转基因植物内源基因与外源基因共抑制问题研究进展

在植物基因工程研究中,有时外源转化基因和植物中同源的内源基因的表达均被抑制了,这种现象被称为共抑制。引起该现象的原因包括许多因素,有外源基因和与之同源的内源基因RNA的转录量,DNA的甲基化,T-DNA的结构形式,RNA依赖的RNA聚合酶,非正常RNA以及非等位配对等。其具体机制仍不清楚。最近的研究结果表明转基因植物对病毒的抗性在某些方面与共抑制有相似之处。两者都表现为外源转化基因转录水平很高而稳定RNA的水平很低。本文综述了这方面的最新研究进展。     

不同启动子调控外源基因在斑玉蕈中的表达分析

启动子是控制基因转录的重要顺式元件,也是遗传转化实验中驱动外源基因表达的重要工具。在同一真菌中,不同启动子驱动外源基因表达水平可能存在明显差异。因此,选择合适的启动子是提高外源基因表达水平的关键。本研究分别应用花椰菜病毒35S RNA（cauliflower mosaic virus 35S RNA,CaMV35S）和斑玉蕈甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Hypsizygus marmoreus glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,HmGPD）基因的启动子构建了两个遗传转化质粒,在斑玉蕈中分别驱动外源的植物花青素合成基因表达,并利用来自刺芹侧耳的萎锈灵抗性基因进行转基因筛选。两个质粒通过农杆菌介导转化斑玉蕈单核菌株后,对具有萎锈灵抗性的转化子经PCR方法进行转基因验证,并运用实时荧光定量PCR对阳性转化子中外源基因的表达水平进行比较分析。结果表明,CaMV35S和HmGPD基因的启动子均成功驱动了植物花青素合成基因在斑玉蕈中转录,为增强基因表达而引入的内含子在转录过程中均被正确切割。其中,HmGPD启动子驱动外源基因表达水平比CaMV35S启动子驱动外源基因表达水平强22-36倍。     

利用Ⅱ型启动子转录的U6 RNA提高植物病毒表达载体在植物中表达外源基因的水平

Ⅱ型启动子转录的外源短链RNA可以竞争性抑制细胞内源mRNA的核质转运,因而可能会提高植物RNA 病毒载体表达的外源基因在植物中的积累. 为了验证这一假说,利用OE-PCR技术合成拟南芥U6-1核内小RNA序列,并构建其Ⅱ型启动子转录的植物表达载体. 以农杆菌渗滤技术,与烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）表达载体共接种寄主植物本氏烟,通过对报告基因绿色荧光蛋白（green fluorescence protein, GFP）的荧光观察,并以Western印迹和ELISA测定GFP在烟草中的表达情况,分析共表达Ⅱ型启动子转录的U6 RNA对外源基因在植物中表达的作用效果. 结果表明,共接种Ⅱ型启动子转录的U6 RNA对TMV病毒表达载体表达外源基因的水平有明显的增效作用,推测RNA核质转运干扰是提高外源基因表达的可能机制.     

植物中指导RNA偶联转录调控因子抑制基因表达研究

本研究建立了一种简单、精确和高效的新型抑制植物基因表达的技术体系。将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)、指导RNA(guide RNA,g RNA)和编码转录抑制因子与噬菌体外壳融合蛋白的三种基因构建到植物表达载体中。利用农杆菌介导的植物瞬时表达技术侵染本氏烟草。研究显示gfp基因在烟草叶片中的表达受到显著抑制,抑制率达到36.2%。此系统可运用于对其他基因进行基因调控,由于只需要改变g RNA,而其他组成原件保持不变,因此该技术具有操作简单及广泛的适应性等特点。为在植物基因组中精确抑制基因表达提供了有效的工具。     

植物逆境相关启动子及功能

启动子是调控基因表达的重要顺式元件, 在植物基因表达调控过程中起着重要作用。目前植物抗逆基因工程中, 人们大多使用组成型表达启动子驱动目的基因的表达。组成型表达启动子虽然能提高转基因植株的抗逆性, 但是其持续过量地表达转化的外源基因会阻碍植物的生长且减少其产量。因此, 只在胁迫条件下才会驱动外源基因表达的诱导型启动子的研究显得尤其重要, 已成为目前研究的热点。文章综述了受非生物逆境和生物逆境胁迫诱导的植物基因启动子的种类和功能, 并展望了植物逆境诱导启动子的研究方向和前景。     

