胎肝干细胞的分离、培养与鉴定

目的体外扩增培养大鼠胎肝干细胞,研究其形态、生物学特性及表面标志物,探讨胎肝干细胞的性质。方法分离培养胎龄12-16d的胎肝细胞,SABC法检测原代、传代后及细胞克隆中的肝干细胞特异表面标志物OV-6、CK-19及nestin的表达。结果原代、传代培养的胎肝细胞部分表达OV-6、CK-19及nestin;培养3d开始出现小细胞团,1个月即形成肉眼可见的细胞集落,5-7d传代一次;细胞克隆几乎全部为干细胞标志阳性细胞。结论胎肝干细胞可通过克隆筛选法进行体外扩增,胎肝内存在nestin阳性干细胞,可能是一种更为原始的干细胞,在胚胎发育中起重要作用。     

人胎肝造血干细胞增殖刺激物的分离及鉴定

经过超滤,ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｅｌ,ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－２００和Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２ＨＲ多步分离纯化,从人胎肝细胞原代培养上清中分离到一分了阳为３５ｋＤ的单一活性组分,真有造血干细胞增殖刺激活性,定义为ＦＬＳ－４,ＦＬＳ－４可能是一种新型造血干细胞增殖刺激因子,与具有这类活性的ＩＬ－３,ＩＬ－６,ＧＭ－ＣＳＦ,ＦＬＴ３配基和ＳＣＦ等在理化特性或生物学性质上均有所差异,在胎肝造血活跃时期,是启动     

人胎肝中两种抑制肿瘤细胞生长活性成分的分离鉴定及功能研究

胎儿组织中存在低分子肿瘤抑制物。胎肝细胞的甲醇－丙酮提取物中保留有大部分抑瘤活性。用体外液体培养条件下对人急性粒系白血病细胞系（ＨＬ－６０）的抑制作用为指标,跟踪分离过程。提取物经反相Ｃ１８中压液相色谱、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ－２０凝胶色谱及正相高效液相色谱分离得到两种活性物质,经ＮＭＲ和ＨＲＭＳ鉴定为７－酮基胆固醇（７－ｋｅｔｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ,７－ＫＣ）和７－β－羟基胆固醇（７－β－ｈｙ     

牛泌乳素mRNA的分离及鉴定

本文报道了从牛脑垂体提取总RNA,经寡聚脱氧胸苷纤维素亲合层析分离获得牛脑垂体Poly(A)~+RNA。牛泌乳素mRNA经含羟甲基汞琼脂糖凝胶电泳分析,估计其长度约为1200个核苷酸。根据牛泌乳素的部分氨基酸序列推断并合成寡聚核苷酸探针,经Northern印迹杂交及放射自显影分析,证实了该mRNA中含有牛泌乳素mRNA的序列。在兔网织红细胞体外翻译体系中,牛泌乳素mRNA促进了~35S-甲硫氨酸参入,翻译合成的初级翻译产物能与兔抗羊PRL抗血清发生特异性免疫沉淀反应,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射自显影分析结果表明,牛泌乳素前体的分子量约25000。     

人蜕膜组织子宫内膜干细胞的分离、培养及鉴定

目的:研究人蜕膜组织中子宫内膜干细胞(endometrial stem cells,EnSCs)的分离、培养及鉴定方法。方法:取人工流产患者的蜕膜组织,用胰酶和II型胶原酶消化分离子宫内膜细胞,计数后,以极低密度接种于10 cm培养皿,分离单克隆贴壁细胞。倒置显微镜观察EnSCs形态变化及克隆形成情况;CCK-8法绘制EnSCs生长曲线,计算倍增时间;流式细胞仪分析EnSCs细胞周期及表面抗原CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、CD146表达情况。结果:EnSCs呈长梭形,成纤维细胞样,可见粗细不等的胞质突起,增殖至80-90%呈漩涡状生长,其克隆形成率分别为3.91%和9.14%;EnSCs生长曲线呈"S"型,接种48 h至60 h后进入对数生长期,于第9天达到平台期,倍增时间为37-52 h;流式细胞仪测定EnSCs表面抗原CD29(99.13%),CD44(97.39%),CD73(99.68%),CD90(96.76%),CD105(89.64%),CD146(77.96%)呈阳性表达,而CD31(1.30%),CD34(0.68%),CD45(1.26%)呈阴性表达,有61.79%的细胞处于G0/G1期,22.37%的细胞处于S+G2/M期。结论:采用组织消化法分离单克隆贴壁的子宫内膜细胞,能够获得纯化的EnSCs。     

