改良法制备PCR产物克隆载体

将克隆载体平端切割后,向反应体系中加入ｄＴＴＰ,用ＴａｑＤＮＡ聚合酶处理载体,使其３－端带上一个凸出的单碱基Ｔ,修饰后的载体可直接与纯化的ＰＣＲ产物连接。     

可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体

从毕赤酵母表达载体pPICZαA出发,构建了可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体（毕赤酵母表达型T载体）。设计合适的引物扩增一DNA片段,使该片断的上游含XhoⅠ和Eam1105Ⅰ酶切位点,下游含Eam1105Ⅰ和XbaⅠ酶切位点。通过XhoⅠ和XbaⅠ位点将扩增产物与质粒pPICZαA连接形成重组质粒。用Eam1105Ⅰ酶切重组质粒,回收大片段即得到毕赤酵母表达型T载体pPICZαT。使用该表达型T载体进行了里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅱ基因（cbh2）的克隆和在巴氏毕赤酵母中的表达。结果表明,使用表达型T载体可以直接克隆PCR产物,而且可以使外源基因在毕赤酵母中成功表达。另一方面,使用该载体时不需要使用限制性内切酶,从而可以避免在所表达蛋白的N-末端引入多余的氨基酸。     

一种自制T-载体的构建

TaqDNA聚合酶由于其具有非模板依赖型末端转移酶活性常使PCR产物的 3′末端形成一个dA突出。实验通过在pGEM 7Zf ( + )质粒的多克隆位点中插入少数新的酶识别位点 ,使其改造成为能被XcmI限制内切酶消化后可形成 3′末端具有一个dT突出的pGEMXT 载体 ,从而易于与具有 3′dA的PCR产物直接连接 ,并通过蓝白斑筛选而获得重组克隆。这种新构建的载体由于新添了相应的酶切位点还可用BamHI或HindIII单酶切出其中所插入的片断 ,方便了后续分析工作的进行。     

一种高效克隆PCR产物的方法

利用TaqDNA聚合酶3′末端非模板依赖性加碱基的特性,制备了3′末端带T载体,与18种PCR产物进行连接反应。结果,阳性克隆率达40％—70％,而对照组小于10％。证明该方法是一种高效节省适用范围广的好方法。     

PCR产物克隆方法的新进展

ＰＣＲ产物克隆方法的新进展陈尚武,马涧泉（中山医科大学生化教研室．广州）随着ＰＣＲ技术的发展和普及,克隆ＰＣＲ产物已广泛应用于分子生物学的各个领域。通常ＰＣＲ产物不具有粘端,只能进行平端连接的克隆,由于ＴａｑＤＮＡ聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性...     

一种克隆PCR产物的新方法

一种克隆ＰＣＲ产物的新方法周复春,李学伍,吴斌,陈焕春（华中农业大学牧医系,武昌）基因克隆和分离是分子生物学和细胞生物学研究必不可少的组成部分。ＰＣＲ基因扩增可以产生微克级的特异性刀ＮＡ片段,可以简化从基因组ＤＮＡ克隆单拷贝基因片段的步骤。到达这种数...     

微卫星PCR产物变性与非变性PAGE-银染检测方法的比较

用鸡的微卫星引物对6个中国地方鸡种的两个微卫星位点进行PCR扩增。将扩增产物在变性与非变性聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）上进行电泳,经银染,表明微卫星产物在二者上的电泳结果有明显的差异。在非变性聚丙烯酰胺凝胶中,表现为有较多的非特异带,而在变性胶中微卫星扩增产物条带清晰,易于鉴定。Abstract：The genomic DNAs from six chicken breeds in China were amplified using two microsatellite primers. The PCR products were detected by non-denatured and denatured PAGE gels respectively, and the gels were dyed by silver. There were distinct differences between the two kinds of gel. In non-denatured gels. There were many nonspecific bands while clear purposed bands were showed in denatured gels.     

PCR产物直接测序还是克隆测序 密叶杉属rDNA ITS序列的测定方法

通过PCR产物直接测序和克隆测序对三种密叶杉属（Athrotaxis）植物rDNA内转录间隔区(ITS)及5.8 S rDNA序列进行了测定与分析。实验表明A. selaginoides rDNA重复序列间的纯合程度很高, 对PCR产物直接测序就可以测定其ITS区序列。而A. laxifolia、A. cupressoides的ITS1重复序列间的纯合程度较低,各重复单位间序列存在插入/缺失,只有对PCR产物进行克隆测序才能确定其序列。A. laxifolia、A. cupressoides的ITS2区尽管也存在 多态性,但不同重复序列的浓度比较平均,对PCR产物直接测序就可确定重复序列间的变异情况。本实验表明尽管是同一属的三种植物,但其rDNA重复序列间的纯合程度不同,同一植物ITS的不同区域,其重复序列间的纯合程度也不同,针对不同的ITS片段可采用不同的方法以测定其序列。     

An expeditious method for constructing T-vectors usingEam 1105 I cassettes

An expeditious method is described for constructing T-vectors containing complementary 3′-thymidine overhangs. A T-vector was developed by cloning a 90-bpEam 1105 I cassette containing 2Eam 1105 I restriction sites into a modified pUC119 vector. TheEam 1105 I cassette was generated by PCR with 2 specific primers containing different recognition sequences ofEam 1105 I. The recombinant vector was easily converted into a T-vector by digestion of the plasmid withEam 1105 I. The cloning efficiency of the PCR product was approximately 90%. The method described here is a simple way to construct a variety of T-vectors.     