生境因子及理化因素对外源基因在植物体内表达的调节

外源基因在植物体内的表达除受植物体本身代谢及分子调节外,还受生境因子及理化因素等外界环境因子的调节.生境因子及理化因素可诱导植物某些基因的表达,同时调控这些基因的启动元件;利用营养及逆境胁迫条件改变植物的生长代谢也可实现对外源基因表达的调节.本综述了生境因子及理化因素对外源基因在转基因植物体内表达的调控机制.     

RNA:诱导基因沉默

在生物体中 ,双链RNA (double strandRNA ,dsRNA)裂解后的小RNA可以诱导细胞质和基因组水平外源基因沉默。所谓基因沉默 (genesilencing)是指生物体中特定基因由于种种原因不表达。小RNA能诱导互补信使RNA在转录后降解 ,对于植物 ,可通过同源DNA序列甲基化使转录基因沉默。RNA沉默是基因组水平的免疫现象 ,代表了进化过程中原始的基因组对抗外源基因序列表达的保护机制 ,在动植物进化中起着重要作用 ,RNA沉默具有抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、防止自私基因序列的过量增殖等作用 ,并调控蛋白编码基因的表达 ,具有十分诱人的应用前景     

T7 RNA聚合酶基因表达系统在鱼腥藻7120中构建及hG-CSF的表达

外源基因的表达效率低是蓝藻基因工程发展的瓶颈之一,T7 RNA聚合酶表达系统实现了大肠杆菌中外源基因的高效表达,蓝藻与大肠杆菌同为革兰氏阴性菌,具有较高的遗传同源性,在蓝藻中构建T7 RNA聚合酶表达系统有可能提高外源基因在蓝藻中的表达效率。为了在鱼腥藻7120中构建T7 RNA聚合酶表达系统,采用重叠延伸PCR技术和酶切连接等方法构建能够表达T7 RNA聚合酶的定点整合载体pEASY-T1-F1-TacT7RNAPCmR-F2以及由T7启动子驱动hG-CSF基因表达的穿梭表达载体pRL-T7-hG-CSF;采用电击转化法将定点整合载体导入野生型鱼腥藻中,通过三亲接合的方法将穿梭表达载体转入已定点整合T7 RNA聚合酶的转基因鱼腥藻中。利用PCR技术鉴定外源基因在蓝藻中的存在;RT-PCR方法检测外源基因在蓝藻中的转录情况;Western blotting实验检测外源基因在蓝藻中的蛋白表达情况。结果表明两种载体构建成功,T7 RNA聚合酶基因和hG-CSF基因被转入鱼腥藻中,两个基因均在藻中表达,T7 RNA聚合酶表达系统在鱼腥藻中构建成功,与传统蓝藻表达系统相比,文中在鱼腥藻中构建的T7表达系统使hG-CSF基因的表达量提高2倍。该表达系统将为蓝藻基因工程的应用提供更优的工具,将促进蓝藻作为底盘细胞在合成生物学等领域的发展。     

叶绿体转化及其用于疫苗表达研究的最新进展

随着植物转基因研究的不断深入,核基因组转化的转基因沉默现象严重影响了基因工程的应用效果。植物叶绿体遗传转化以叶绿体基因组为平台对植物进行遗传操作,外源基因定点整合及母性遗传特性能较好地解决"顺式失活"和"位置效应"等类的基因沉默问题和转基因逃逸等安全问题,成为植物基因工程发展的新方向,在工业、农业及医药生物领域发挥了重要作用,也为生产廉价、安全的植物疫苗提供了新思路。本文在简要介绍叶绿体转化的原理、转化方法与优势的基础上,重点综述了近年来通过该技术表达的一些重要的病毒抗原和细菌抗原。最后,对叶绿体转化技术在表达外源基因方面存在的问题进行分析。未来随着叶绿体基因表达、调控机制研究的逐渐深入及相关技术体系的日臻完善,叶绿体转化有望成为疫苗生产的生力军。     

