心房肌胞内钙浓度变化对心房颤动患者小电导钙激活钾通道电流的影响

目的：SK通道存在于心肌细胞上,其中SK2亚型主要表达在心房。SK2通道对胞内游离钙离子高度敏感,可快速将钙离子浓度的变化转换成细胞膜电位变化。本实验应用穿孔膜片钳技术记录人心肌细胞SK2电流,观察心房肌细胞SK2电流在窦性患者和心房颤动患者之间的差别,以及电极液中不同的钙浓度对两组细胞SK2电流的影响。方法：将接受体外循环手术的患者分为两组：心房颤动组和窦性心律组。以心房肌细胞为研究对象,用穿孔膜片钳技术记录人心肌细胞电流,观察窦性组与房颤组SK2通道电流的差异以及两组细胞SK2电流对电极液中钙敏感性的不同。结果：在全细胞穿孔膜片钳模式下,电极液中游离钙离子浓度为5×10-7mol/L时,记录到房颤组SK2通道电流明显大于窦性组,尤其是在超极化水平。膜电位在-130 mV时,窦性组与房颤组的SK2通道电流密度分别为（-2.92±0.35）pA/pF（n=6）,（-6.83±0.19）pA/pF（n=3,P〈0.05）。在电极液游离钙离子浓度分别为0 mol/L、5×10-7mol/L、10-6mol/L,膜电位为-130 mV时,窦性组SK2通道电流密度分别为（-1.43±0.33）pA/pF（n=7）,（-2.92±0.35）pA/pF（n=6）,（-10.11±2.15）pA/pF（n=8,P〈0.05）;房颤组SK2通道电流密度分别为（-2.17±0.40）pA/pF（n=4）（-6.83±0.19）pA/pF（n=3）（-14.47±2.89）pA/pF（n=4）（P〈0.05）。结论：人心房肌细胞SK2通道具有电压不敏感、内向整流、apamin敏感的特性。电极液中钙浓度相同的情况下,房颤组的SK2电流密度明显大于窦性组,SK2通道电流对钙离子的敏感性高于窦性组,提示SK2通道钙敏感性增加可能与心房颤动的发生发展密切相关。     

白细胞介素-2对心肌负性肌力作用机制的探讨

为研究白细胞介素-2（IL-2）对心肌的负性肌力作用的可能机制,本采用酶解分离成年大鼠心室肌细胞,用细胞内双波长荧光系统和膜片钳全细胞记录检测细胞膜钙离子通道和细胞内酸碱度（pHi）及钙水平的变化,分别以fura-2/AM和BCECF/AM作为细胞内钙离子和氢离子荧光指示剂。结果：（1）IL-2(2.5-200U/ml）浓度依赖性地降低单个心室肌细胞电刺激诱导的钙瞬变幅度,使舒张末钙水平升高,选择性κ-阿片受体阻断剂nor-BNI(10nmol/L）可阻断IL-2对心肌细胞内钙的作用;（2）用200U/ml的IL-2灌流10min后,与对照组相比膜片钳全细胞记录的L-型钙电流无明显改变;（3）用200U/ml的IL-2灌流后,与对照组相比Mn^2 对fura-2/AM的淬灭率无明显改变。（4）IL-2(200U/ml）使大鼠心室肌细胞pHi降低,其作用可被选择性κ-阿片受体阻断剂nor-BNI(10nmol/L）所减弱。结论：IL-2引起的心室肌细胞pHi降低可能是其负性肌力作用机制之一,细胞膜上L-型钙离子通道可能不参与IL-2降低心肌收缩力的作用;细胞膜上的阿片受体可能介导IL-2对心肌的负性肌力作用。     

Synaptobrevin-2促进心房肌SK2通道转运的机制研究

小电导钙激活钾通道亚型2(SK2通道)主要在心房表达,与心房颤动有关.高频刺激模拟心房快速起搏可以增加SK2电流,但是其中的机制并不完全清楚.本研究旨在研究转运调节蛋白Synaptobrevin-2(VAMP2)在调节心房肌细胞膜SK2通道转运过程中的作用.以培养的新生大鼠(Rattus norvegicus)心房肌细胞(NRAMs)和表达有SK2通道的HEK293细胞为研究对象,采用蛋白质印迹、膜片钳、共聚焦显微成像、流式细胞术和全内荧光反射等技术研究VAMP2对SK2通道转运的影响.结果发现,快速起搏可上调VAMP2蛋白和增加SK2通道蛋白在细胞膜上的表达,而敲低VAMP2可降低NRAMs细胞膜上SK2通道蛋白的表达.在HEK293细胞上共表达VAMP2和SK2,增加了SK2的表达,加速了SK2向细胞膜的转运,并通过抑制SK2内吞来稳定SK2通道蛋白在细胞膜上表达.由以上结果可知,VAMP2可能通过促进SK2通道的表达,转运和稳定细胞膜上的表达,参与快速起搏心房肌细胞SK2功能的增强.     

