短芽孢杆菌细胞壁蛋白基因多启动子和信号肽编码序列的分离

具有高蛋白分泌能力的短芽孢杆菌分泌到胞外的蛋白质主要是细胞壁蛋白,本通过PCR从5株筛得的具有高蛋白分泌能力且没有胞外蛋白酶活性的短芽孢杆菌中分离出细胞壁蛋白基因多启动子和信号肽编码序列,对其分析发现与具有高蛋白分泌能力的短芽孢杆菌47和HPD31的相应序列高度同源,该结果表明分泌蛋白能力强的短芽孢杆菌细胞壁蛋白的合在 可能受同样的机理调控。     

嗜热脂肪芽孢杆菌耐热α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

一序言杆菌属是分泌型酶类的重要来源(Priest 1977)。新近有一些队芽孢杆菌属菌种中克隆几种分泌酶类的报道,包括从解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens),凝结芽孢杆菌(B.Coagulans)和枯草芽孢杆菌(B.Subtilis)中克隆淀粉酶基因,从地衣形芽孢杆菌     

具有分泌蛋白能力的短芽孢杆菌的筛选及鉴定

短芽孢杆菌（Bacillus　brevis）具有分泌蛋白能力强和胞外蛋白酶活性低的特性,是分泌表达外源蛋白较理想的宿主。为获得分泌表达系统较理想的宿主菌,建立了短芽孢杆菌高效筛选模型,从800余株细菌中筛得8株具有高蛋白分泌能力且没有胞外蛋白酶活性的候选菌。经多相分类学初步鉴定其中5株为短芽孢杆菌。     

地衣芽孢杆菌DSM13分泌蛋白信号肽分析

地衣芽孢杆菌是重要的工业微生物,对于其分泌途径及信号肽进行预测和分析,有助于改善影响蛋白分泌的关键因素,高效生产异源蛋白。本研究首次在全基因范围内,利用SignalPv3.0等方法识别了地衣芽孢杆菌DSM13中各种分泌蛋白的信号肽。DSM13信号肽类型包括分泌型Sec信号肽、双精氨酸Tat信号肽、脂蛋白信号肽、IV型纤毛结构信号肽及生物信息素信号肽。同时分析了分泌途径组成,信号肽长度,氨基酸组成,各分泌信号肽特征,与枯草芽孢杆菌的异同以及重要工业酶制剂的分泌途径。该研究对使DSM13成为更有效分泌表达外源蛋白表达系统,具有重要的理论指导意义。     

外源蛋白在芽孢杆菌中分泌表达的研究进展

芽孢杆菌是很有潜力的分泌型基因工程宿主菌。本文概述了利用芽孢杆菌分泌表达外源基因时,影响目的蛋白产率的一些主要因素,如蛋白酶水解作用、缺乏适宜的分子伴侣、信号肽的选择不当等,并讨论了相应的解决对策。     

一株拮抗多重耐药菌的芽孢杆菌的初步研究

目的 对一株具有拮抗多重耐药菌的芽孢杆菌的特性进行研究.方法 采用菌落法测试多株芽孢杆菌对18种不同来源致病菌的抑制效应,并对其中一株可拮抗多重耐药菌的芽孢杆菌(KC株)进行鉴定和电泳分析.结果 该芽孢杆菌(KC株)经生理生化以及16S rDNA鉴定为枯草芽孢杆菌;KC株对人源、鱼源、畜禽源和鸡粪源的多重耐药菌有不同程度的拮抗效应;SDS-PAGE分析提示,35 kD左右的分泌蛋白可能参与了KC株的抑菌活性.结论 具有拮抗多重耐药菌的芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌,且该菌分泌的35 kD蛋白可能参与抑菌活性.     

短短小芽孢杆菌大肠杆菌穿梭分泌表达载体的构建

应用PCR技术从具有分泌蛋白能力强且没有胞外蛋白酶活性的短短小芽孢杆菌50中分离出细胞壁蛋白基因的多启动子和信号肽编码序列,利用它与质粒pUB110和pKF3-起构建成穿梭分泌表达载体pBKE50,将α0淀粉酶基因引入该载体转化短短小芽孢杆菌50后,发现α－淀粉酶可以活性形式分泌表达,此工作为下一步建立短短小芽孢杆菌高效分泌表达系统奠定了基础。     

分泌高效蛋白的地衣芽孢杆菌及其工业应用

革兰氏阳性、腐生性地衣芽孢杆菌是高温α-淀粉酶、碱性蛋白酶的重要工业生产用菌株.其基因组大小约为4.22 Mb,已被多个国际机构认定为GRAS工业菌株.地衣芽孢杆菌具有完善的蛋白分泌体系,蛋白合成与分泌能力可达到20～25 mg/ml.在作为外源基因表达系统的研究中,建立了其遗传转化方法,完成了多种表达载体的构建与应用,以及进行了作为宿主细胞的地衣芽孢杆菌的遗传改良与多种重组蛋白表达的研究.显示地衣芽孢杆菌具有作为重组蛋白高效分泌表达的巨大潜力与工业应用价值.     