植物转基因沉默及控制

植物基因工程的目的就是获取外源基因能够按照设计要求正常表达和稳定遗传的转基因植物。近几年来,广泛报道了转基因植物中存在转基因沉默现象。主要阐述了两种转基因沉默的机理即转录水平的基因沉默和转录后水平的基因沉默,各种机理都涉及DNA DNA,DNA RNA,RNA RNA的相互作用。同时,还讨论一些控制转基因沉默现象的策略,特别是MAR在转基因植物中具有增强基因表达和减少株间差异的作用。     

苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因克隆及油菜叶绿体遗传转化研究

向细胞核导入外源基因的核转化技术是植物基因工程的主要方法。然而,外源基因表达效率低,表达不稳定,基因易失活和因随机插入而造成的位置效应等是该方法不足之处。而且,由于外源基因可随花粉扩散,细胞核转化体的生物安全性问题已在全球范围内引起世人的关注和担忧。将外源基因导入叶绿体基因组有望克服细胞核转化中存在的某些弊端。油菜作为世界上重要的油料作物,其叶绿体遗传转化研究还未见报道。本研究从苏云金芽孢杆菌克隆得到野生型杀虫晶体蛋白基因,构建了用于油菜叶绿体定点转化的植物表达载体,并用基因枪法将杀虫蛋白基因导入油菜,…     

miRNA在植物响应高温胁迫中的研究进展

microRNA(miRNA)是一类由20-24个核苷酸组成的小的非编码RNA,通常通过序列互补降解或抑制其靶标基因转录后的翻译过程,从而在转录后水平上调控基因的表达。miRNA在植物基因组中普遍存在,作为一类重要的调节因子参与到植物的生长发育与逆境响应中。目前,已有研究表明高温除了诱导植物编码基因表达发生改变之外,一些非编码RNA的表达也发生了显著改变,其中miRNA作为重要的非编码RNA,参与了植物的高温胁迫响应。对植物miRNA的合成途径,作用机制以及主要功能进行了扼要阐述,重点阐述了高温胁迫下植物miRNA的作用机制,旨在为mi RNA在植物抵抗高温胁迫中的研究与应用提供新的思路。     

小鼠肌肉生长抑制素基因短发夹RNA促进MyoD在C2C12细胞中的表达

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)属于转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族,主要功能为负向调节骨骼肌的生长.肌肉生长抑制素基因敲除小鼠肌肉出现显著增加,而将干涉该基因的短发夹RNA注射并电击转化入大鼠胫前肌则引起肌肉重量、肌纤维以及MHCⅡ表达的增加.通过与小鼠肌肉生长抑制素基因表达载体共转染HEK293细胞,筛选到两条能够高效抑制小鼠肌肉生长抑制素基因表达的小干涉RNA.构建了这两条小RNA的表达载体Mst-shRNA1和Mst-shRNA2,用其分别转染小鼠C2C12成肌细胞,并通过G418药物筛选和流式细胞仪富集整合了短发夹RNA表达载体的阳性细胞.通过采用Real-time PCR和Western blot分析,检测到在分别整合了Mst-shRNA1和Mst-shRNA2的C2C12细胞中,内源性肌肉生长抑制素基因的mRNA水平分别下降了10.2%和35.5%,蛋白质表达则分别下降了29.3%和64.7%.同时,在这两组中MyoD的表达上升了24.4%和40.4%,证明通过RNA干涉实现的肌肉生长抑制素基因的抑制导致了下游MyoD基...     

无载体主干序列的bar和cecropin B 基因表达框共转化水稻

基因枪等直接转化法可将去除质粒载体主干序列的外源基因表达框导入植物基因组,消除质粒主干序列对植物基因组的影响,同时由于转基因分子较小,比较容易实现多个基因的共转化,在植物基因工程育种上有重要的应用价值,研究了基因枪介导外源基因表达框（包括启动子、基因开放阅读框和终止子）转化水稻的影响因素和转基因的整合模式,结果表明：（1）基因枪介导外源基因表达框转化水稻的频率约在0.1%～0.5%之间,非选择标准基因与选择标记基因的共转化频率约为50%～60%,增加基因表达框DNA浓度可提高转化率。相同基因构建物对不同品质水稻的转化率不同,基因构建物的侧边序列对基因枪转化的品种差异可能具有重要影响。（2）非选择标记基因cecropin B表达框在水稻基因组内整合模式简单,仅有1～3个拷贝;筛选标记基因bar表达框却比完整质粒转化后的整合模式复杂得多,插入拷贝数在4～14个之间,线形基因表达框的游离DNA末端和CaMV 35S启动中子重组热点介导的转基因重组可能是导致bar基因表达框复杂整合的重要原因。     

