单质粒模式诱导表达载体系统的建立

在Invitrogen公司T-Rex诱导表达系统的基础上,将目的基因与调控蛋白基因克隆于同一载体上,并在CV1细胞中观察了四环素对该单质粒模式载体报告基因表达的诱导效应.载体在瞬时转染CV1细胞并以四环素诱导24 h后目的基因的表达水平提高了8.9倍,表明单质粒模式载体基因诱导表达的应用具有可行性.     

小鼠pαMHC-EGFP胚胎干细胞株的构建

应用电穿孔方法将含有α肌球蛋白重链启动子的pαMHC-EGFP载体转染到D3系小鼠胚胎千细胞,应用200μg／ml新霉素进行药物选择。采用悬浮培养法,体外诱导分化心肌细胞。荧光显微镜下,观察到第7天和第8天拟胚体中出现“跳动”的心肌细胞并同时有绿色荧光蛋白的表达。同时与D3系小鼠胚胎干细胞比较心肌细胞分化率的变化无显著差异（P〉0．05）。该细胞株在分化心肌细胞的同时,具有绿色荧光蛋白的标记,因而利于对心肌细胞的识别和纯化。     

一株受四环素及其衍生物诱导表达的Tet-on鼻咽癌细胞系

Ｔｅｔ－ｏｎ基因表达系统是新近发展的一种真核生物体外表达系统．该系统利用四环素及其衍生物对所感兴趣基因进行诱导表达．这种诱导表达具有严密、高效、可控性强、表达泄露小等优点．对于研究一些致死基因及毒性强的基因在细胞或体内的表达提供了极好的工具．利用Ｔｅｔ－ｏｎ基因表达系统,构建了一株鼻咽癌细胞系,该细胞系的建立为进一步研究一些鼻咽癌发病相关基因,如ＥＢ病毒潜伏膜蛋白基因、瘤基因、抑瘤基因等与鼻咽癌的相关性,提供了理想的细胞模型．     

4个品系小鼠胚胎干细胞系的建立

探索高效的不同品系的小鼠胚胎干细胞的建系方法。B6D2F1(C57BL/6×DBA/2)、129/SV×DBA/2、C57BL/6、BALB/C等4个不同品系小鼠,孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotrophin,PMSG) 人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)促排,3.5天交配后(days post coitus,dpc)冲洗子宫取囊胚,或者2.5dpc冲洗输卵管,卵裂球体外培养获取囊胚。囊胚种植到小鼠成纤维细胞饲养层上干细胞培养液培养,4～5天内细胞团扩增后玻璃毛细管挑出,种植到新的饲养层上过夜再行胰蛋白酶消化,3～4天传代一次。对所建立的小鼠ES细胞系进行形态学、染色体核型、AKP染色、体内外分化能力,干细胞分子标记物荧光免疫染色等鉴定。获得10株小鼠胚胎干细胞,具有典型的胚胎干细胞生长特性,符合ES细胞的鉴定标准。结果表明成功的建立了来自B6D2F1(C57BL/6×DBA/2)、129/SV×DBA/2、C57BL/6、BALB/C等4个不同品系小鼠的10株ES细胞系。内细胞团挑出过夜增殖后消化的培养方法可能有助于提高ES细胞的建系率。     

无血清无饲养层条件下培养小鼠胚胎干细胞

目的研究在无血清无饲养层条件下小鼠胚胎干细胞的培养方法,为最终建立无血清无饲养层培养系统打下基础。方法比较小鼠胚胎干细胞ES-S8株在无血清培养体系和有血清培养体系中的生长情况,分析ES-S8细胞克隆形成效率,测定其生长速度;然后在撤去血清和饲养层的条件下培养ES-S8细胞,进行AKP染色和表面标记物SSEA-1免疫荧光检测。结果ES-S8细胞在无血清培养条件下细胞生长速度减缓,克隆形成率降低,但AKP染色、SSEA-1免疫荧光均显阳性;在无血清无饲养层条件下ES-S8细胞培养仍能形成克隆,且AKP染色、SSEA-1免疫荧光均显阳性。结论研究表明ES-S8细胞能够在无血清无饲养层的培养条件下生长,保持其良好的未分化特性。     

