鲢鱼可溶性谷胱甘肽S-转移酶(sGST)基因cDNA全序列与5′调控区的克隆与分析

淡水鱼类可溶性谷胱甘肽S-转移酶(sGST)在微囊藻毒素去毒代谢过程中具有独特 的关键作用,因而也称为微囊藻毒素去毒酶. 从淡水食毒藻鱼类鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)肝脏通过简并引物克隆微囊藻毒素去毒酶基因cDNA核心序列,应用5′RACE和3′RACE技术分别扩增该序列的5′末端和3′末端序列,最后通过序列拼接获得鲢鱼肝脏微囊藻毒素去毒酶基因cDNA全序列. 序列分析结果表明,鲢鱼肝脏微囊藻毒素去毒酶基因cDNA全长920 bp,其中5′-UTR长74 bp,3′-UTR长174 bp,编码区长672 bp,编码223个氨基酸. 应用基因组步行法,在鲢鱼克隆得到淡水鱼类微囊藻毒素去毒酶基因5′侧翼区878 bp序列. 与哺乳动物及海水鱼sGST基因不同,鲢鱼微囊藻毒素去毒酶基因的5′侧翼区,发现存在多个脂多糖反应元件(LPSRE),表明来源于毒藻的脂多糖可能对鲢鱼微囊藻毒素去毒酶基因表达有潜在调控作用.     

鸡生长激素基因5′端部分调控区的克隆分析

利用PCR技术扩增、克隆、测序了7个跨越不同生长速度的鸡品种(系)的生长激素(GH)基因的5′端部分调控区。这7个品种(系)分别为:高生长速度的宝罗肉鸡父本;较高生长速度和一定的产蛋性能的宝罗肉鸡母本;肉蛋兼用型的芦花鸡;中等生长速度和中等体重的蛋鸡品种洛岛红和农大褐;生长速度较慢体重较轻的蛋鸡品种北京白鸡和生长速度很慢但又不是矮小型的地方品种丝毛乌骨鸡。所扩增的片段长度为760bp,包括了转录起始位点5′端侧翼区的473bp、两个可能的TATA框、组织特异性转录因子结合位点、第一个外显子和部分第一内含子。所有克隆的鸡GH基因5′端调控区与Tanaka发表的序列相比,均在-34碱基的位置上缺失一个胞嘧啶C,在 160与 161碱基之间多1个胸腺嘧啶丁,在 175碱基的位置上出现了以腺嘌呤A替换了鸟嘌呤G的情况。7个品种(系)之间的比较显示,鸡GH基因启动区具有极高的保守性,在具有不同生长速度的鸡品种间不存在任何差异。说明鸡的不同生长速度和成年体重,不是由于生长激素5′调控区变异造成的。鸡生长激素基因表达的差异可能受到内含子或3′端侧翼序列的影响。     

草原红牛IGF-I基因5′调控区序列的生物信息学分析

胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因为多启动子基因,也是影响动物生长发育和肉用性状的重要候选基因.在克隆草原红牛IGF-I基因5′调控区1 954 bP的基因组序列基础上,利用生物信息学软件,分析了IGF-I 5′调控区的启动子结构;预测出评分在95分以上的转录因子结合位点有71个;分析结果没有发现CpG岛和TATA-box.研究结果为进一步研究IGF-I转录效率以及对草原红牛生长和肉用性状的影响奠定基础.     

大麦条纹花叶病毒新疆株(BSMV-XJ)RNA_2的cDNA克隆及5′端序列分析

分离了大麦条纹花叶病毒(BSMV)新疆株基因组的3个RNA组份。以RNA2为模板,3′端互补寡核苷酸为引物,合成了第一条cDNA链和第二条cDNA链,将ds-cDNA重组在pUC9质粒中,转化大肠杆菌细胞,获得含RNA3′端的克隆,并证明所选克隆的cDNA含有新疆株几近全长的RNA2组份。对于插入片段为3.3kbp的112号克隆进行了酶谱分析,得到了与国外典型株类似的结果;用双脱氧终止法分析了相当于RNA 2 5′端250bp的cDNA酶切片段,表明与国外典型株有十分相似的一级结构。     