植物根特异性基因表达研究

植物根中基因表达的调控近几年渐始受到注意,一些分离自植物病原的外源基因启动子能在植物根中特异性地启动编码基因表达,部分植物基因组基因查明存在根特异表达调控元件和反式作用因子,已分离和克隆了部分未知功能的根特异性表达基因。     

EV71抗原双元植物表达载体构建及生菜瞬时表达

[目的]构建EV71 P1和3CD基因的双元植物表达载体,通过农杆菌注射渗透法实现在生菜叶片中的瞬时共表达。[方法]根据Gen Bank序列,设计合成EV71 C4亚型P1和3CD基因,分步克隆入植物表达载体p CAMBIA2301,并转化农杆菌LBA4404。农杆菌注射渗透法对意大利生菜叶片进行遗传转化,固相酶联斑点实验和免疫印迹实验检测感染叶片总蛋白提取物,分析外源基因表达效果。[结果]限制酶切验证获得共表达植物表达载体p CAMBIA2301-P1-3CD。感染叶片的外源基因表达产物中具有抗VP1抗体结合活性的蛋白,其分子量约39 k Da。[结论]成功构建EV71 3CD和P1基因双元植物表达载体,其在意大利生菜叶片中的表达产物具有免疫反应性。为利用植物生物反应器生产抗EV71口服疫苗提供了理论和实验依据。     

RNA:诱导基因沉默

在生物体中,双链RNA(double-strand RNA,dsRNA)裂解后的小RNA可以诱导细胞质和基因组水平外源基因沉默。所谓基因沉默(gene silencing)是指生物体中特定基因由于种种原因不表达。小RNA能诱导互补信使RNA在转录后降解。RNA沉默是基因组水平的免疫现象,代表了进化过程中原始的基因组对抗外源基因序列表达的保护机制,在动植物进化中起着重要作用,RNA沉默具有抵抗病毒入侵、抑制转座子活动等作用,并调控蛋白编码基因的表达,具有十分诱人的应用前景。     

miRNAs的表达调控机制

microRNAs(miRNAs)是一类在转录后基因调控中发挥功能的非编码小RNAs,在发育、生长和分化等过程中发挥重要作用.至今已经在动物、植物和微生物等不同生物体中鉴定出来数千种miRNAs. miRNAs可以通过降解mRNA或抑制蛋白翻译的方式调节特异基因表达.生物体内约30%的基因都受miRNAs的调节.miRNAs的表达与功能受到转录因子、表观遗传学、多核苷酸多态性及其RNA编辑等多种因素的调节.此外,特异miRNA基因敲除的成功为研究miRNAs功能提供了有力的实验模型.     

植物抗虫研究取得重要突破

中科院上海生命科学研究院植物生理生态研究所最近在植物抗虫与生物技术领域的研究工作取得突破性进展。该所研究员、中国科学院院士陈晓亚和他的博士研究生毛颖波发明了一种植物介导的昆虫RNA干扰技术,可以有效、特异地抑制昆虫基因的表达,从而抑制害虫的生长。该技术利用植物表达与昆虫特定基因匹配的双链RNA分子,当昆虫取食这类植物后,其靶基因的表达被明显降低。     

植物基因工程在医药中的应用

自70年代末发现植物天然遗传转化系统,植物的基因工程技术迅速建立和发展起来,并在植物基因分离、植物表达载体的构建及遗传转化、外源基因表达的检测等方面取得突破性进展。植物表达系统又具有高效表达、安全可靠、来源广和成本低等优点,因此在近年来植物基因工程技术被用于多肽药物和疫苗的研制,并取得可喜的成果。