓿中华根瘤菌。将携带CUS片段并且含有壮观霉素抗性的质粒用冻融法转移至野生型苜蓿中华根瘤菌菌株,得到的抗性克隆用GUS引物进行PCR扩增鉴定。经过计算,冻融法的转化率为2．2×10^5／μg。与传统方法比较,冻融法操作简单,转化过程快速,转化率较高,所需时间较短,转化成本低,是适合用于苜蓿中华根瘤菌的转化方法。     

利用Tn5-1063转座诱变法分离苜蓿中华根瘤菌042BM noeB基因的研究

采用三亲本杂交方法将带有Tn5-1063(含luxAB)的质粒pRL1063a导入苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meldoti)042BM,进行转座子插入诱变,在含有氯霉素、卡那霉素的TY平板上筛选接合子。通过结瘤试验,从1000个突变株中,筛选到3个结瘤突变株042BMR5、042BMR11和042BRM29。它们都表现出发光酶活性,表明转座子正向插入到基因组中的某个启动子下游。Southern杂交结果证实,转座子均为单一位点插入。对042BMR5突变株基因组进行反向PCR,扩增位于Tn5-1063两端的侧翼序列。测序结果表明,转座子插入到苜蓿中华根瘤菌的共生质粒pSymA noeB基因内。根据基因组中noeB上游和下游序列扩增出042BM noeB,其与苜蓿中华根瘤菌1021 noeB的同源性为98％,而与NoeB蛋白的氨基酸序列相似性为95％。疏水性分析发现,NoeB是一个跨膜蛋白,在N末端有4个跨膜区,其中包含3个初级螺旋和1个次级螺旋。     

Only one of five groEL genes is required for viability and successful symbiosis in Sinorhizobium meliloti

Many bacterial species contain multiple copies of the genes that encode the chaperone GroEL and its cochaperone, GroES, including all of the fully sequenced root-nodulating bacteria that interact symbiotically with legumes to generate fixed nitrogen. In particular, in Sinorhizobium meliloti there are four groESL operons and one groEL gene. To uncover functional redundancies of these genes during growth and symbiosis, we attempted to construct strains containing all combinations of groEL mutations. Although a double groEL1 groEL2 mutant cannot be constructed, we demonstrate that the quadruple groEL1 groESL3 groEL4 groESL5 and groEL2 groESL3 groEL4 groESL5 mutants are viable. Therefore, like E. coli and other species, S. meliloti requires only one groEL gene for viability, and either groEL1 or groEL2 will suffice. The groEL1 groESL5 double mutant is more severely affected for growth at both 30 degrees C and 40 degrees C than the single mutants, suggesting overlapping functions in stress response. During symbiosis the quadruple groEL2 groESL3 groEL4 groESL5 mutant acts like the wild type, but the quadruple groEL1 groESL3 groEL4 groESL5 mutant acts like the groEL1 single mutant, which cannot fully induce nod gene expression and forms ineffective nodules. Therefore, the only groEL gene required for symbiosis is groEL1. However, we show that the other groE genes are expressed in the nodule at lower levels, suggesting minor roles during symbiosis. Combining our data with other data, we conclude that groESL1 encodes the housekeeping GroEL/GroES chaperone and that groESL5 is specialized for stress response.     

Phosphorus-free membrane lipids of Sinorhizobium meliloti are not required for the symbiosis with alfalfa but contribute to increased cell yields under phosphorus-limiting conditions of growth

The microsymbiont of alfalfa, Sinorhizobium meliloti, possesses phosphatidylglycerol, cardiolipin, phosphatidylethanolamine, and phosphatidylcholine as major membrane phospholipids, when grown in the presence of sufficient accessible phosphorus sources. Under phosphate-limiting conditions of growth, S. meliloti replaces its phospholipids by membrane lipids that do not contain any phosphorus in their molecular structure and, in S. meliloti, these phosphorus-free membrane lipids are sulphoquinovosyl diacylglycerols (SL), ornithine-containing lipids (OL), and diacylglyceryl-N,N,N-trimethylhomoserines (DGTS). In earlier work, we demonstrated that neither SL nor OL are required for establishing a nitrogen-fixing root nodule symbiosis with alfalfa. We now report the identification of the two structural genes btaA and btaB from S. meliloti required for DGTS biosynthesis. When the sinorhizobial btaA and btaB genes are expressed in Escherichia coli, they cause the formation of DGTS in this latter organism. A btaA-deficient mutant of S. meliloti is unable to form DGTS but can form nitrogen-fixing root nodules on alfalfa, demonstrating that sinorhizobial DGTS is not required for establishing a successful symbiosis with the host plant. Even a triple mutant of S. meliloti, unable to form any of the phosphorus-free membrane lipids SL, OL, or DGTS is equally competitive for nodule occupancy as the wild type. Only under growth-limiting concentrations of phosphate in culture media did mutants that could form neither OL nor DGTS grow to lesser cell densities.     

巴西固氮螺菌Yu62nifA基因克隆、测序及功能分析

用TD-PCR法克隆了巴西固氮螺菌(Azospirillun brasilense)Yu62的nifA基因.序列分析表明它与巴西固氮螺菌Sp7的nifA序列高度同源(96.5%),其编码的产物NifA蛋白与Sp7菌株NifA的氨基酸序列同源性为97.6%.该基因可以完全互补巴西固氮螺菌Sp7 nifA-突变株的Nif-表型.研究了NH4+和O2对Yu62 nifA基因的表达及NifA活性的影响.结果表明mfA基因在Yu62菌株中是部分组成型表达的,氨和氧不能完全阻遏其表达,在5mmol/LNH4Cl与微氧(0.5%O2)条件下表达最高;NifA蛋白在0.4%～0.5%O2时活性最高,氧分压降低和提高都使NifA活性下降,1mmol/L NH4Cl足以抑制NifA的活性.