全基因组预测多粘类芽孢杆菌SC2的分泌蛋白

为了解多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)分泌蛋白的典型特征,本研究通过SignalP、ProtCompB、TMHMM、Phobius、LipoP、TatP、MEME和BLAST等多种分析程序对多粘类芽孢杆菌SC2菌株的全基因组共5 439条蛋白质序列进行生物信息的综合分析。结果表明,共获得146个具有典型信号肽的SPⅠ(Signal peptidase Ⅰ)分泌蛋白。信号肽序列中出现频率最高的氨基酸依次是亮氨酸、丙氨酸和丝氨酸。对信号肽的切割位点分析发现与枯草芽孢杆菌等一致,均为A-X-A型。通过MEME对信号肽序列进行分析发现存在一种保守基序。最后用BLAST分析发现,在146个分泌蛋白中,89个具有功能描述的分泌蛋白,主要是细胞生长代谢及生物降解酶类,其余57个皆为功能尚未明确的假定蛋白。本研究获得了多粘类芽孢杆菌SC2菌株分泌蛋白的信息,为进一步研究多粘类芽孢杆菌的蛋白功能奠定了基础。     

枯草芽孢杆菌表达和分泌异源蛋白的研究进展

枯草芽孢杆菌是一种广泛应用于基础研究和工业生产的重要模式菌株,具有无致病性、蛋白分泌能力强、遗传背景清晰等多种优势,是生产异源蛋白的理想宿主。目前已有诸多异源蛋白在枯草芽孢杆菌中实现表达和分泌,其中包括淀粉酶、β-半乳糖苷酶和蛋白酶等有价值的工业酶。本文从异源蛋白表达和分泌的关键步骤出发,总结了枯草芽孢杆菌生产异源蛋白的传统策略和最新技术。除此之外,分析了当前研究存在的瓶颈并对如何提高异源蛋白产量提出了新的建议和策略。     

提高芽孢杆菌蛋白质的产量

α-淀粉酶是淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)分泌的一种蛋白质,人们想从这种菌获得更大的α-淀粉酶,就把编码这类蛋白质的某个基因的多拷贝连接到芽孢杆菌PUB110质粒上。把这个携带基因多拷贝的质粒插入到某个芽孢杆菌中,主要是插入到枯草芽孢杆菌     

巨大芽孢杆菌表达外源蛋白的特点及其研究进展

巨大芽孢杆菌是一种很有潜力的分泌型基因工程宿主菌,现已广泛应用于工业和学术研究领域。它具有表达率高、遗传稳定、产物可分泌、发酵工艺成熟等优点。本文综述了其自身的优点,表达载体的特点,巨大芽孢杆菌的转化方法,外源蛋白的表达,以及高效表达的策略,并对未来进行展望。     

地衣芽孢杆菌感受态细胞的形成及高效电转化

芽孢杆菌在营养缺乏的饥饿状态下,细胞易产生感受态因子,处于生长芽孢时期的芽孢杆菌更容易产生感受态。基于此原则利用芽孢杆菌极限营养培养基通过体外处理诱导使地衣芽孢杆菌产生感受态性能,同时调整参数,建立了感受态细胞对质粒pAPR的高效电转化方法。当质粒DNA浓度为1．5μg/ml、转化时电压为1750V的时候,可以得到261个转化子,经鉴定均为阳性克隆子。而常规电转化的最高仅为20个转化子。为以芽孢杆菌为宿主进行高效电转化提供了模型,也为建立适合工业应用的分泌型表达载体的构建打下了一定基础。     

耐碱性木聚糖酶基因在巨大芽孢杆菌中的表达及其酶学性质

摘要：【目的】从耐碱性木聚糖酶高产短小芽孢杆菌中克隆得到带有自身启动子的木聚糖酶基因,将其在巨大芽孢杆菌中进行表达,并对表达产物进行性质分析。【方法】将克隆得到的木聚糖酶基因xynA以及带有自身启动子序列的结构基因, 构建在芽孢杆菌表达载体pWH1520和改造后的载体pWG03中,得到重组质粒pWTEJX和pWGXYN,分别转化到巨大芽孢杆菌BM70中,获得重组巨大芽孢杆菌BMJXH9和BMGpp12;经过诱导产酶培养,均得到分泌表达。【结论】重组巨大芽孢杆菌BMGpp12比BMJXH9产酶活力提高了三倍     

短短小芽孢杆菌启动子筛选载体的构建

为了筛选短短小芽孢杆菌强启动子元件,应用PCR技术从枯草杆菌168中分离出α-淀粉酶基因,用其作为报告基因与质粒pUB110和pKF3一起构建了启动子筛选载体pKB/A.将短短小芽孢杆菌细胞壁蛋白基因启动子引入该载体构建成重组质粒pKB/PA,电穿孔法转化短短小芽孢杆菌50后发现α-淀粉酶以活性形式分泌表达.结果表明短短小芽孢杆菌启动子筛选载体构建成功.     