HSP90高表达细胞株的建立及细胞增殖性状的改变

目的:建立稳定高表达热休克蛋白90(HSP90)细胞株,研究其对细胞增殖的影响.方法:含人HSP90 13全长基因的重组质粒pSmycHSP经亚克隆、纯化、酶切鉴定后,用电穿孔法转染到小鼠成纤维细胞系NIH-3T3细胞内.经G418筛选、克隆分离培养,用免疫细胞化学、免疫印迹鉴定阳性克隆.以转染空质粒的NIH-3T3细胞为对照,用MTT法、流式细胞术测定,分析HSP90高表达对细胞增殖和细胞周期的影响.结果:转染pSmycHSP的NIH-3T3细胞HSP90染色增强,生长速度减慢,S期DNA含量降低.结论:己建立稳定高表达热休克蛋白90(HSP90)NIH-3T3细胞株;转染pSmycHSP的NIH-3T3细胞能够有效地表达HSP90,影响细胞周期,使细胞增殖迟滞.     

一种基于三顺反子表达载体的生物素诱导表达系统的建立

目的:建立一种以无毒的生物素为诱导剂的哺乳动物细胞诱导表达系统。方法:通过基因组PCR或重叠延伸PCR获得该系统的三个基本构件:大肠杆菌生物素连接酶(BirA)、链亲和素-四环素依赖的抑制因子融合蛋白(SA-TetR)和生物素化信号-VP16转录激活结构域融合蛋白(Avitag-VP16)。将上述基因连入三顺反子表达载体,与响应载体一起共转染293f细胞,以EGFP为报告基因,检测EGFP荧光强度随培养体系中生物素浓度变化的情况。结果:随着生物素浓度的增加,目的基因表达出现OFF-ON-OFF的变化,诱导状态下的EGFP荧光强度约为抑制状态下的3倍。结论:可通过调节生物素浓度对目的基因的表达进行可逆的调节,该系统是一种有应用前景的诱导表达系统。     

一种基于三顺反子表达载体的生物素诱导表达系统的建立

目的：建立一种以无毒的生物素为诱导剂的哺乳动物细胞诱导表达系统。方法：通过基因组PCR或重叠延伸PCR获得该系统的三个基本构件：大肠杆菌生物素连接酶（BirA）、链亲和素-四环素依赖的抑制因子融合蛋白（SA-TetR）和生物素化信号-VP16转录激活结构域融合蛋白（Avitag-VP16）。将上述基因连入三顺反子表达载体,与响应载体一起共转染293f细胞,以EGFP为报告基因,检测EGFP荧光强度随培养体系中生物素浓度变化的情况。结果：随着生物素浓度的增加,目的基因表达出现OFF-ON-OFF的变化,诱导状态下的EGFP荧光强度约为抑制状态下的3倍。结论：可通过调节生物素浓度对目的基因的表达进行可逆的调节,该系统是一种有应用前景的诱导表达系统。     

可调控小鼠尿激酶原激活剂真核表达载体的构建及其在Huh7细胞中的表达

目的：建立基于Tet-on系统的可调控真核细胞表达小鼠尿激酶原激活剂（uPA）的诱导表达系统。方法：提取C57小鼠肾组织总RNA,RT-PCR扩增uPAcDNA序列;提取基因组DNA,扩增uPA编码区后最后一个外显子序列,构建pTRE2-uPAcDNA-700载体,将其与pTet-on瞬时共转染Huh7细胞系,24h后用强力霉素诱导表达,诱导后36h分别收集细胞和培养上清（诱导组）,提取细胞总RNA并进行细胞uPA转录水平的检测;采用溶圈法对细胞分泌至培养上清中uPA的生物活性进行检测,同时以转染但未诱导Hun7（未诱导组）和正常培养Huh7（正常对照组）细胞及培养上清作为对照。结果：与未诱导组和正常对照组相比较,仅诱导组在转录水平上扩增出目的条带;溶圈法证实转染的细胞不仅表达uPA,而且表达的蛋白具有一定的生物活性。结论：构建了可调控的uPA真核诱导表达系统,为进一步制备可调控肝细胞表达uPA转基因小鼠及进一步揭示uPA肝损伤机理奠定了基础。     