植物多肽PA1b打开胰腺β细胞L型钙通道促使钙内流和细胞分泌

利用海藻酸在pH2.7的条件下对小分子多肽的吸附作用,从豌豆种子中分离并纯化出含37个氨基酸的小分子肽PA1b(pea albumin 1b),它的肽链内具有6个半胱氨酸并形成一个胱氨酸结构模体.采用荧光显微技术和膜片钳技术,发现胞外施加PA1b在胞外钙离子存在的情况下使胰腺β细胞内钙离浓度增加,该效应被特异性的L型钙通道的阻断剂尼莫地平(nimodipine)阻断,在零钙外液中PA1b对胞内钙离子浓度无影响;此外,PA1b使β细胞膜去极化并使膜电容增加.因此推断PA1b使原代β细胞上去极化细胞膜,使L型钙离子通道开放,细胞外钙离子内流并促发细胞分泌.     

植物多肽PA1b打开胰腺β 细胞L型钙通道

利用海藻酸在pH2.7的条件下对小分子多肽的吸附作用, 从豌豆种子中分离并纯化出含37个氨基酸的小分子肽PA1b (pea albumin 1b), 它的肽链内具有6个半胱氨酸并形成一个胱氨酸结构模体. 采用荧光显微技术和膜片钳技术, 发现胞外施加PA1b在胞外钙离子存在的情况下使胰腺β细胞内钙离浓度增加, 该效应被特异性的L型钙通道的阻断剂尼莫地平(nimodipine)阻断, 在零钙外液中PA1b对胞内钙离子浓度无影响; 此外, PA1b使β细胞膜去极化并使膜电容增加. 因此推断PA1b使原代β细胞上去极化细胞膜, 使L型钙离子通道开放, 细胞外钙离子内流并促发细胞分泌.     

一种改进的人体心房肌细胞分离方法

本研究旨在探讨稳定的人体心房肌细胞分离方法,并观察分离的正常窦性心律（normal sinus rhythm,NSR）患者右心房肌细胞基本电生理特性。XXIV型蛋白酶和V型胶原酶两步法进行单个人体心房肌细胞分离,常规全细胞膜片钳技术记录正常的L-型钙通道电流（L-type calcium current,ICa-L）、钠通道电流（sodiumcurrent,INa）、瞬时外向钾通道电流（transient outward potassium current,Itol）和内向整流钾通道电流（inward rectifier potassium current,Ik1）。此方法分离的人体心房肌细胞数量多,细胞膜光滑,折光性强,横纹清楚,耐钙,可用于膜片钳实验的占分离细胞总数的50％-60％。该方法简单、稳定、可靠,酶用量少,分离的心肌细胞质量好,数量多,并能记录到多种离子通道电流,表明其具有正常的电生理功能,适合膜片钳实验。     

不同牵张刺激对豚鼠胃窦环行肌细胞电压依赖性钙电流的影响

利用全细胞膜片钳技术,在胃窦环行肌细胞上观察了不同方式的牵张刺激对电压依赖性钙电流的影响,探讨牵张刺激对胃窦平滑肌细胞电压依赖性钙电流的作用。用低渗性溶液灌流细胞引起的牵张刺激首先增加电压依赖性钙电流,接着激活一种内向性钳制电流。钙电流的增加发生在灌流后１ｍｉｎ内,而内向性钳制电流在细胞明显膨胀之后缓慢激活。低渗和正压引起的细胞膨胀明显增加电压依赖性钙离子电流,而利用两个电极直接牵细胞则不出现钙电     

SH—SY5Y细胞的钙缓冲研究

目的：研究SH－SY5Y神经杂交瘤细胞的钙缓冲能力。方法：通过膜片钳手段,测量未分化的SH－SY5Y细胞钙离子通道电流;并应用显微荧光测量游离钙离子浓度和高钾去极化的方法,研究胞内Ca^2 浓度上升后浓度恢复的动力学过程。结果：未分化的SH－SY5Y细胞存在钙离子通道电流,在刺激时间间隔较短时（＜150s）,胞内钙浓度的恢复过程会由于缓冲机制的饱和而变慢;而时间间隔＞150s时,缓冲物质则可以基本恢复使得胞内钙的恢复过程基本保持不变。结论：钙缓冲蛋白在细胞内钙浓度的调节中起重要作用。     