巴西橡胶树HbCOI1基因5′调控序列的克隆及分析

利用GenomeWalker方法获得了巴西橡胶树HbCOI1的5′调控序列。通过分析表明,在该序列中除了含有真核生物典型的核心启动子区域(879~928 bp,TATA box存在于886 bp)外,一些与真核生物顺式调控元件相似的序列也存在其中,如在63、85和604 bp等处具有CAAT序列;在212、385和427 bp处有5′UTR Py-richstretch元件;在96 bp处有1个与茉莉酸应答相关的元件TGACG;在43 bp处存在1个与水杨酸应答相关的TCA-element;在145 bp处存在1个与抗性和胁迫应答相关的TC丰富重复序列。此外,在626、745、834和864 bp处分别有ACGTT-box、GATA-box、ARR1AT和I-box等顺式作用元件。     

鲢鱼轻酶解肌球蛋白的cDNA克隆及结构解析

与栖息温度相关的鲢鱼两种轻酶解肌球蛋白重链(light meromyosin,LMM)同工型(低温型,sc-w;高温型,sc-s)的氨基酸序列解析结果表明:sc-w与sc-s在LMM的氨基酸序列上显示91.8%的同源性,但与已经报道的草鱼(Ctenopharyngodon idella)低温型(gc10)有96.9%的...     

大鼠脑谷氨酸脱羧酶基因的cDNA克隆及序列分析

胰岛β－细胞自身抗原蛋白之一是脑中谷氨酸脱羧酶（Ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ,ＧＡＤ,ＥＣ４．１．１．１５）同源物,以双链ｃＤＮＡ为模权,用ＰＣＲ方法快速克隆了Ｗｉｓｔａｒ大鼠脑ＧＡＤ基因的ｃＤＮＡ将此包括编码５９３个氨基酸的全长ＤＮＡ片段重组入ｐＵＣ质粒并用双脱的氧末端终止法测定了全部序列,证明其全长为１７７９ｂｐ,经比较发现Ｗｉｓｔａｒ大鼠脑与Ｒｕｓｓｅｌｌ报导的大鼠脑Ｇ     

荔枝LcVSP1基因5′调控序列的克隆及功能初步鉴定

利用Genome Walker法获得了荔枝营养贮藏蛋白质Lc VSP1基因的5′调控序列,构建了含有该序列的植物表达载体并转化烟草,通过PCR和GUS染色对转化植株进行了鉴定.序列分析表明,Lc VSP1基因的5′调控序列中除含有真核生物典型的核心启动子区域和保守的TATA box序列外,还发现了一些与真核生物启动子中相似的顺式调控元件.对获得的转基因植株的GUS染色发现,在转基因植株的茎、叶柄和主叶脉呈现蓝色,表明Lc VSP1的5′调控序列可以启动GUS基因的表达,具有启动子的活性,并具有组织特异性.     

油菜APETALA3基因5′调控序列的克隆及分析

利用单引物PCR方法获得了甘蓝型油菜APETALA3重复基因拷贝BnAP3-3和BnAP3-4的5' 调控序列.分析结果表明,两段调控区序列一致性为80.43%,大多数的保守功能元件如TATA盒和CAAT盒没有明显差异,都含有一些应对环境胁迫及诱导的元件,如MYB1AT、GATABOX和DOFCOREZM等.少数顺式作用元件存在较大差异,其中CGACGOSAMY3、CArG box、CARGCW8GAT及CAREOSREP1为BnAP3-3的5'调控序列所特有,而BnAP3-4的5'调控序列则含有GT1CONSENSUS.半定量RT-PCR显示,BnAP3-3表达量远高于BnAP3-4,可能与二者调控区某些功能元件序列差异有关.     