高浓度RA诱导小鼠胚胎干细胞分化为神经细胞

目的：高浓度RA诱导小鼠ESC体外向神经细胞分化。方法：通过5μMRA刺激拟胚体向神经前体细胞分化,在不同基质上进一步诱导神经前体细胞分化为神经细胞,通过免疫荧光鉴定。结果：5μM RA诱导神经前体细胞分化;神经前体细胞分化为β-tubulinⅢ阳性神经细胞,β-tubulinⅢ阳性细胞中有55%为GABA阳性,4%为CHAT阳性细胞。结论：高浓度RA诱导并结合细胞外基质成分优化了ESC向神经细胞分化。     

建立对未分化细胞特异性标记的小鼠胚胎干细胞系

构建pRex-1-EGFP表达载体,电穿孔转染小鼠ES细胞,用增强绿色荧光蛋白对起源于3．5d胚泡内细胞团的小鼠胚胎干细胞进行特异性标记,用荧光显微观察EGFP的表达以及RT-PCR方法检测Rex-1基因在未分化和分化中ES细胞中的表达情况。结果显示,EGFP基因成功转入小鼠ES细胞,并在未分化的ES细胞中高效表达;细胞开始分化后,EGFP的表达开始下降。由Rex-1基因启动子控制下的EGFP稳定表达的小鼠ES细胞系,对哺乳动物早期发育过程的研究以及对筛选能够调节上述过程的小分子化合物具有重要意义。     

稳定表达重组小鼠FAPα蛋白细胞株的构建

采用RT-PCR方法从BALB/c胚鼠成纤维细胞克隆FAPα基因,将其连接至表达栽体pTd-FL-N,转化Stbl3感受态.筛选重组质粒,经酶切、PCR检测及测序鉴定,证实表达质粒构建正确.将表达载体转染HEK293细胞,经G418筛选单克隆阳性细胞,采用Western blot技术证实稳定表达FAPα细胞株构建成功.通过流式细胞术确定FAPa蛋白可定位表达于细胞膜上.     

在小鼠胚胎干细胞进行基因打靶的策略

基因打靶技术是一种通过同源重组按预期方式改变生物活体的遗传信息的实验手段,与小鼠胚胎干细胞培养系统相结合,使得人们可以方便地将各种突变引入小鼠体内,得以从生物整体水平上研究高等真核生物基因的表达、调控及其生理功能.扼要介绍了近年来在小鼠胚胎干细胞进行基因打靶的研究进展.     

定向诱导小鼠ES细胞向心肌细胞的分化

为了提高体外诱导ES细胞向心肌细胞分化的效率 ,对以往的诱导方法加以改进 ,采用直接悬浮培养和 0 8%DMSO诱导 ,建立了简便、高效的定向诱导ES细胞向心肌细胞分化的体系 .诱导第 9d起可见自发性、有节律跳动的类胚体出现 ,第 14d达到高峰 ,约有 70 %的拟胚体产生跳动 .用RT PCR的方法在跳动的拟胚体中检测到心肌细胞特异性标志物的表达 ,采用免疫荧光染色的方法在蛋白水平检测到心肌特异的α辅肌动蛋白 (α actinin)的表达 ,并可见清晰肌小节 ,表明在改进的体外诱导条件下ES细胞可分化为成熟的心肌细胞 .     