钙依赖型蛋白激酶调节保卫细胞膜内向钾离子通道的实验证据

保卫细胞内钙离子浓度的变化对气孔保卫细胞质膜上的内向钾离子通道活性有显著调节作用,而钾离子通道活性的变化可导致细胞渗透压的改变,进而调节气孔的开闭运动。然而,钙离子通过何种机制实现对钾离子通道的调节尚不清楚。作者利用膜片钳全细胞记录方法探讨了钙依赖型蛋白激酶（ＣＤＰＫ）是否参与了钙离子调节保卫细胞钾离子通道的信号转导过程。当胞内钙离子浓度为１．５μｍｏｌ／Ｌ时,保卫细胞全细胞内向钾电流被抑制约６０％;同时加入ＣＤＰＫ的底物组蛋白ⅢＳ或ＣＤＰＫ的底物竞争性抑制剂鱼精蛋白可完全逆转钙离子的作用;但在胞内同时加入纯化的ＣＤＰＫ蛋白则可进一步促进钙离子对保卫细胞内向钾电流的抑制。研究结果初步证明,ＣＤＰＫ介导了钙离子调节保卫细胞内向钾离子通道的信号转导过程     

胞内高钙诱发豚鼠心室肌细胞电紊乱

众多研究表明,各种心肌病理状态及心律失常的发生都与细胞内钙离子([Ca2+]i)调控失衡及钙超载有着十分密切的关系.为了进一步揭示细胞内急性钙超载对心室肌细胞电生理特性的影响,通过调节[Ca2+]i(对照组为65～100nmol/L,胞内高钙组为1μmol/L)模拟胞内钙超载状态,应用全细胞膜片钳技术记录细胞跨膜动作电...     

溴氰菊酯对神经细胞钙通道和 钙库的激活作用

应用膜片钳全细胞记录方式和显微荧光测钙技术,以MN9D神经细胞为材料研究了溴氰菊酯的作用机理。低浓度(10^-9 mol/L～10^-7 mol/L)溴氰菊酯就能使神经细胞Ca²⁺电流显著增加。10^-9 mol/L,1 min时电流增加平均值为20.64%,5 min时为15.48%,表明溴氰菊酯能激活高电位激活钙通道(L型和N型),促使Ca²⁺内流,显微荧光测定细胞内自由钙离子浓度（［Ca²⁺］_I）发现,在含Ca²⁺和无Ca²⁺的胞外液中,溴氰菊酯均能使胞内自由钙离子数量增加,表明它能刺激胞内钙库释放Ca²⁺。［Ca²⁺］_I升高对细胞功能影响很大。     

钙激活性氯离子通道的电生理研究

目的:研究大鼠肺动脉平滑肌细胞上钙激活性氯离子通道的电流、电压电流关系等电生理特性.方法:采用急性酶分离法(胶原酶Ⅰ型和木瓜蛋白酶)分离出单个肺动脉平滑肌细胞,应用膜片钳技术,测定各组大鼠肺动脉平滑肌细胞上钙激活性氯离子通道电流和电压电流.结果:急性酶分离法能成功分离出适用于膜片钳记录的单个大鼠肺动脉平滑肌细胞,并测到稳定的钙激活性氯离子通道电流,该电流表现出时间、电压及钙离子依赖性,并呈外向整流特征.结论:大鼠肺动脉平滑肌细胞的钙激活氯离子通道具有时间依赖性、钙离子依赖性和电压依赖性,并具有外向整流特征.     

猪冠状动脉平滑肌细胞的自发瞬时外向电流的特性

自发瞬时外向电流（spontaneous transient outward currents,STOCs）在小动脉的肌源性调节中起着非常重要的作用。本文应用穿孔膜片钳技术记录了猪冠状动脉平滑肌细胞上的STOCs,研究了其基本特性以及调节。结果显示：STOCs有明显的电压依赖性和钙依赖性,其频率和幅度具有变异性。STOCs可以随机叠加在阶跃刺激方案和斜坡刺激方案引出的全细胞钾电流上。STOCs可被大电导钙激活钾（large-conductance Ca^2＋-activated potassium,BKCa）通道的特异性阻断剂ChTX、螯合胞外钙离子和50μmol／L ryanodine完全抑制。钙离子载体A23187可以明显增加STOCs的幅度和频率;而L型钙通道阻断剂verapamil和CdCl2对STOCs的影响很小。咖啡因使STOCs瞬时爆发性增加,然后抑制。钠离子载体可明显增加STOCs的频率;钠钙交换体选择性抑制剂KB．R7943可明显抑制STOCs。由此可以认为STOCs是BKCa通道介导的。STOCs的产生和激活依赖于经钠钙交换的钙内流和经肌浆网ryanodine受体介导的钙释放,钠钙交换可能决定钙库重载,而细胞膜下肌浆网的胞内钙释放（钙火花）所致的局部钙浓度瞬时增加激活与其相邻的BKCa通道,产生STOCs。     