鲢鱼骨骼肌肌球蛋白重链基因的cDNA克隆与表达

肌球蛋白分子含有2个约200kD的重链亚基和4个约20kD的轻链亚基,重链亚基由球状的头部(S1)和α-双螺旋的杆部(Rod)组成1。在鱼类肌肉蛋白质的组成中,肌球蛋白约占肌原纤维蛋白的50%以上,并且其基因在生物进化过程中的变异性很大,以致肌原纤维蛋白性质的变化主要是由肌球蛋白的变化引起的2。       

两个枣树扩展蛋白基因cDNA全序列的克隆及分析

用定向克隆法构建了枣树(Ziziphus jujubaMill.)快速生长初期结果枝的cDNA文库,经过重组质粒的筛选,克隆获得两个扩展蛋白基因cDNA全序列,分别命名为ZjEXP1(GenBank登录号:FJ449891)和ZjEXP2(GenBank登录号:FJ449892)。ZjEXP1全长1 037 bp,包含编码254个氨基酸的完整开放阅读框;ZjEXP2全长905 bp,包含编码251个氨基酸的完整开放阅读框。两个序列有共同的结构特征,即在N-末端有8个保守的半胱氨酸残基的丰富域,C-末端有4个保守的色氨酸残基的丰富域,中间有一个组氨酸(His-Phe-Asp,HFD)功能域。两者之间的氨基酸同源性为74.0%。从已知的扩展蛋白基因家族的进化分析表明,ZjEXP1和ZjEXP2由一个祖先进化而来,又分别属于两个不同的分支。     

小花棘豆(Oxytripis glabra DC)毒素基因的cDNA克隆及序列测定

在完成小花棘豆毒素 95 %氨基酸序列的基础上 ,根椐已知的氨基酸序列 ,设计合成了特异简并引物 .以小花棘豆总RNA为模板 ,逆转录合成cDNA第一链 ,用置换法合成双链cDNA .用特异引物对此双链cDNA进行PCR扩增 ,将扩增后的目的基因与用SmaⅠ酶切的质粒pUC 18连接 ,转化大肠杆菌JM10 7.筛选阳性克隆进行序列分析 ,获得了OXY基因的全部序列 .经测序后测得基因序列与原氨基酸序列对照完全一致 .GenBnak数据检索说明 ,OXY基因编码序列确定是一个从未报道的序列 .此研究结果对该毒素的应用研究奠定了基础 .     

鹅卵清蛋白基因5'端调控区的克隆和序列分析

通过PCR技术从产蛋鹅输卵管基因组中扩增出1．2kb的鹅清蛋白基因5’端调控区,将其亚克隆入phD18-T载体的多克隆位点(标记为pOV),经酶切和测序鉴定：扩增产物只有3个碱基发生了突变,其TATA框、组织特异性因子和卵清蛋白上游启动子均未发生变异,表明鹅清蛋白基因5’端调控区可作为启动外源基因表达的调控序列。为构建其启动外源基因的质粒表达载体奠定了研究基础。     

鸡生长激素基因5‘端部分调控区的克隆分析

利用ＰＣＲ技术扩增、克隆、测序了７个跨越不同生长速度的鸡品种（系）的生长激素（ＧＨ）基因的５＇端部分调控区。这７个品种（系）分别为：高生长速度的宝罗肉鸡父本;较高生长速度和一定的产蛋性能的宝罗肉鸡母本;肉蛋灵用型的芦花鸡;中等生长速度和中等体重的蛋鸡品种洛岛红和农大褐;生长速度较慢体重较轻的蛋鸡品种北京白鸡和生长速度很慢但又不是矮小型的地方品种丝毛乌骨鸡。所扩增的片段长度为７６０ｂｐ,包括了转录起     

黑曲霉bgl基因的cDNA克隆及序列分析

通过一步法提取黑曲霉AS3．796的总RNA,利用依据其他黑曲霉β-葡萄糖苷酶（bgl）基因序列设计的一对特异性引物,采用RT-PCR方法扩增得到了该菌bgl基因cDNA片段。将目的片段与pGEM-T载体连接并转入大肠杆菌。序列测定结果表明该cDNA片段大小为2583bp,其基因序列与已公布的其它黑曲霉bgl基因的同源性最高可达99％。蛋白质分析结果表明该β-葡萄糖苷酶属于糖苷水解酶家族3成员。     

