表达重组抗CD52单克隆抗体CHO细胞灌流培养基的筛选

目的筛选重组抗CD52单克隆抗体CHO细胞株培养和连续灌流表达用培养基,以提高抗体表达量。方法通过调整原有批培养用培养基中谷氨酰胺和植物水解蛋白,获得5种培养基配比。使用模拟灌注方式进行细胞培养,分析细胞密度、活细胞比率和目标蛋白表达,筛选连续灌流细胞培养和表达用培养基。最后在7 L反应器中采用灌注培养方式对筛选获得的培养基进行验证。结果使用50 mL细胞培养管进行模拟灌注培养时,活细胞比率较高,达到90%以上;CHO细胞在添加谷氨酰胺至4.0 mmol/L和植物水解蛋白至5.0 g/L的批培养用培养基中生长速度最快;在基础培养基中抗体表达量比优化前高15%。20 d培养周期内,优化的培养基在7 L反应器中可以维持CHO细胞密度在(2 727±253)万个/mL,活细胞比率在95%以上。结论通过模拟灌注培养,筛选获得了一种在7 L反应器灌流培养中适宜于重组抗CD52单克隆抗体CHO细胞表达的培养基。     

促进CHO细胞生长及其产物hNGF表达的培养条件的初步研究

以稳定表达人神经生长因子（hNGF）的重组工程CHO细胞株为对象,采用无血清流加悬浮培养（Fed batch culture）方式,考察使用基础培养基(无特殊添加物),分别添加丁酸钠、DMSO、KH2PO4的培养基及不同培养温度（32℃和37℃）对细胞生长和重组蛋白表达的影响。每日取样检测细胞密度、细胞活率、葡萄糖浓度、重组蛋白浓度。结果表明细胞培养温度由37℃下降至32℃,细胞生长周期明显延长,重组蛋白产量增加。5mmol/L丁酸钠和2% DMSO的加入虽然提高了重组蛋白的表达量,但严重抑制细胞生长。最大的蛋白比生成速率（qNGF）出现在37℃培养且添加2% DMSO的培养条件下,而最高蛋白表达量则出现于32℃培养添加3.65mmol/L KH2PO4的培养条件下。研究表明,将培养温度设为32℃,在基础培养基中添加3.65mmol/L KH2PO4或1% DMSO是提高hNGF表达水平的有效方法。     

大规模动物细胞培养技术研究进展

利用动物细胞大规模培养技术可生产多种生物制品,为提高细胞活力和表达水平及有利于表达产物的纯化,采用有多种添加成分的无血清培养基培养细胞,选择更有利于细胞生长又可提高培养细胞密度的微载体和条件温和、易操作、气体交换速度快的生物反应器,在线监控细胞生存环境和生理活动,减少培养过程培养基中的抑制因素,可创造更适合细胞生存的环境,提高表达水平,向细胞中导入抗凋亡基因,可提高细胞活性和蛋白产量。利用多也微载体以球转球方式大规模培养动物细胞有很好的发展前景。     

运用氨基酸分析法和DOE法优化抗PD-1单克隆抗体生产用培养基

本研究采用氨基酸分析法结合DOE设计法优化并获得高表达抗PD-1单克隆抗体生产用基础和补料培养基。通过对市售多种基础和补料培养基进行筛选,获得细胞生长状况较优的基础培养基和抗体表达较高的补料培养基,利用氨基酸分析法检测较优基础培养基和补料培养基中氨基酸消耗情况,确定影响细胞生长和抗体表达的关键氨基酸种类,利用DOE分析软件设计分别在较优基础和补料培养基中添加不同浓度的氨基酸种类及浓度,根据细胞生长及抗体表达,优化得到抗PD-1单克隆抗体的基础和补料培养基组合。最终优化后基础培养基配方为:Hycell CHO培养基中添加1.04 mmol/L L-天冬酰胺和0.76 mmol/L L-谷氨酰胺。最终优化后补料培养基配方为:OPM CHOCD Feed1补料培养基中添加38.7 mmol/L L-组氨酸,75.0 mmol/L L-酪氨酸,64.0 mmol/L L-丝氨酸,49.2 mmol/L L-谷氨酰胺和18.7 mmol/L L-半胱氨酸。经过3 L反应器培养验证,优化后的培养基比未优化时,最大活细胞密度(PVCD)提高了62.7%,抗PD-1单克隆抗体表达量提高了71.5%,且活性无明显差异。     

氨基酸分析在细胞工艺研究中的应用

在CHO细胞培养过程中,氨基酸的变化和消耗,是伴随CHO细胞所表达的抗体不同而发生变化。这就要求在细胞培养工艺的后期添加不同成分和比例的氨基酸进行补充,本文研究了用相同的CHO细胞为载体,表达不同抗体的细胞培养工艺后期氨基酸变化情况。从而,为细胞培养工艺后期流加氨基酸提供依据。通过氨基酸的补充可以提高培养工艺中细胞的活率和维持的时间,从而提高单批产量。这在今后放大培养过程中,对工艺的优化有着重大的意义。     