温度和胞内钠、ATP及酸碱度对心室肌细胞钠钙交换电流的调节

心肌缺血损伤过程中,胞内Na^＋、ATP及pH都出现明显变化。钠／钙交换对心肌细胞的钙平衡起重要的调节作用。本实验采用膜片钳全细胞记录豚鼠心室肌细胞钠／钙交换电流,研究温度和胞内Na^＋、ATP及pH对钠／钙交换双向电流的影响。结果表明,温度从22℃升至34℃,钠／钙交换电流增大约4倍,而pH值的改变对钠／钙交换双向电流没有明显的影响。在22～24℃时,同时耗竭胞内ATP和胞内酸化对钠／钙交换双向转运功能影响程度小;而在34—37℃时,同时耗竭胞内ATP和胞内酸化能抑制钠／钙交换双向电流的外向和内向成分,且内向成分抑制程度高于外向成分抑制程度。表明同时耗竭胞内ATP和胞内酸化对钠／钙交换的作用具有温度依赖性。胞内Na^＋超载能使钠／钙交换电流的外向成分增加,但不增加或减少内向电流（即正向转运）成分。因此,胞内酸化及耗竭胞内ATP损伤细胞排钙机制和胞内钠超载通过钠／钙反向交换引起钙内流是引起心肌细胞钙超载的两个独立的重要因素。     

17β-雌二醇快速诱导静止状态小鼠囊胚细胞胞内钙离子增加

用钙离子荧光探针fluo-3/AM标记囊胚细胞内钙离子,用激光共聚焦扫描显微镜连续检测17β-雌二醇(17β-E2)作用所致囊胚胞内钙离子浓度的动态变化,用荧光显微镜检测偶联牛血清白蛋白的17β-雌二醇(E2-BSA)所致囊胚胞内钙离子浓度的改变,以及在去钙镁M2液、传统雌激素受体阻断剂tamoxifen和磷脂酶C特异抑制剂U73122作用下17β-E2所致囊胚细胞内钙离子浓度的改变。结果显示:17β-E2和E2-BSA均可引起静止状态囊胚细胞内[Ca2 ]的快速升高;17β-E2诱导的囊胚细胞内[Ca2 ]的快速升高不依赖于胞外钙离子的内流,且不被传统雌激素受体阻断剂所阻断,而磷脂酶C特异性抑制剂可明显抑制该效应。     

AmphotericinB在全细胞穿孔膜片钳技术中的应用研究

目的：为研究海德氏突触的电生理特性,建立用amphotericinB穿孔的膜片钳技术。方法：本文应用两性霉素B（amphotericinB）在小鼠脑干的calyx细胞上进行穿孔膜片钳技术的研究。结果：应用amphotericinB进行穿孔后,通道电流衰减现象显著变慢。AmphotericinB的最适浓度为400tc／ml。结论：本研究摸索出了一种稳定的穿孔膜片钳全细胞记录技术,可以更有效,更真实的反应神经元通道电流的电生理特性。为穿孔膜片钳技术在听觉信息传导和调控研究中的应用提供了基础资料。     