寿光鸡ADSL基因5′调控区的克隆、序列分析以及单核苷酸多态性的研究

腺苷酸琥珀酸裂解酶(ADSL)是双功能酶,催化嘌呤核苷酸的起始合成与嘌呤核苷酸的循环。通过对寿光鸡ADSL 5′调控区1035bp的序列进行克隆和测序分析,发现其具有典型的管家基因特征：没有真核基因明显的TATA盒和CAAT盒出现,并且位于起始密码子(ATG)前234个碱基具有非常高的GC含量达72．65％。在邻近起始密码子“ATG”处,5′调控区含有两个核呼吸因子-2(NRF-2),在相同位置上人类ADSL基因也具有与此类似的两个核呼吸因子-2结合位点,被认为在嘌呤核苷酸合成途径起到重要作用。值得一提的是位于寿光鸡5′侧翼调控区-27号碱基发生C→T突变,存在于所有研究的寿光鸡个体中,频率为1。该突变使得本来不是NRF-2(核呼吸因子2)结合位点的CTCC突变为NRF-2结合位点CTTC。而人类却恰恰与此相反第一个NRF-2结合位点发生了突变(CTTC→CTCC),并导致出现ADSL缺陷症状。     

人蛋白C cDNA基因的克隆及序列分析

为实现人蛋白C cDNA在哺乳动物细胞中的表达以及研究其生物学特性,针对人蛋白C cDNA序列设计引物,运用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从人胎肝总RNA中钓取人蛋白C cDNA,将其克隆入pIRES neo载体中,通过酶切和PCR鉴定出重组体并进行测序分析。结果表明,获得大小为1386bp的人蛋白C cDNA基因,成功构建人蛋白C cDNA载体pIRES/hPC,为进一步进行人蛋白C cDNA的表达和活性鉴定奠定了基础。     

鲢鱼、鳙鱼、草鱼谷胱甘肽过氧化物酶cDNA的克隆及肝组织表达

利用RT-PCR技术分别从淡水食毒藻鱼类鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)、鳙鱼(Aristichthys nobilis)及草食性鱼类草鱼(Ctenopharyngodon idella)肝组织扩增出谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)cDNA核心序列。序列分析表明鲢鱼、鳙鱼、草鱼GPX的cDNA序列均为263bp,编码87个氨基酸。鲢鱼、鳙鱼、草鱼与斑马鱼(Danio rerio)(同属鲤科)、条石鲷(Oplegnathus fasciatus)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)(鲈形目)等鱼类GPX氨基酸序列同源性很高,为75%～93%;与人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)、猪(Sus scrofa)、牛(Bos taurus)等哺乳动物GPX氨基酸序列的同源性也较高,为76%～79%。以β-肌动蛋白为内参照,比较鲢鱼、鳙鱼、草鱼肝组织GPX cDNA的表达水平,鲢鱼、鳙鱼肝组织GPX的表达量远高于草鱼肝的GPX表达量,这与鲢鱼、鳙鱼大量摄入微囊藻毒素在鱼体内引发产生过量的脂过氧化物相适应。     

家蝇防御素基因的cDNA克隆及序列分析

Defensin is a kind of cationic.inducible antimicrobial peptide found in a large range of living organisms that contributes to host defense by disrupting the cytoplasmic membrane of microorganisms.with their broad antimicrobial spectrum and strong pharmaceutical effects.antimicrobial peptides,including defensins,represent a source of novel antibiotic agents.A novel full-length 430 base pairs cDNA of an insect defensin was cloned using polymerase chain reaction (PCR) from the cDnA library of houseflies(Musca domestica) that had been challenged by E.coli and staphylococcus taincd an NH2-terminal signal sequence(1-22)followed by a propeptide and the mature peptide(53-92),The sequence identity with other insect defensin is between 51% and 73%.The mature peptide,with a predicted molecular weight of 4.0kDa,and pI of 8.69,has 1 negative charged amino acid and 4 positice ones,the putative housefly defensin is characterized by 6 invariant cysteine residues forming 3 disulfide bonds,Cys1-Cys4,Cys2-Cys5 and Cys3-Cys6,These results suggest that the novel full-length cDNA of the defensin gene.Denominated Mdde,has been successfully cloned from houseflies.