小鼠卵巢生殖干细胞分离培养鉴定

通过比较不同酶分离方法获得小鼠（Mus musculus）卵巢生殖干细胞的数量以及不同饲养层培养卵巢生殖干细胞的生长状态,筛选出最佳酶分离方法和饲养层,以期建立更优化的培养体系,并对优化培养体系长期培养的卵巢生殖干细胞进行功能鉴定。选取5日龄C57BL/6雌性乳鼠卵巢,机械法制备卵巢组织碎片后,分别采用传统两步酶法（胶原酶和胰蛋白酶）和改良两步酶法（胶原酶、DNA酶、透明质酸酶、分离酶Ⅱ和胰蛋白酶）分离卵巢生殖干细胞,差速贴壁法纯化后,观察不同酶消化方法对卵巢生殖干细胞数量的影响;将分离得到的卵巢生殖干细胞分别培养于小鼠胚胎成纤维细胞STO系[sandosinbred mice(SIM)embryo-derived thioguanine and ouabain-resistant]、多聚赖氨酸以及明胶3种不同的饲养层,观察卵巢生殖干细胞的生长增殖状态;将传至第6代的卵巢生殖干细胞用碱性磷酸酶检测法和免疫荧光法对卵巢生殖干细胞标志物MVH、Oct4、C-kit和增殖标记物Brdu进行鉴定。结果发现两种酶分离方法均可从卵巢中分离得到卵巢生殖干细胞,其中传统两步酶法获得的细胞经差速贴壁法纯...     

胎肝造血干细胞的移植特性

胚胎发育中,肝脏是一个重要的造血器官。近年来胎肝移植的临床应用重新引起了人们的关注。本文应用染色体的 C-带染色法研究了小鼠骨髓和胎肝造血干细胞在照射受体小鼠中的增殖能力与相互间的竞争作用。实验结果表明胎肝造血干细胞在成年骨髓中的植入率比较同样条件下的成年骨髓造血干细胞低,但胎肝造血干细胞比较成年骨髓造血干细胞具有更强的自我更新或增殖能力。在同种胎肝造血干细胞移植中,为了降低同种移植抗力,提高移植的胎肝造血干细胞在受体中的耐受性,移植前对受体作适当的免疫抑制处理是必要的。因此,克服个体发育屏障和移植免疫屏障是提高同种胎肝造血干细胞移植效果中两个重要的研究课题。     

不同浓度HGF、EGF优化大鼠胎肝干细胞体外培养的研究

目的:研究不同浓度肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)和表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)对大鼠胎肝干细胞体外增殖的影响,探索二者间有无协同作用.方法:取孕14天胎龄F344大鼠胚胎的胎肝,经三步分离法分离纯化后,配置不同浓度HGF、EGF及HGF和EGF联合组培养基,将胎肝干细胞分组培养.光镜下观察细胞增殖状况,MTT法观察不同浓度和不同时间HGF、EGF及HGF和EGF联合对大鼠胎肝干细胞增殖的影响,并进行统计学分析.结果:HGF 10～80 ng/mL各浓度组,EGF 10～80 ng/mL各浓度组增殖效应均大于对照组.当HGF为20ng/mL,增殖效应明显大于对照组(P＜0.01),当HGF浓度继续增高时,增殖效应无明显增高.将20 ng/mL HGF组与不同浓度EGF组合后分组培养细胞,发现20 ng/ml HGF和10 ng/mLEGF联合组增殖效应明显升高,继续升高联合组中EGF浓度,增殖效应无明显提高.结论:HGF和EGF具有明显改善大鼠胎肝干细胞体外无血清培养条件的作用,二者对大鼠胎肝干细胞体外培养具有协同促进作用.其中20 ng/mL HGF和10 ng/mL EGF联合培养促进大鼠胎肝干细胞增殖效果最明显.     