枯草芽孢杆菌表达与调控工具相关研究进展

枯草芽孢杆菌作为革兰氏阳性模式微生物,由于其清晰的遗传背景、高效的分泌能力以及简单的培养条件等优势被广泛的应用于生物技术产业。近年来,随着代谢工程与合成生物学的发展,枯草芽孢杆菌相关表达系统与调控工具研究也取得了很大进展。围绕枯草芽孢杆菌动态调控工具的研究进展,分别从转录水平调控和转录后水平调控两个层面上进行综述,并对调控元件在生物技术中的应用进行了讨论。最后,对未来枯草芽孢杆菌表达与调控工具的发展进行了展望。     

产单核细胞李斯特菌p60蛋白N端肽聚糖结合基序在枯草芽孢杆菌中的表达

目的:构建产单核细胞李斯特菌胞外蛋白p60的N端肽聚糖结合基序(p60-N)表达载体,实现其在枯草芽孢杆菌中的分泌表达。方法:将目标基因克隆到表达载体pHT43中获得重组载体pHT43-p60-N,转化枯草芽孢杆菌WB800N获得重组工程菌株WB800N/pHT43-p60-N,在此基础上考察IPTG浓度、培养基、表达时间和温度等条件对目标蛋白表达的影响。结果:p60-N蛋白可在枯草芽孢杆菌中分泌表达,与鼠李糖乳杆菌形成的革兰阳性增强基(GEM)颗粒特异性结合,具有与天然蛋白类似的生物学活性。用GB培养基,在37℃下,加入终浓度为0.2 mmol/L的IPTG诱导12~20 h,表达量提高到28 mg/L。结论:实现了p60蛋白N端基序在枯草芽孢杆菌中的分泌表达,为进一步研究以该蛋白为基础的细菌样颗粒疫苗奠定了基础。     

大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的构建及碱性蛋白酶的表达

构建了一个可以在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中复制,并可以在枯草芽孢杆菌中表达外源蛋白的穿梭表达载体pBE2R.该穿梭表达载体是以pBE2为基本骨架,引入来自pWB980质粒的P43强启动子,并在其下游引入嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶信号肽和前肽构建而成.试验结果表明,该穿梭表达载体pBE2R可以在大肠杆DH5α和枯草芽孢杆菌WB600中稳定存在,并可以使外源蛋白在枯草芽孢杆菌进行分泌表达,同时也为碱性蛋白酶定向改造提供了高通量筛选平台.     

β-半乳糖苷酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

为检测本课题组构建的枯草芽孢杆菌分泌表达载体pGPST中启动子和信号肽的活性,将β-半乳糖苷酶基因插入表达载体的多克隆位点,构建含有β-半乳糖苷酶基因的重组质粒pGPST-lacZ,重组质粒转化枯草芽孢杆菌,分别测定液体培养基中上清液和菌体沉淀中β-半乳糖苷酶的活性。培养上清液中的酶活在22h达到峰值,约为26mU/mL,之后开始下降;菌体沉淀中的酶活在14h最高,达6mU/mL,而阴性对照pGPST没有检测到酶活性。结果表明分泌型表达载体中的启动子和信号肽具有较好的活性,能实现异源基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达。本试验为该表达载体的进一步研究和应用提供重要的数据资料,也为外源基因在枯草芽孢杆菌中的表达提供参考资料。该载体将在研究外源基因在枯草芽孢杆菌中表达发挥重要作用。     

利用枯草芽孢杆菌ytkA和ywoF基因启动子与信号肽重组分泌表达mpd基因

用大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pNW33N和去除了信号肽编码序列的成熟mpd基因构建了穿梭启动子探针pNW33N-mpd。用该探针从质粒pMPDP3和pMPDP29上克隆来自于枯草芽孢杆菌ytkA和ywoF基因上游的启动子功能片段,构建了穿梭表达载体pNYTM和pNYWM。将表达载体pNYTM和pNYWM转入枯草芽孢杆菌1A751获得表达菌株1A751(pNYTM)和1A751(pNYTM),mpd基因在ytkA和ywoF基因的启动子和信号肽的带动下实现了分泌表达且具有天然活性,结果表明ytkA基因的启动子强度强于ywoF基因的启动子。利用ytkA基因的强启动子和nprB基因的分泌型信号肽编码序列构建了新的穿梭分泌表达载体pYNMK,并使mpd基因在枯草芽孢杆菌WB800中得到了更高水平的分泌表达,表达菌株WB800(pYNMK)在培养到第84h时甲基对硫磷水解酶酶活达到最高值为10.40u/mL,是出发菌株邻单胞菌M6表达量的10.8倍,重组表达产物有91.4%分泌在培养基中。