慢性多重应激大鼠心律失常及维拉帕米的抑制作用

目的:研究慢性多重应激大鼠心律失常和心房肌细胞内钙离子浓度及血清儿荼酚胺浓度变化,分析钙离子阻滞剂维拉帕米对应激性心律失常的抑制作用.方法:健康雄性SD大鼠随机分为A组(应激组)、B组(应激+维拉帕米组)和C组(对照组).选用噪声加足底电击、强迫游泳和束缚加夜间光照的复合刺激为应激源,建立大鼠慢性多重应激模型.B组大鼠饲以钙离子阻滞剂维拉帕米.记录心电图,分析各组心律失常的类型、心律失常事件次数.测定实验前后血清儿茶酚胺含量,实验结束后,测定心房肌细胞内钙离子浓度.结果:实验结束后A、B两组大鼠全部记录到心律失常,A组大鼠出现较多类型的心律失常(窦性心律不齐、房性期前收缩、室性期前收缩、房性期前收缩和未下传、室上性心动过速、阵发性室速),B组记录到室性期前收缩(ventricular pre-mature beats,VPB)和房性期前收缩(atrial premature beats,APB o B组大鼠出现心律失常时间较晚(A组:17±4d;B组:25±3 d,p<0.01)、心律失常发生频率低于A组(VPB:A=2.0±0.4;B=0.8±0.06,p<0.01 events/min,APB:A=1.8±0.3;B=0.3±0.05events/min,p<0.01).实验结束后,A、B两组血清去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)和肾上腺素(epinephrine,Epi)水平增高,并高于对照组,B组低于A组(NE:A=2,617±344 pg/ml;B=751±146 pg/ml,P<0.01;Epi:A=1,635±224 pg/ml;B=538±106pg/ml,P<0.01).B组动物心房肌细胞内钙离子浓度较A组低(A=215± 26nmol/L;B=101±15mnol/L,P<0.01).结论:钙离子阻滞剂维拉帕米可阻止心房肌细胞钙离子内流和减少儿荼酚胺释放水平进而延缓慢性多重应激诱导的心律失常和降低其发生率.     

微丝在低渗牵张诱导毒蕈碱电流增加中的作用

在急性分离的豚鼠胃窦平滑肌细胞上 ,利用膜片钳技术的传统全细胞模式记录离子电流的方法 ,探讨微丝在低渗牵张诱导毒蕈碱电流增加中的作用。当豚鼠胃窦平滑肌细胞的膜电位钳制在 - 2 0mV时 ,灌流液中 5 0μmol/L 卡巴胆碱 (carbachol,CCh)或电极内液中 0 5mmol/LGTPγS均可引导毒蕈碱电流 (muscariniccurrentICCh) ,低渗牵张 ( 2 0 2mOsmol/L)分别使其增加 145± 2 7%和 183± 3 0 % ;当电极内液中加入 2 0 μmol/L的细胞松弛B (一种微丝骨架的解聚剂 )时 ,低渗牵张使ICCh只增加 70± 6% ;而电极内液中加入 2 0 μmol/L的鬼笔环肽 (一种微丝骨架的稳定剂 )则使ICCh增加了 5 45± 81%。结果表明 ,低渗牵张可增加由卡巴胆碱或GTPγS诱导的毒蕈碱电流 ,微丝参与调节低渗牵张诱导豚鼠胃窦平滑肌细胞ICCh增加的作用     

新鲜分离小鼠胃Cajal间质细胞样细胞的鉴定及其电生理学特性

将免疫荧光及传统全细胞膜片钳技术应用于新鲜分离的小鼠胃Cajal间质细胞样细胞上,探讨了小鼠胃Cajal间质细胞样细胞形态和电生理学特性。经胶原酶消化得到的Cajal间质细胞样细胞胞体呈短梭形,且自胞体发出多个较短的毛刺状突起。免疫细胞化学结果表明,Cajal间质细胞样细胞胞体和突起酪氨酸激酶受体c-kit表达呈阳性。在传统全细胞记录模式、膜电位钳制在-60mV的条件下,可以记录到自发、节律性内向电流,即起搏电流。钙调蛋白抑制剂W-7 （50μmol／L）明显增强了起搏电流幅度并引发明显的内向钳制电流。当电极内液中EGTA的浓度由0．1mmol／L增加到10mmol/L时,也明显增强了起搏电流幅度并引发明显的内向钳制电流。实验结果提示,新鲜分离的小鼠胃Cajal间质细胞样细胞可以产生自发、自律性内向电流,而这种电流对胞内低钙或钙调蛋白抑制剂敏感。这种具有自发性电活动的Cajal间质细胞样细胞可能就是胃Cajal间质细胞。     

通过膜片钳玻璃微电极内插管进行胞内透析

本文介绍一种膜片钳微电极内插管进行胞内透析的方法。利用通用的微电极夹持器在其抽吸负压的侧管上方钻一斜孔直通夹持器中央管腔。插入微量移液管头拉制成的细管（外径约0.1mm）,后者与Ag-AgCl电极一起伸出夹持器口端。通过相连的注射器,可以很方便地进行电极内液置换及胞内药物透析,此法和二次钳压技术及国外介绍的微插管电极内液置换相比,更加简便易行,结果更可靠。