一种快速mRNA差异显示技术及用于分离辐射诱导转录子

介绍一种从不同类型细胞或不同生长状态细胞中分离差异表达基因的快速ｍＲＮＡ差异显示技术。其特点是不用 位素标记操作简便,在普通琼脂糖凝胶电泳中就能分辨差异显示的ｃＤＮＡ带,便于ＤＮＡ回收和进一步重组克隆。用此方法成功地分离到电离辐射诱导转录子。     

人胎肝造血干细胞增殖刺激物的分离及鉴定

经过超滤、ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｅｌ、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－２００和Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２ＨＲ多步分离纯化,从人胎肝细胞原代培养上清中分离到一分子量为３５ｋＤ的单一活性组分,具有造血干细胞增殖刺激活性,定义为ＦＬＳ－４。ＦＬＳ－４可能是一种新型造血干细胞增殖刺激因子,与具有这类活性的ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＧＭ－ＣＳＦ、ＦＬＴ３配基和ＳＣＦ等在理化特性或生物学性质上均有所差异,在胎肝造血活跃时期,是启动早期造血干细胞从Ｇ＿０期进入Ｓ期的主要候选活性物质。     

人脐带间充质干细胞的分离培养与鉴定简

目的：建立并优化人脐带间充质干细胞分离纯化方法,并对其表面标志与多向分化潜能进行鉴定。方法：收集健康足月产胎儿脐带组织,采用组织块贴壁法进行原代培养,流式细胞仪对其表面标志进行检测,通过向成骨成脂分化对其多向分化潜能进行鉴定,RT-PCR对其干细胞特性基因Oct4、Nanog、Sox2、Nestin进行检测。结果：采用组织块贴壁法可在2周左右获得大量间充质干细胞,培养的细胞经流式细胞仪检测,高表达CD29、CD44、CD105、CD106,低表达CD34、CD45;经成骨成脂诱导2周后可分化为成骨细胞和成脂细胞,RT-PCR检测发现原代细胞表达Oct4、Nanog、Sox2、Nestin基因。结论：人脐带间充质干细胞可在体外扩增培养,具有多向分化潜能,可作为组织工程种子细胞来源。     

胚胎肝干细胞的研究进展

近年来的研究表明在胚胎肝脏中存在大量的肝干细胞,它们在肝脏的发育中起着重要作用,并且受到各种时序性表达基因的调控。几个研究组采用不同的方法,分别从小鼠、大鼠和灵长类动物的胚胎肝脏分离并鉴定了具有双潜能的肝干细胞。就胚胎肝脏的发育、调控机制以及胚胎肝干细胞的分离、鉴定等方面的研究进展作一综述,并对胚胎肝干细胞的应用前景和今后的研究方向作了展望。     

胎儿肺组织来源间充质干细胞的分离、培养、鉴定及重编程初探

该文主要研究将进行胎儿肺部组织来源的间充质干细胞（mesenchymal stem cells derived from fetal lung,FL-MSCs）转变成为诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPS细胞）。首先使用酶消化法对胎儿肺部组织进行分离,然后采用常规方法进行培养并成功获得成纤维细胞样细胞。使用共聚焦技术检测获得的细胞,发现角蛋白表达呈阴性;共聚焦技术检测c-Myc、Oct4、Nanog以及Nestin四个干性相关因子,发现它们呈阳性;检测成纤维细胞样细胞的免疫表型,符合间充质干细胞的表型判断标准;然后进行诱导分化实验,发现这些细胞可以向成脂、成骨细胞分化,经过以上实验鉴定获得的成纤维细胞为FL-MSCs。使用Yamanaka四因子体系对FL-MSCs进行诱导,可以形成类似人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hES细胞）的克隆,采用核型分析、STR检测分析以及畸胎瘤形成实验初步验证获得的克隆为iPS。     