Growth Inhibition of Pseudomonas solanacearum by Substituted 3-Indolepropionic Acids and Related Compounds

Antibacterial Activities of Indole and Its Related Compounds against Pseudomonas solanacearum, IV. For Part III, see ref. 9

A variety of substituted 3-indolepropionic acids and related compounds were synthesized and their antibacterial activities were examined against Pseudomonas solanacearum. In most cases, substitution in the indole ring greatly reduced the antibacterial activity, but some compounds substituted at the 4 position could effectively suppress bacterial growth at a concentration higher than 25μg/ml.     

提高PCR产物及其克隆效率的几点方法与经验

本文介绍了提高ＰＣＲ产物及其克隆效率的方法与经验：如,引物的设计、目的片段的回收、连接体系、利用引物上所设计的酶切位点克隆、通过平末端克隆,以及加快实验进程的技巧、出现问题如何设计查找原因等。     

快速可靠的双链PCR产物直接测序法

利用T7DNA聚合酶在低温下仍具较高活性的特点,在热变性后低温下进行测序反应,使用该方法对多种PCR产物进行序列分析均取得较好的结果．     

一种有效回收短片段PCR产物的方法

目的:为了有效地回收小于200bp的短片段PCR产物。方法:研究了在-20℃条件下,用无水乙醇和3mol/l醋酸钠共沉淀短片段的PCR产物的方法。结果和结论:用这种共沉淀PCR产物的方法,它能够有效地回收小于200bp以下的DNA片段,并且回收到的片段能够有效的进行酶切反应和T-载体连接反应。这种方法也能够回收酶切后的短DNA片段,并对后来的连接反应没有影响。这种共沉淀回收短片段DNA方法相对于其他方法来不仅具有可行性,而且有经济和操作简单的优点。     

PCR产物直接测序技术中影响因素的研究

探讨了PCR产物直接测序技术中的影响因素,结果表明：PCR产物特异性是影响其测序成败的关键因素,PCR反应只有产生惟一扩增产物时,其产物才能被用来直接测序;PCR反应体系残留混合物（dNTP、引物和盐离子等）对其测序质量有明显不利影响,PCR产物纯化后其测序质量能明显提高;同时,PCR产物大小不同,其测序反应的模板用量也不同,在一定长度范围内,最适模板用量随PCR产物长度增加而增加。 Factors that Influence Direct Sequencing of PCR Products XU Zu-yuan1,2,BAO Qi-yu1,NIU Yu-xin1 1.Beijing Genomics Institute / Human Genome Center,Institute of Genetics and Developmental Biology,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China; 2.Jingzhou Teachers College,Jingzhou,Hubei 434104,China Abstract:Factors influenced direct sequencing of PCR (polymerase chain reaction) products were investigated in this paper.It showed that the specialization of PCR products played a key role in their sequencing reactions and only which could be sequenced directly.It also showed that the PCR reaction residues (including dNTP,primers,and metal ion) affected badly on the sequencing quality,so the purification of PCR products was necessary before sequencing.In addition,the optimum templates amount in sequencing reaction rose with the increasing of their DNA size in a certain range. Key words：polymerase chain reaction(PCR); direct sequencing of PCR product; ABI 377-DNA sequencer; Q20     

提高PCR产物克隆效率的几种途径

从提高PCR产物纯度,增加产物特异性入手,较详细地分析了影响PCR产物克隆效率的四个主要因素,并就每种影响因素给出了较为详尽的提高克隆效率的途径．     

筛选转基因动物的新方法——PCR及其产物测序法

用特异性引物对肌球蛋白轻链2启动子(myosin light chain-2,MLC₂)-糜酶融合基因的转基因新生鼠鼠尾DNA进行PCR筛选, 低熔点琼脂糖凝胶电泳回收阳性样品PCR所扩出的DNA条带,纯化后用同一对引物中的一个进行单引物PCR测序,与所转外源基因序列比较,进一步确定整合有外源基因的阳性鼠.PCR及PCR 产物测序法检测转基因动物具有操作方便,灵敏度高及特异性强等优点.     

PCR产物末端性质的分析研究

利用PCR、UT-PCR、克隆及测序等技术,对强直性肌营养不良基因（MT-PK）3′-非翻译区分别用Taq,Taq＋Pwo DNA聚合酶进行了扩增、克隆和测序,研究了PCR产物末端组成情况,并比较了上述两种DNA聚合酶对PCR产物末端的影响.结果在用Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物主要得到3′端突出1个A（占67.3％,35/52）;在Taq＋Pwo DNA聚合酶扩增的PCR产物末端中得到3′端+A的仅占17.4％,而－1的占34.8％,与前者显著不同.表明PCR扩增产物的末端是复杂多样的.