用于重组蛋白生产的哺乳动物细胞表达新技术

近年来,用于重组蛋白生产的哺乳动物细胞表达领域涌现出一系列革命性的新技术。优化的工程细胞为表达重组蛋白提供了优良的宿主;基于荧光的筛选方法可以快捷地得到高表达细胞株;高通量的培养工艺能够预测适合外源蛋白表达的细胞培养条件;可抛弃式生物反应器为大规模细胞培养提供了更多的选择;大规模瞬时表达技术节省了重组蛋白的生产时间。这些新技术提高了重组蛋白的研发和生产效率,加快了蛋白药物的工业化进程。     

效应面法优化CHO细胞培养基中几种丰要成分的含量

目的：考察培养基中葡萄糖、谷氨酰胺、血清、碳酸氢钠含量对CHO细胞生长繁殖的影响。方法：在CHO细胞培养基中添加不同成分的葡萄糖、谷氨酰胺、血清、碳酸氢钠,通过单因素实验结果结合Box-Behnken效应面法,根据二次回归模型的分析结果,以细胞表达蛋白体外活性为指标进行实验,考察培养基中葡萄糖、谷氨酰胺、血清、碳酸氢钠含量对细胞生长繁殖的影响。结果：根据回归方程分析结果,作出相应的曲面图和等高线图,优选出培养基中各组分的最佳配比为：葡萄糖2．54g／L、谷氨酰胺O．59g／L、血清8．3％,碳酸氢钠2．96g／L。结论：Box—Behnken实验设计法用于细胞培养过程中考察培养基中各组分的优选是可行的,数学模型的预测值与实验观察值相符。通过对CHO细胞培养基成分的优化,使CHO细胞蛋白表达量高,有利于提高产品质量和降低生产成本。     

用填充床生物反应器大规模培养表达重组人红细胞生成素的细胞株

目的：用填充床生物反应器培养表达重组人红细胞生成素的工程细胞株C2W,使其达到高密度高表达。方法：将工程细胞株用含5％小牛血清的DF培养基复苏放大培养,当细胞达到10^9时,接种到5L生物反应器中,先用含血清培养基生长培养,再换为无血清培养基表达培养;在整个培养过程中,采用流加方式连续培养,每日采样测定培养上清中葡萄糖浓度,隔日测定细胞的表达水平。结果：接种量约为10^9细胞;细胞罐培养57d,包括含血清生长培养6d,无血清表达培养51d：重组人红细胞生成素平均表达水平为5636U／mL,最高时达7880U／mL;收集无血清培养上清476L,平均每日灌流量8.3L,最高时达12L／日。结论：在适当的条件下,利用填充床生物反应器可使工程细胞株的培养达到长时间、高表达。     

效应面法优化CHO细胞培养基中几种主要成分的含量

目的:考察培养基中葡萄糖、谷氨酰胺、血清、碳酸氢钠含量对CHO细胞生长繁殖的影响。方法:在CHO细胞培养基中添加不同成分的葡萄糖、谷氨酰胺、血清、碳酸氢钠,通过单因素实验结果结合Box-Behnken效应面法,根据二次回归模型的分析结果,以细胞表达蛋白体外活性为指标进行实验,考察培养基中葡萄糖、谷氨酰胺、血清、碳酸氢钠含量对细胞生长繁殖的影响。结果:根据回归方程分析结果,作出相应的曲面图和等高线图,优选出培养基中各组分的最佳配比为:葡萄糖2.54 g/L、谷氨酰胺0.59 g/L、血清8.3%,碳酸氢钠2.96 g/L。结论:Box-Behnken实验设计法用于细胞培养过程中考察培养基中各组分的优选是可行的,数学模型的预测值与实验观察值相符。通过对CHO细胞培养基成分的优化,使CHO细胞蛋白表达量高,有利于提高产品质量和降低生产成本。     

蛋白水解物在动物细胞培养中的应用研究进展

蛋白水解物是蛋白质经水解得到的混合物,其主要成分为肽类。蛋白水解物可优化动物细胞培养基的组成,并且其中所含部分肽段可作为外部分子信号对细胞代谢、生物合成、生长、凋亡及产物表达等生命活动产生特殊的调控作用,因而被广泛应用于动物细胞培养领域,以生产单克隆抗体、疫苗、干扰素等生物制品。其作为无血清或低血清培养基的营养成分,可消除或降低血清带来的病毒微生物污染。随着蛋白水解物生产工艺的改进及优质产品的问世,其必将在细胞培养等生物技术领域发挥越来越重要的作用。