胎儿肺脏来源间充质干细胞的鉴定与损伤修复的实验研究

目的 :为研究胎儿肺脏来源间充质干细胞的生物学性状 ,表型和多向分化能力。方法 :取胎龄为 4～ 5个月水囊引产胎儿 ,将肺脏细胞在SF(含 2 %FBS)培养基中培养。测定生长曲线、利用流式细胞仪对培养细胞进行表型测定 ,细胞周期分析 ,体外诱导分化实验。NOD SCID鼠放射损伤后 ,尾静脉输入经PKH2 6染色的间充质干细胞 ,两个月后检测外源细胞在肺脏的定植情况。结果 :从胎儿肺脏可培养出间充质干细胞 ,并可诱导成骨、软骨和脂肪细胞分化 ;移植两个月后可以检测到外源细胞在肺脏的定植。结论 :从胎儿肺脏可分离培养出间充质干细胞 ,在体外有效扩增且保持其低分化状态 ;间充质干细胞可以在肺脏长时间定植。     

牛肝干细胞的分离培养与鉴定

该实验旨在分离牛肝干细胞,培养观察其生长特性,为比较医学研究及开发牛肝脏体外研究工具提供实验基础。实验采用改良的离体两步胶原酶灌流法,结合密度梯度离心分离牛肝干细胞,观察细胞形态及生长特性,并利用免疫荧光染色和PCR对牛肝干细胞相关标志物进行鉴定。实验分离的细胞接种48 h开始贴壁分裂,随后呈集落样生长,表现出干细胞的特性,低密度下培养504 h后细胞呈肝细胞样分化。正常接种密度的细胞可传至P3代,HE染色可见细胞均为单核,核浆比大,呈幼稚低分化状态;免疫荧光染色和PCR结果均显示,该细胞表达甲胎蛋白AFP、上皮细胞黏附蛋白(EpCAM)、造血干/祖细胞表面标志CD34、干细胞因子受体蛋白(c-kit)、细胞角蛋白CK18、CK19。结果表明,该研究分离了一种具有明显干细胞特征,并表达成熟肝细胞和胆管上皮细胞表面标志物的牛肝干细胞。     

颌突外胚间充质干细胞(EMSCs)的体外分离及鉴定

外胚间充质(ectomesenchyme)是一种胚胎发育早期颅面部出现的多能性结构(multipotentstructure),大多数颅面部结构和组织均由其衍生而来,这提示外胚间充质中存在一种干细胞,即外胚间充质干细胞(ectomesenchymalstemcells,EMSCs)。为了分离和鉴定EMSCs,对E125的SD大鼠颌突组织细胞进行了流式细胞学分析,发现其中的外胚间充质细胞表达多种神经谱系和中胚层谱系的标志,包括p75、CD57和nestin等。根据此特点,采用磁细胞分离技术对p75+的颌突外胚间充质细胞进行了分离和克隆培养。克隆分析表明,单个p75+细胞经过10～14d培养,可以形成由两种或两种以上细胞组成的多潜能性克隆(multipotentclone),提示该群外胚间充质细胞具有多潜能性。同时,亚克隆分析表明,多潜能性子克隆中的单个p75+细胞具有再次形成多潜能性克隆的能力,说明这些细胞在体外具有自我更新的能力。这些结果提示,p75+细胞同时具有多潜能性和自我更新能力,因此是外胚间充质干细胞。该干细胞的分离对于口腔颅面部的起源和发育研究无疑具有重要意义。此外,该干细胞的高度可塑性也预示它可以作为一种新的种子细胞,为组织工程皮肤、肌肉、软骨的研究提供新思路。     