远交系小鼠胚胎干细胞系的建立及嵌合鼠的获得

ＥＳ细胞（ＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌｓ）是来源于小鼠早期胚胎的多潜能干细胞,它可以在体外大量培养。并以单细胞的形式注射到早期胚胎里,发育为嵌合体。到目前为止,通常使用的１２９小鼠品系是来源于近交系（ｉｎｂｒｅｄ）小鼠的胚胎．与之相比,远交系小鼠应当具有较强的生命力和抗病能力。曾有人报道过建成了远交系小鼠胚胎干细胞系,但是尚没有见到获得嵌合鼠的报道。有人甚至认为：由于不同品系小鼠所具有的遗传背景不同,有的小鼠不能建成ＥＳ细胞系。最近,本实验室在这方面做了有益的探索,成功地建成了远交系小鼠胚胎干细胞系,并在这里报导首例用远交系小鼠胚胎干细胞系培育成功嵌合体小鼠。采用源于Ｓｗｉｓｓ小鼠远交群的昆明（ＫＭ）品系小鼠囊胚建成了三个小鼠胚胎干细胞系（ＫＥ１．ＫＥ２．ＫＥ５）。核型正常率均达到７０％以上。自第八代起分批冻存,复苏后,培养至第１２代,消化成单细胞,通过囊胚显微注射,将其注射到６１５品系小鼠胚胎。在幸存的幼鼠中获得了一只来源于ＫＥ１细胞的嵌合鼠（Ｔａｂｌｅ１）．其毛色表现为受体鼠（６１５）的白色中嵌合有供体鼠（ＫＭ）的黑褐色（ＰｌａｔｅＩ－Ａ）．嵌合鼠与受体鼠的杂交后代鼠中仍然出现了受体鼠的毛色类型（     

小鼠锌指蛋白基因ZF-12基因剔除的ES细胞系的建立

利用小鼠锌指蛋白ZF－12基因组DNA片段,构建了针对小鼠ZF－12基因座的替换型打靶载体pSSC-TV-10.5。经限制性核酸内切酶酶切及部分测序鉴定其结构正确后,通过电穿孔将线性化打靶载体导入ES人,经G418／GANC双药筛选和分子鉴定,获得4个ZF－12^ /-基因的ES细胞杂合子克隆,其生长状态良好,为进一步建立ZF－12基因剔除的小鼠动物模型创造了条件。     

稳定表达ALB启动子及荧光素酶报告基因的肝干细胞株的构建

目的构建稳定表达ALB启动子及荧光素酶报告基因的肝干细胞株。方法PCR扩增获得ALB启动子,并与pBGLuc连接获得携带ALB启动子及荧光素酶报告基因的pBGLuc—ALB质粒,脂质体转染质粒到不同细胞,ALB—GLuc活性检测功能。构建逆转录病毒,感染HP14．5肝干细胞株获得携带ALB启动子及荧光素酶报告基因的稳定细胞株,经Dex、HGF体外诱导后第3、6、9、12天ALB—GLuc检测荧光素酶活性,免疫荧光检测ALB的表达。结果PCR、酶切及测序结果显示ALB启动子正确插入至荧光素酶GLuc基因上游,HEK293、HP14．5、LC14d及Hepa1-6细胞中ALB—GLuc活性与免疫荧光结果一致。HP14．5ALB—Gluc稳定细胞株在高浓度的稻瘟菌素中存活,免疫荧光结果显示Dex、HGF诱导后细胞中ALB的表达逐渐增强,并与ALB—Gluc活性升高一致。结论成功构建了稳定表达ALB启动子及荧光素酶报告基因的肝干细胞株,为研究肝干细胞的体外成熟分化提供了重要的细胞手段。     

品系对小鼠胚胎干细胞分离效率的影响

为了充分利用小鼠胚胎干(ES)细胞,就必须从众多小鼠品系中分离ES细胞系。本研究通过传统的成纤维细胞饲养层法,从CD-1、129/Sv、C57BL/6J和129/Sv×C57BL/6J四种不同遗传背景的小鼠中分离得到12个ES细胞系,而从KM小鼠没有得到ES细胞系。所有的ES细胞系都具有典型的ES细胞特征,AKP染色呈阳性。从四种不同遗传背景的ES细胞系得到了包含多种组织的畸胎瘤;与桑椹胚聚合后,都得到了生殖系嵌合体。结果表明:品系对小鼠ES细胞的分离有显著影响,利用129小鼠以及包含129小鼠遗传背景的杂交小鼠都较容易分离ES细胞,由ES细胞得到生殖系嵌合体的效率在不同品系间有显著差异,从杂交ES细胞比近交ES细胞中更容易得到生殖系嵌合体。