胎儿胰岛样细胞团源上皮样细胞分离、纯化和鉴定

旨在优化胰腺干细胞分离、鉴定的方法和体系,为糖尿病研究和治疗提供种子细胞。采用胶原酶消化法,分离培养出胰岛样细胞团(ICCs),对其进行贴壁培养,从中纯化出上皮样细胞。采用MTT法测定其生长情况并绘制生长曲线。采用免疫组织化学染色检测分离得到细胞的PDX-1、PCNA、CK-7、CK-19、Nestin、Glut2、Vimentin、Insulin表达情况。应用流式细胞仪检测其表面标志。由分离培养的ICCs成功纯化出上皮样细胞;传40代,每代冻存106~108个细胞;生长曲线显示其传代第3天进入对数生长期,第5天进入平台期;免疫组织化学染色显示其表达PDX-1、PCNA、CK-7、CK-19、Nestin、Glut2、Vimentin;不表达Insulin;流式细胞仪分析表明其表达CD29、CD44、CD166,不表达CD11a、CD14、CD34、CD45、CD90、CD105、CD117。由胎儿胰腺能分离出具有自我更新能力的上皮样细胞,为导管来源,具干细胞特性。     

鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离培养与鉴定

目的探讨大鼠骨髓源性内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)的分离培养鉴定的方法.方法 Percoll(1.077 g/ml)分离液分离大鼠骨髓单个核细胞,血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factors, VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic Fibroblast Growth Factors, bFGF),对其进行诱导培养,光镜观察EPCs形态,免疫荧光检测血小板内皮细胞粘附分子-1(PECAM-1/CD31)、血管内皮钙粘蛋白(VE-cadherin/CD144)、荆豆凝集素-1(FITC-UEA-1)的表达和摄取Dil荧光标记的乙酰化-低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL).结果 诱导培养7 d后,可见集落和铺路石样结构,激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope, LSCM)显示表型为CD31+VE-cadherin+双阳性细胞以及具有内皮细胞功能的Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1双染色细胞.结论 采用Percoll(1.077 g/ml)密度梯度离心结合VEGF、bFGF诱导培养可以获得EPCs,说明该培养方法可行.     

牛骨髓间充质干细胞的分离培养和初步鉴定

本试验采用全骨髓法和密度梯度离心法来分离纯化和体外培养牛骨髓间充质干细胞,并研究了不同培养基和血清对BMSCs的生长的影响以及对牛骨髓间充质干细胞的初步鉴定。结果表明,全骨髓法和密度梯度离心法均可获得纯化度较高的牛骨髓间充质干细胞,并且能够分化为脂肪样细胞,为利用MSCs作为种子细胞治疗多种疾病提供试验基础,同时可以利用骨髓间充质干细胞作为核供体进行核移植的研究和动物遗传资源的保存。     

miRNAs在肝癌干细胞中的作用

MicroRNAs (miRNAs)是一类参与转录后调控的小分子RNA,它在调控细胞的增殖、分化及肿瘤的形成等多种生理及病理过程中发挥着重要的作用.肝癌干细胞是肝癌组织中具有自我更新能力和分化潜能的一个微群体,它能够启始肝癌的发生,并且与肝癌的抗药性及复发等密切相关.已经有研究表明miRNAs对肝癌干细胞的发生发展起着重要的调控作用,包括致癌和抑癌的作用,因此总结miRNAs在肝癌干细胞中作用,有助于更好理解肝癌干细胞的特性及肝癌肿瘤生物学.近年来,除了传统的分子生物学手段,组学和系统生物学研究策略的运用也为miRNAs在肝癌中的研究提供了新的思路.鉴于此,深入研究miRNAs在肝癌干细胞中的分子机制,将为靶向肝癌干细胞的临床治疗提供新的途径.